NOTIFICACIÓN SOBRE ACTIVIDADES DE UTILIZACIÓN CONFINADA DE ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE

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1 MINISTERIO DE AGRICULTURA, ALIMENTACIÓN Y MEDIO AMBIENTE PARTE A Tipos 2, 3 y 4 DIRECCION GENERAL DE CALIDAD Y EVALUACION AMBIENTAL Y MEDIO NATURAL COMISIÓN NACIONAL DE BIOSEGURIDAD NOTIFICACIÓN SOBRE ACTIVIDADES DE UTILIZACIÓN CONFINADA DE ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE Nº de Registro: Nº de Notificción: I. INFORMACIÓN GENERAL 1) Responsbles de l ctividd ) Entidd Nombre: UNIVERSIDAD DE NAVARRA Dirección postl: Cmpus Universitrio s/n, Pmplon (Nvrr) b) Representnte legl de l entidd Nombre y pellidos: Isidro Abd Gosálbez NIF: W Crgo: Gerente Tel: Fx: Correo electrónico: ibd@unv.es c) Responsble científico de l ctividd Nombre y pellidos: Igncio Moriyón Urí NIF: A Crgo: Ctedrático Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: imoriyon@unv.es Nombre y pellidos: Mite Irirte Cilveti NIF: P Crgo: Profesor Titulr Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: mirirt@unv.es Nombre y pellidos: Rquel Conde-Alvrez NIF: X PLAZA DE SAN JUAN DE LA CRUZ, S/N MADRID TEL.: FAX.:

2 Crgo: Profesor Contrtdo Doctor Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: Nombre y pellidos: Ami Zúñig-Rip NIF: R Crgo: Investigdor Dpto Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: zunig@unv.es d) Responsble de bioseguridd de l instlción donde se relizrá l ctividd Nombre y pellidos: Rfel Aldbe Arregui NIF: D Crgo: Responsble bioseguridd Lbortorio P3 CIMA Tel: Fx: Correo electrónico: rldbe@unv.es e) Indicr cuál de los nteriores cturá como person de contcto Nombre y pellidos: Mite Irirte Cilveti NIF: P Crgo: Profesor Titulr Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: mirirt@unv.es 2) Debe señlrse si pr l ejecución de est ctividd se recibe finncición del Pln Esttl de Investigción Científic y Técnic y de Innovción. Est informción es necesri pr determinr si l ctividd se encuentr dentro del supuesto del rtículo 3.2.b) de l Ley 9/2003 y, por lo tnto, l competenci rece en l Administrción Generl del Estdo. SI X NO 3) Instlción donde se v desrrollr l ctividd de utilizción confind (cumplimente si previmente h sido comunicd/utorizd pr este tipo de ctividdes; en cso contrrio, cumplimente el Formulrio Prte B). ) Fech de comunicción / utorizción de l instlción: 24 junio 2011 b) Número de referenci del expediente: A/ES/05/I-09 2

3 II. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD: 1) Finlidd de l ctividd: Obtención de vcuns frente l brucelosis 2) Clsificción de l ctividd Pr l clsificción del tipo de riesgo de ls operciones se seguirá el procedimiento estblecido conforme l rtículo 4 y el nexo III de l Directiv 2009/41/CE del Prlmento Europeo y del Consejo, de 6 de myo, reltiv l utilizción confind de microorgnismos modificdos genéticmente, y l Decisión de l Comisión 2000/608/CE, de 27 de septiembre, reltiv ls Nots de orientción pr l evlución del riesgo. Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Tipo 4 X PROCESO GENERAL PARA LA OBTENCIÓN DE UN OMG A EFECTOS DE NOMENCLATURA: 3

4 Gen(es) o culquier secuenci de DNA o RNA obtenido del ORGANISMO DONANTE medinte técnics de extrcción, mplificción o síntesis. Puede proceder del mismo ORGANISMO RECEPTOR y hber sido modificdo; por ejemplo, interrumpido o modificdo pr utilizrlo en mutgénesis o silencición. VECTOR (virus, plásmido o de culquier otr nturlez). Puede hberse obtenido de céluls de mmífero, insecto, plnt, bcteri, sin que ésts se consideren el orgnismo donnte. Culquier técnic pr l introducción de DNA en el orgnismo receptor: recombinción por vectores, mcroinyección, microinyección, blístic Modificción genétic ORGANISMO MODIFICADO GENÉTICAMENTE Orgnismo cuyo mteril genético h sido modificdo de lgun mner que no se produce nturlmente en el premiento ni en l recombinción nturl ORGANISMO RECEPTOR Orgnismo que sufre l modificción genétic III. INFORMACIÓN SOBRE EL ORGANISMO RECEPTOR DEL CUAL SE DERIVA EL OMG 1) Nombre científico: Brucell suis, Txonomí: Género Brucell; fmili Brucellcee Nombre común: Brucel suis, 2) Descripción de los métodos de identificción y islmiento. ) Técnics de islmiento: 4

5 Ls ceps de B. suis, se conservn liofilizds en doble mpoll, bien -80ºC en crioviles con crioprotectores (glicerol, leche descremd o suero fetl-dmso), en un congeldor situdo en un zon P3. Se ísln en plcs de medio de cultivo rico (Luri- Bertni Broth, Blood Agr Bse, o tryptics soj) que se incub 37ºC durnte 2-5 dís. b) Técnics de identificción: Identificción convencionl: Ures, oxids, glutinción con criflvin, tinción con cristl violet-oxlto, glutinción con sueros monoespecíficos nti-a y nti-m, sensibilidd colorntes (tionin, fucsin y sfrnin), ntibióticos (penicilin, estreptomicin y polimixin B) y los fgos Tb, Wb, Iz y R/C. Identificción moleculr: PCR específic c) Mrcdores genéticos: Presenci de l secuenci IS711 o secuencis específics de especie d) Mrcdores fenotípicos: Aglutinción con ntisueros específicos. e) Estbilidd genétic: Estbles (usenci de plásmidos u otros elementos genéticos intercmbibles con otrs bcteris, o entre ls propis brucels). 3) Posibles modificciones genétics nteriores: Sin modificciones genétics previs 4) Se consider ptógeno el orgnismo receptor? SI X NO 5) En cso firmtivo, especificr pr qué clse de los orgnismos (seres humnos, nimles, plnts) se consider ptógeno este orgnismo, vivo o muerto, y/o sus productos extrcelulres: Los microrgnismos vivos pueden ser ptógenos pr seres humnos y nimles. 6) Si el orgnismo receptor es ptógeno pr los seres humnos, especificr el grupo de riesgo signdo de cuerdo con l legislción comunitri existente, (en prticulr l Directiv 2000/54/CE) o según otros sistems de clsificción, ncionles o interncionles (OMS, NIH, etc.): Brucell suis, (orgnismo receptor) está clsificd como ptógeno tipo 3. ) De que modo se mnifiest l ptogenicidd? 5

6 En humnos: fiebre, rtromilgi, fibromilgi y otros síntoms no específicos En nimles (principlmente rumintes): borto y esterilidd. b) En el cso de ceps no virulents de especies ptógens: es posible excluir l reversión l ptogenicidd? SI X NO Porqué: l bcteri no posee mecnismos de intercmbio genético. 7) L cep/líne celulr receptor: está libre de gentes biológicos contminntes? Si 8) Experienci dquirid en relción con l seguridd en l utilizción del orgnismo receptor: Ls persons que interviene en el proyecto llevn trbjndo con distints especies del género Brucell desde hce décds, sin hber tenido ccidente lguno y están fmilirizds con todos los spectos reltivos l bioseguridd del ptógeno. 9) Informción sobre l cpcidd de supervivenci y de reproducción en el medio mbiente: ) El orgnismo receptor es cpz de sobrevivir fuer de ls condiciones de cultivo?: Brucell suis no se multiplic fuer de sus huéspedes o de ls condiciones de cultivo. Sí es cpz de sobrevivir en el mbiente en determinds condiciones, pero no de form indefinid. En cso firmtivo: b) Cpcidd de crer estructurs de resistenci o letrgo: i) espors ii) endospors iii) quistes iv) esclerocios v) espors sexules (hongos) vi) espors sexules (hongos) vii) otros, especifíquese c) Otros fctores que fectn l cpcidd de supervivenci: Son desfvorbles el clor, l exposición l luz o l sol y l sequedd. d) Posibles nichos ecológicos: Ninguno fuer de los huéspedes nimles nturles. e) Tiempo de generción en ecosistems nturles: 6

7 NO se multiplic en mbientes nturles (prte de sus huéspedes). 10) Efectos posibles sobre el medio mbiente: ) Implicciones en procesos mbientles (p.ej. fijción del nitrógeno o regulción del ph del suelo): Ninguno b) Intercciones con otros orgnismos y efectos sobre éstos: Ninguno 11) Distribución geográfic y tipo de ecosistem en el que se encuentr el orgnismo receptor: Brucell suis se encuentr en rumintes, cmélidos, suidos, lépidos, vris especies de roedores slvjes, pinnípedos y cetáceos en todos los lugres del mundo donde se h investigdo su presenci. 12) Hábitt nturl del orgnismo: El interior de vrios tipos de céluls (mcrófgos, dendrítics, céluls epiteliles y otrs) de sus huéspedes (ver 11). IV. INFORMACIÓN RELATIVA AL ORGANISMO DONANTE 1) Nombre científico: Brucell suis Txonomí: Género Brucell; fmili Brucellcee Nombre común: Brucell suis 2) Tipo de mteril genético obtenido del orgnismo donnte: Pr cd construcción se obtuvo uno de los siguientes genes: Construcción 1. Pr l construcción de un mutnte en el gena El gena con un deleción de l región intern mplificd por PCR prtir del genom de B. suis. (Tmbién llmd ORF o gena mutdo) Construcción 2. Pr l construcción de un mutnte en el gene El gene con un deleción de l región intern mplificd por PCR prtir del genom de B. suis. (Tmbién llmd ORF o gene mutdo) Construcción 3. Pr l construcción de un mutnte en el geni El geni con un deleción de l región intern mplificd por PCR prtir del genom de B. suis. (Tmbién llmd ORF o geni mutdo) 3) Método de obtención: ) Extrcción b) PCR X 7

8 c) Síntesis in vitro 4) Función del gen/genes en el orgnismo donnte Se detll l función de los genes modificdos en ls distints construcciones: Construcción 1 El gena originl codific un enzim implicdo en l síntesis de componentes de membrn de Brucell Construcción 2 El gene originl codific un enzim implicdo en l síntesis de componentes de membrn de Brucell Construcción 3 El geni originl codific un enzim implicdo en l síntesis de componentes de membrn de Brucell 5) Es ptógeno o nocivo de culquier otr form (incluidos sus productos extrcelulres) el orgnismo donnte, vivo o muerto? SI X NO ) En cso firmtivo, especificr pr que orgnismos: i) seres humnos X ii) nimles X iii) plnts b) De que modo se mnifiest l ptogenicidd? En humnos: fiebre, rtromilgi, fibromilgi y otros síntoms no específicos. En nimles (principlmente rumintes): borto y esterilidd c) Ls secuencis insertds: están implicds de lgun form en ls propieddes ptógens o nocivs del orgnismo? No 5) Intercmbin los orgnismos donnte y receptor mteril genético de form nturl? NO V. INFORMACIÓN RELATIVA A LA MODIFICACIÓN GENÉTICA 1) Tipo de modificción genétic: ) Inserción de mteril genético X b) Deleción de mteril genético X c) Sustitución de bses 8

9 d) Fusión celulr e) Otros, especifíquese 2) Finlidd de l modificción genétic: Se señl l finlidd de cd un de ls construcciones: Construcciones donde se modificn los genes gena, gene, geni Construir un mutnte defectuoso en l síntesis de componentes de membrn de Brucell. Generr tenución o virulenci Mutnte B. suis gena Mutnte B. suis gene Mutnte B. suis geni 3) Método utilizdo pr llevr cbo l modificción genétic: Se seguirá el mismo procedimiento pr tods ls construcciones Not: el gen de interés puede ser gena, o gene o geni: El gen de interés mutdo se clonrá en el vector pjqk. El plásmido derivdo de pjqk en el que se h clondo el gen de interés mutdo se introducirá en Brucell suis por conjugción. El plásmido es suicid y no puede replicrse en Brucell suis. Se producirá l recombinción homólog entre el gen slvje presente en el cromosom y el gen mutdo presente en el plásmido. El resultdo finl de este proceso es l sustitución, en el cromosom de Brucell suis, del gen de interés slvje por el gen de interés mutdo. El orgnismo obtenido tiene un mutción no polr y no llev ningún mrcdor de resistenci ntibiótico dicionl. El plásmido suicid, l no poder replicrse en Brucell suis, se extingue. Pr más informción ver l referenci: Conde-Alvrez, R., Grillo, M.J., Slcedo, S.P., de Miguel, M.J., Fugier, E., Gorvel, J.P., Moriyón, I. nd M. Irirte Synthesis of phosphtidylcholine, typicl eukryotic phospholipid, is necessry for full virulence of the intrcellulr bcteril prsite Brucell bortus. Cell. Microbiol. 8 : ) Se h utilizdo un vector en el proceso de modificción? SÍ X NO En cso firmtivo:. Tipo e identidd del vector: Se utilizrá el mismo plásmido pr relizr tods ls construcciones Plásmido derivdo del vector pjqk (tmbién llmdo pjqkm) El vector pjqk y sus derivdos son suicids (es decir no pueden replicrse) en Brucell suis, y ello llev l extinción del plásmido. En este vector se clonrá el gen de interés mutdo. 9

10 b. Si se trt de un virus: No procede Es defectivo en replicción SÍ NO c. Aportr mp de restricción del vector (funciones y posición de genes estructurles, genes mrcdores, elementos reguldores, sitios de inserción, origen de replicción, origen, función y secuenci de otros elementos presentes en el vector): Vector pjqk (pjqkm) con los genes y sitios de restricción más significtivos. En el polisitio de clonge (MCS) se clonrá el gen de interés mutdo. Crcterístics más importntes del vector pjqkm y sus derivdos KmR: Gen que confiere resistenci Knmicin. scbr: Gen que confiere l sensibilidd l scros oriv: Origen de replicción (p15 ori de pacyc184). Funcionl sólo en enterobcteris orit: Origen de trnsferenci RP4. Permite l movilizción del plásmido en bcteris Grm negtivs lczα: codific el peptido lf de l bet-glctosids. Permite l identificción de frgmentos clondos trj: codific l protein que se une orit y se requiere pr l trnsferenci del plásmido durnte el proceso de conjugción d. Gm de hospeddores del vector: Enterobcteris e. Crcterístics de l movilidd del vector: i) fctores de movilizción El vector es únicmente movilizble entre un bcteri Grm negtiv previmente trtd y un E. coli especifico que conteng el plásmido, y únicmente en condiciones óptims de incubción (37ºC) ii) Si el vector es un bcteriófgo se hn inctivdo sus propieddes lisogénics? No procede iii) Puede el vector trnsferir mrcdores de resistenci otros orgnismos? Si, pero únicmente en ls condiciones de movilizción descrits rrib 5) Informción del inserto: ) Dimensiones del inserto, mp de restricción y secuenci: Se señl el inserto pr cd un de ls construcciones Construcción 1 10

11 gena con un deleción en l región centrl Construcción 2 gene con un deleción en l región centrl Construcción 3 geni con un deleción en l región centrl b) Origen y función específic de cd prte del inserto: Se señl el inserto pr cd un de ls construcciones Construcción 1. Pr l construcción de un mutnte en gena El inserto contiene el gena con un deleción intern Construcción 2. Pr l construcción de un mutnte en gene El inserto contiene el gene con un deleción intern Construcción 3. Pr l construcción de un mutnte en geni El inserto contiene el geni con un deleción intern c) Descripción del método utilizdo pr l trnsformción: Se seguirá el mismo procedimiento pr tods ls construcciones El plásmido derivdo de pjqk donde se h clondo el gen de interés mutdo se introducirá por trnsformción en l cep de E.coli S17 -pyr (polimixin (PmB) sensible) y se trnsferirá B. suis (PmB R, Knmicin (Km) S) por conjugción. El plásmido derivdo de pjqk no puede replicrse en Brucell y, por lo tnto, el gen mutdo presente en este plásmido se recombinrá con l región correspondiente del cromosom de Brucell suis donde se encuentr el gen slvje. Los exconjugntes donde se produzc l primer recombinción y, por lo tnto, l integrción de todo el plásmido suicid en el cromosom, se seleccionrán sobre plcs de TSA con polimixin y knmicin mntenids 37ºC. Pr fvorecer l segund recombinción, ls bcteris se crecieron 37 ºC, en medio líquido con gitción, pero sin knmicin. Aquells en ls que se produjo l doble recombinción, se seleccionron en TSA con polimixin y scros l 5% y se comprobrá que se vuelven sensibles l knmicin. Pr diferencir los clones en los que l segund recombinción de lugr l recuperción del gen slvje, de quellos en los que se produzc l sustitución del gen slvje por el gen mutdo, se relizrá un PCR con cebdores que flnquen l ORF. En el primer cso (recuperción del gen slvje) el tmño esperdo del frgmento será myor que en el segundo (obtención del mutnte). d) Informción sobre los genes estructurles presentes en el inserto: Construcción 1 El gena con un deleción intern 11

12 Construcción 2 El gene con un deleción intern Construcción 3 El geni con un deleción intern e) Informción sobre los elementos reguldores presentes en el inserto: No hy f) El inserto h sido secuencido completmente? Si g) Contiene secuencis que no son necesris pr l función desed? En cso firmtivo, especifíquese. No h) Contiene secuencis cuy función es desconocid? En cso firmtivo, especifíquese. No 12

13 VI. INFORMACIÓN RELATIVA AL ORGANISMO MODIFICADO GENÉTICAMENTE 1) Estdo y expresión del mteril genético introducido: Común tods ls construcciones ) Es un plásmido libre? NO En cso firmtivo: i) Número de copis: ii) El plásmido recuperdo corresponde l construido? b) Está integrdo en los cromosoms nucleres? SI. Al introducir el mteril genético se produce l sustitución del gen originl presente en el cromosom bcterino por el gen mutdo. Este gen mutdo es inctivo. En cso firmtivo: i) número de copis: 1 ii) loclizción cromosómic: el gen mutdo se loclizd en l mism zon del cromosom donde estb el gen originl l que h sustituido iii) secuencis colindntes Ls misms que en el orgnismo originl iv) L inserción ctiv o inctiv l expresión de otros genes?: L inserción inctiv únicmente el gen que se quiere mutr. El mutnte construido es NO polr y por l tnto l expresión de otros genes NO se ve lterd. c) Si se trt de un virus: No procede i) L inserción es específic ii) L inserción se produce l zr iii) Existe l posibilidd de formción de prtículs vírics d) Análisis moleculres relizdos reltivos l expresión del producto desedo (PCR, Northern, secuencición, otros): PCR con oligonucleótidos específicos que hibridn en mbos extremos del gen de interés i) Determinción de l estructur del inserto (secuencición) X ii) iii) Trnscripcionles (nivel de síntesis de mrna) Trduccionles (nivel de síntesis de proteíns) Aportr tod l documentción l respecto. No procede 2) Crcterístics genétics y fenotípics modificds del orgnismo receptor como resultdo de l mnipulción genétic: ) Es diferente el OMG del receptor en lo que respect l cpcidd de supervivenci fuer de ls condiciones de cultivo? En cso firmtivo, especifíquese Se estudirá cundo se obteng el OMG b) Es diferente el OMG del receptor en lo que respect l modo o ts de reproducción? En cso firmtivo, especifíquese: 13

14 Se estudirá cundo se obteng el OMG c) Es diferente el OMG del receptor en lo que respect l ptogenicidd pr el hombre, plnts o nimles? En cso firmtivo, especificr: L membrn de Brucell es un fctor clve pr su virulenci. Se esper que un mutción en un gen implicdo en l síntesis de componentes de membrn disminuy l virulenci (es decir se esper que l OMG resultnte esté más tenud que l cep originl d) Es diferente el OMG del receptor en lo que respect los posibles efectos sobre el medio mbiente? En cso firmtivo, especifíquese: Se estudirá cundo se obteng el OMG e) Es diferente el OMG en cunto ls crcterístics nutricionles? En cso firmtivo, especifíquese: Se estudirá cundo se obteng el OMG f) Mrcdores específicos del OMG: El OMG no posee ningún mrcdor específico que lo diferenci de l cep originl 3) Estbilidd genétic del OMG (Estdo y secuenci del inserto después de un cierto número de generciones) El OMG es estble indefinidmente 4) Posibilidd de trnsferenci de mteril genético otros orgnismos: No existe 5) Descripción de métodos de identificción y islmiento empledos. ) Técnics utilizds pr l identificción del OMG. El OMG se puede diferencir de l cep prentl medinte un rección de PCR emplendo dos oligonucleótidos que hibriden uno con l región situd ntes del codon de inicición del gen de interés y otro con l región situd inmeditmente después del codon stop de dicho gen. El tmño del frgmento PCR obtenido será myor en el cso de l cep prentl que en el cso del OMG b) Técnics empleds pr islr el OMG en el medio mbiente. No se v liberr l medio mbiente. 14

15 VII. DESCRIPCIÓN DE LAS OPERACIONES 1) Nturlez de ls operciones: ) Enseñnz b) Investigción X c) Desrrollo 2) Volumen o cntidd de OMG utilizr: ) Volumen máximo en el cso de microorgnismos: Volumen máximo: 10 ml por experimento b) Número de plnts: c) Número de nimles: 3) Periodo previsto pr l ctividd de utilizción confind (Debe concretrse lo más posible l durción de l ctividd (por ejemplo, teniendo en considerción l durción de l finncición de los proyectos los que están socidos ls ctividdes con los OMG)). 5 ños prtir de junio 2015 prorrogble según resultdos Finncición: AGL C4-1-R. Ministerio de Economí y Competitividd 4) Finlidd de l ctividd de utilizción confind, incluidos los resultdos esperdos: Estudio del ppel de los componentes de membrn en l virulenci de Brucell con el objetivo finl de desrrollr nuevs vcuns contr l brucelosis 5) Origen del OMG: indicr si el OMG procede de otro centro o empres (señlr nombre y ubicción), y si es sí, si dicho centro o empres está registrdo conforme l normtiv espñol y/o europe vigente sobre OMG: L OMG se v generr en nuestro lbortorio 6) Informción sobre el trnsporte de los OMG en el cso de que provengn de, o se destinen otros centros o instlciones, sí como descripción de ls medids doptds durnte el mismo en virtud de l legislción plicble 1 (tipo de trnsporte, mnejo y emblje, documentción de compñmiento e identificción o/y etiquetdo). El trnsporte se relizrá con un empres especilizd y siguiendo ls norms de seguridd prevists pr Brucell: Infectious substnces in ctegory A. pcking instructions P620, lbel UN Legislción vigente que fect l trnsporte de OMG: Reglmento (CE) Nº 1946/2003, del Prlmento Europeo y del Consejo, de 15 de julio de 2003, reltivo l movimiento trnsfronterizo de orgnismos modificdos genéticmente. El formulrio necesrio pr compñr los OMG en el trnsporte, puede encontrrse en el siguiente enlce: ( ) Normtiv ncionl e interncionl (OACI/IATA, OMI/MDG, TPF/RID y TPD/ADR) pr el trnsporte de mercncís peligross y, en prticulr, de sustncis infeccioss y muestrs pr dignóstico. 15

16 7) Descripción de los métodos de mnejo de los OMG (incluyendo descripción de ls fses de cultivo y concentrción máxim de OMG en el cultivo): L mnipulción se relizrá en un cmpn de bioseguridd BIO-IIA situd dentro de un lbortorio con biocontención tipo 3 utorizd (A/ES/05/I-09). L mnipulción se relizrá siempre por personl especilizdo y entrendo pr el trbjo con este tipo de microorgnismos. El cultivo se relizrá en 15 ml de medio de cultivo líquido en mtrces de 25 ml (por experimento). Tmbién se relizrán cultivos en medio sólido (plcs de Petri). L concentrción máxim de los cultivos en medio líquidos será de 10 8 ufc/ml. Los procedimientos serán los mismos que y recibieron ls utorizciones A/ES/11/43, A/ES/11/44, A/ES/11/45. 8) Descripción de ls medids de confinmiento y protección que vyn plicrse L mnipulción se relizrá dentro de lbortorio y nimlrio con biocontención tipo 3 utorizd (A/ES/05/I-09). Está dotdo de cmpns de seguridd biológic de clse II, incubdores, centrifug, bño, utoclve, con esterilizción de mbiente por luz UV. Dispone de sistem de presión negtiv y slids de ire con filtros HEPA. Existe un vitrin de extrcción químic, sí como equipos de protección personl, pr l mnipulción de productos químicos Existen protocolos de trbjo conocidos por el personl que form prte del proyecto, protocolos de bioseguridd pr el trbjo con Brucell, sí como protocolo de ctución en cso de ccidente. Existe tmbién un pln de gestión de residuos probdo por el Gobierno de Nvrr. Adicionlmente, el Servicio Mncomundo de Prevención de Riesgos Lborles de l Universidd h relizdo l evlución de riesgos del Deprtmento de Microbiologí de dich Universidd y del lbortorio de nivel de contención 3 de CIMA (A/ES/05/I-09). Los investigdores hn recibido formción e informción sobre los riesgos de sus puestos de trbjo y ls medids preventivs doptr, sí como sobre los plnes de emergenci del centro de trbjo.. Los investigdores hn relizdo los reconocimientos médicos previstos por l ley (rt 22. ley 31/1995) y son ptos pr los trbjos signdos 16

17 VIII.- INFORMACIONES ADICIONALES RELATIVAS A LA UBICACIÓN DE LA INSTALACIÓN 1) Proximidd fuentes de peligro potenciles: No hy ningun fuente de peligro potencil en l proximidd 2) Descripción de ls condiciones climátics predominntes: Condiciones mbientles (tempertur, luz y presión del ire) controlds por un sistem de climtizción propio del Lbortorio P3. 3) Notificción de l instlción: indicr ls secciones donde se desrroll l ctividd objeto de l notificción, con indicciones de l ctegorí de confinmiento previst: Lbortorio P3. Autorizción A/ES/05/I-09 IX. DESCRIPCIÓN DE LAS MEDIDAS DE PROTECCIÓN Y CONTROL ADOPTADAS DURANTE LA UTILIZACIÓN CONFINADA 1) Adopción de ls Buens Práctics de Lbortorio: Se seguirán ls siguientes norms:. mntener l exposición del lugr de trbjo y del medio mbiente culquier orgnismo modificdo genéticmente l nivel más bjo posible en l práctic b. plicr medids de control industril en l fuente y, de ser necesrio, completr ésts con vestiment y equipo personl de protección decudos c. comprobr y mntener de form decud ls medids y equipos de control d. verificr, cundo proced, l presenci de orgnismos de proceso vibles fuer del confinmiento físico primrio e. proporcionr l personl l formción decud f. crer comités y subcomités de seguridd biológic, si es preciso g. formulr y plicr códigos de práctic locles pr l seguridd del personl, según ls necesiddes h. si procede, disponer señles de riesgo biológico i. estblecer instlciones de limpiez y descontminción pr el personl j. llevr los correspondientes registros k. prohibir que se com, beb, fume, se empleen cosméticos o se lmcenen limentos pr el consumo humno en l zon de trbjo l. prohibir pipeter con l boc m. estblecer, si procede, protocolos de trbjo por escrito con el fin de grntizr l seguridd n. tener disposición desinfectntes decudos y procedimientos específicos de desinfección en cso de que orgnismos modificdos genéticmente se hyn esprcido (por ejemplo, duchs lvojos) o. disponer en cso necesrio de un lugr de lmcenmiento de totl seguridd pr equipo y mteriles de lbortorio contmindos 17

18 Previo l inicio del trbjo y nulmente, todos los trbjdores serán citdos por el Servicio de Prevención de Riesgos Lborles de l Universidd de Nvrr pr relizr l vigilnci de l slud. Será preceptiv l ptitud médic pr continur con l ctividd de investigción. Est vigilnci incluirá un serologí convencionl (ros de Bengl y, si es positiv, SAT y Coombs). Los resultdos se conservrán en un Registro en l Secretrí del Depto. y ls muestrs de suero se gurdn en un contenedor específico dentro del congeldor de l Colección de Sueros del Depto. L histori médic lborl de los investigdores se custodi en ls instlciones del Servicio de Prevención. 2) Formción del personl dscrito: Todo el personl h recibido l formción necesri y h seguido el curso de seguridd en el lbortorio imprtido por l Universidd de Nvrr Los prescriptivos según l legislción lborl (dr prte l Servicio de Prevención de Riesgos Lborles de l Universidd de Nvrr). 3) Progrms de limpiez/desinfección/descontminción: Al finlizr el experimento, se deposit el mteril contmindo como punts de pipet, ss de siembr desechbles, plillos y tubos eppendorf, en un bote con desinfectnte (sl de monio cuternrio), en el interior de l cmpn, se cierr con su tp, y después se cierr l cmpn. Cundo el bote llegue ¾ de su cpcidd, se utoclvrá y posteriormente, el líquido se desechrá l instlción de trtmiento de gus ntes de su vertido l red generl. El resto de mteril, como plcs y cldos de cultivo, se depositn directmente en el utoclve del P3 y se mrc con l cint control de utoclvdo. L person que h producido el mteril contmindo, verificrá que éste h sido de hecho utoclvdo ntes del finl de l jornd de trbjo. Este mteril se retirrá, como residuo específico de tipo 3, en contenedor mrillo convenientemente etiquetdo. 4) Progrms de mntenimiento de prtos pr el confinmiento: Revisiones nules de sistem de ventilción y cbins de seguridd biológic. L eficci de los utoclves se verific medinte el uso en cd crg de indicdores químicos de esterilizción (Thermlog), y mensulmente medinte indicdores biológicos. Ver operciones en nexo IV. 5) Progrms de inspección y control del confinmiento: Los lbortorios son inspecciondos regulrmente por el Servicio de prevención de Riesgos lborles que control el seguimiento de ls norms de seguridd X.- GESTION E INACTIVACIÓN DE RESIDUOS 1) Encrgdo de l gestión de residuos: gestión intern: SÍ NO gestión por un empres extern: SÍ X NO 18

19 Si es el cso, nombre de l empres extern encrgd de l gestión de los residuos: CONSENUR 2) Inctivción de residuos: método, form finl, destino de cd uno de los tipos de residuos generdos Todos los residuos líquidos generdos son inctivdos con hipoclorito sódico diluido y/o utoclvdos. L instlción dispone de un sistem de trtmiento de gus residules ntes del vertido l colector generl. Los residuos sólidos sí como todo el mteril que h estdo en contcto con los microorgnismos son utoclvdos y elimindos en contenedores cerrdos. Un vez fuer de l instlción, son trslddos un lmcén debidmente señlizdo, en esper de ser recogidos por l empres gestor de residuos. L empres gestor es CONSENUR. XI. PREVENCIÓN DE ACCIDENTES (Cumplimentr pr los tipos 2, 3 y 4) 1) Condiciones en ls que podrí producirse un ccidente: Rotur de tubos 2) Equipmiento de seguridd (especifíquese): Equipo completo de protección personl. Pr trbjo en P3: Monos, mscrill, gfs de protección, guntes etc 3) Descripción de l informción suministrd los trbjdores: Los trbjdores disponen de l Hoj de Seguridd de Brucell elbord en el deprtmento de Microbiologí de l Universidd de Nvrr. Este protocolo se llev utilizndo durnte más de 40 ños sin dr lugr ningun incidenci. 4) Plnes de emergenci: El Edificio donde está situdo el lbortorio de contención 3 dispone de Pln de Emergenci de Autoprotección, nulmente se relizn simulcros de evcución. Están nombrdos Equipos de Primer Intervención, sus integrntes hn recibido un formción específic cerc de ls norms tender en cso de producirse un emergenci y un formción práctic sobre el uso de los medios de extinción. Principles riesgos en el lbortorio: Aerosoles (riesgo más importnte), trs producirse un derrme o un ml prxis. Cortes y punciones en el mnejo de gujs. Ante derrmes derivdos de l ctividd se tomrán ls siguientes medids 19

20 Retirr del áre l resto del personl e impedir el cceso l áre. Avisr (por orden): l Responsble de Seguridd (Dr. I.Moriyón) (si es necesrio l propio domicilio). uno de los Doctores del Deprtmento (si es necesrio l propio domicilio). En l limpiez y desinfección de derrmes se deben seguir ls siguientes norms: 1. Colocr el equipo completo de protección personl: Guntes de nitrilo, gfs de protección y mscrill FFP3. 2. Accidentes menores (tubos o mtrces con menos de 100 ml de cldo, plcs con cultivo): Cubrir los derrmes con el desinfectnte bsorbente que hy en el locl. Dejr ctur durnte 30 minutos ntes de limpir. Desechr el ppel y restos en un bols de utoclve y utoclvrl. Retirr en contenedor mrillo de residuos específicos 3. Accidentes en el incubdor (rotur de vidrios o cíd de tpones). Detener l ventilción y el giro del rcón. Encender l luz UV (20 min). Preprr un vso de precipitdos con 50 ml de formldehído. Apgr l luz UV. Introducir el vso en el rcón y cerrrlo. Dejr que ctúe el vpor del formldehído durnte 24 h. Abrir el incubdor y dejr ventilr el locl que será precintdo. Posteriormente, limpir el incubdor. L mnipulción del formldehído se relizrá con máscr con filtro específico pr este producto químico, guntes de nitrilo y gfs de protección. En el cso de ccidente por inhlción, contcto, punción o corte: Exposición oculr erosoles o slpicdurs: Lvr l menos 15 minutos con gu. Acudir l Urgencis pr vlorción y trtmiento. Exposición por gujs o mteril punznte. Lvr cuiddosmente l zon herid con gu corriente, sin restregr. Dejr mnr l sngre durnte 2-3 minutos (inducir el sngrdo). Desinfectr l herid con povidon yodd (u otro desinfectnte). Cubrir l herid con un pósito impermeble. Acudir l Urgencis pr vlorción y trtmiento. Inmunoprofilxis y profilxis ntibiótic: 20

21 * No existen vcuns humns fibles. * De form inmedit, nte l sospech de infección ccidentl en el lbortorio, relizr un trtmiento profiláctico con doxiciclin dosis norml durnte 7 dís. Trtmiento: * Estreptomicin (15 dís) combind con doxiciclin (45 dís). * En csos en los que se sospech infección por l cep B. melitensis Rev1, se sustituye l estreptomicin por rifmpicin, lo mismo que en embrzds. 21

22 MINISTERIO DE AGRICULTURA, ALIMENTACIÓN Y MEDIO AMBIENTE PARTE C DIRECCION GENERAL DE CALIDAD Y EVALUACION AMBIENTAL Y MEDIO NATURAL COMISIÓN NACIONAL DE BIOSEGURIDAD EVALUACIÓN DE RIESGO DE ACTIVIDADES DE UTILIZACIÓN CONFINADA DE ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE Nº de Registro: Nº de Notificción: Cumplimentr un formulrio tipo C por cd ctividd tipo 2, 3 o 4. En cso de ctividdes tipo 1, deben seguirse ls instrucciones recogids en el prtdo III.1. de l Guí pr l remisión de solicitudes de registro de instlciones. I. RESPONSABLES DE LA ACTIVIDAD 1) Entidd Nombre: UNIVERSIDAD DE NAVARRA Dirección postl: Cmpus Universitrio s/n, Pmplon (Nvrr) 2) Representnte legl de l entidd Nombre y pellidos: Isidro Abd Gosálbez NIF: W Crgo: Gerente Tel: Fx: Correo electrónico: ibd@unv.es 3) Responsble científico de l ctividd Nombre y pellidos: Igncio Moriyón Urí NIF: A Crgo: Ctedrático Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: imoriyon@unv.es Nombre y pellidos: Mite Irirte Cilveti NIF: P Crgo: Profesor Titulr Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: mirirt@unv.es Nombre y pellidos: Ami Zúñig-Rip NIF: R PLAZA DE SAN JUAN DE LA CRUZ, S/N MADRID TEL.: FAX.:

23 Crgo: Investigdor Dpto Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: Nombre y pellidos: Rquel Conde-Alvrez NIF: X Crgo: Profesor Contrtdo Doctor Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: rconde@unv.es 4) Responsble de bioseguridd de l instlción donde se relizrá l ctividd Nombre y pellidos: Rfel Aldbe Arregui NIF: D Crgo: Responsble bioseguridd Lbortorio P3 CIMA Tel: Fx: Correo electrónico: rldbe@unv.es 5) Indicr cuál de los nteriores cturá como person de contcto Nombre y pellidos: Mite Irirte Cilveti NIF: P Crgo: Profesor Titulr Microbiologí: Universidd de Nvrr Tel: Fx: Correo electrónico: mirirt@unv.es II. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD. 1. Objetivo de l ctividd: Obtención de vcuns frente l brucelosis 2. Durción previst de l ctividd: Debe concretrse lo más posible l durción de l ctividd (por ejemplo, teniendo en considerción l durción de l finncición de los proyectos los que están socidos ls ctividdes con los OMG). 5 ños prtir de junio 2015 prorrogble según resultdos Finncición: AGL C4-1-R. Ministerio de Economí y Competitividd III. EVALUACIÓN DE RIESGO Pr llevr cbo dich evlución se tendrá en cuent el procedimiento estblecido en el Anexo III de l Directiv 2009/41/CE del Prlmento Europeo y del Consejo, de 6 de myo, reltiv l utilizción confind de microorgnismos modificdos genéticmente y l Decisión de l Comisión 2000/608/CE, de 27 de septiembre, reltiv ls nots de orientción pr l evlución de riesgo. 1. Identificción de ls propieddes nocivs del OMG, en función de ls crcterístics del: Desrrollr con l extensión que proced, siguiendo el orden propuesto. 2 Ministerio de Agricultur,

24 ) Orgnismo receptor. Brucell suis. Más informción en Prte A b) Orgnismo donnte. Brucell suis. Más informción en Prte A c) Inserto. Construcción 1. Pr l construcción de un mutnte en gena El inserto contiene el gena con un deleción intern Construcción 2. Pr l construcción de un mutnte en gene El inserto contiene el gene con un deleción intern Construcción 3. Pr l construcción de un mutnte en geni El inserto contiene el geni con un deleción intern d) Vector. pjqk e) Orgnismo modificdo genéticmente resultnte. Mutnte B. suis gena Mutnte B. suis gene Mutnte B. suis geni f) Efectos pr l slud humn y l snidd niml y vegetl. Los mismos que el orgnismos receptor. Se confirmrá cundo se dispong del OMG g) Efectos pr el medio mbiente. Ninguno 2. Clsificción inicil del orgnismo modificdo genéticmente: Pr estblecer est primer vlorción se tendrá en cuent lo dispuesto en el rtículo 4 de l Directiv 2009/41/CE y, en cso de ser plicble, otros sistems de clsificción ncionles e interncionles existentes (por ejemplo, l Directiv 2000/54/CE sobre protección de los trbjdores contr los riesgos relciondos con l exposición gentes biológicos durnte el trbjo). Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Tipo 4 X 3. Probbilidd de que se produzcn efectos nocivos y grvedd de los mismos, en función de: Desrrollr con l extensión que proced, siguiendo el orden propuesto. 3 Ministerio de Agricultur,

25 ) Crcterístics de l/s ctividd/es (medids de confinmiento y control, y exposición humn y mbientl). L mnipulción se relizrá dentro de lbortorio y nimlrio con biocontención tipo 3 utorizd (A/ES/05/I-09). Está dotdo de cmpns de seguridd biológic de clse II, incubdores, centrifug, bño, utoclve, con esterilizción de mbiente por luz UV. Dispone de sistem de presión negtiv y slids de ire con filtros HEPA. Existe un vitrin de extrcción químic, sí como equipo de protección personl, pr l mnipulción de productos químicos Existen protocolos de trbjo conocidos por el personl que form prte del proyecto, protocolos de bioseguridd pr el trbjo con Brucell, sí como protocolo de ctución en cso de ccidente. Existe tmbién un pln de gestión de residuos probdo por el Gobierno de Nvrr. Adicionlmente, El Servicio Mncomundo de Prevención de Riesgos Lborles de l Universidd h relizdo l evlución de riesgos del Deprtmento de Microbiologí de dich Universidd y del lbortorio de nivel de contención 3 de CIMA (A/ES/05/I-09). Los investigdores hn recibido formción e informción sobre los riesgos de sus puestos de trbjo y ls medids preventivs doptr, sí como sobre los plnes de emergenci del centro de trbjo. Los investigdores hn relizdo los reconocimientos médicos previstos por l ley (rt 22. De l ley 31/1995) y son ptos pr los trbjos signdos b) Concentrción y escl utilizds. El proceso se relizrá escl experimentl, Máximo 10 ml por cultivo c) Condiciones de cultivo (se tendrá en cuent el entorno potencilmente expuesto, l presenci de especies susceptibles, supervivenci del OMG y efectos sobre el entorno físico). Los cultivos se relizrán en cbins de flujo lminr tipo Bio-IIA, dentro de un lbortorio P3 y teniendo en cuent ls medids preventivs necesris en l relizción de culquier operción en este tipo de lbortorios. El lmcenmiento se hrá teniendo en cuent ls medids de confinmiento propids. Por todo ello, no es previsible que los cultivos de OMGs produzcn efectos nocivos ni se liberen l entorno. 4. Determinción de l clsificción y medids de confinmiento definitivs y confirmción de su idoneidd: Nivel de riesgo 3. El grdo 3 de confinmiento es suficiente pr proteger l slud humn o niml y el medio mbiente. Lbortorio P3. Autorizción A/ES/05/I Determinción del riesgo en el cso de que se produzc un liberción ccidentl: Desrrollr con l extensión que proced, siguiendo el orden propuesto. 4 Ministerio de Agricultur,

26 No es previsible que los OMG s objeto de estudio produzcn efectos nocivos en l slud humn o niml, ni sobre el medio mbiente, dds ls condiciones de mnipulción de los mismos y ls condiciones de confinmiento ls que son sometidos en ls instlciones. L mnipulción del OMG s se relizrá en un cmpn de bioseguridd situd dentro de un lbortorio con biocontención tipo 3, cmpn de flujo lminr verticl 30/70. L mnipulción se relizrá siempre por personl especilizdo, utorizdo y entrendo pr el trbjo con este tipo de microorgnismos. Es obligtorio el cmbio de rop de trbjo de modo que el investigdor se colocrá un buzo desechble, clzs, gfs de seguridd, guntes de nitrilo y mscrill P3 l entrr este lbortorio. L sl cuent con un utoclve, un sistem de descontminción medinte prformldehído (en delnte SAS) y un equipo portátil de descontminción medinte peróxido de hidrógeno. Existe un protocolo de gestión de residuos: los líquidos son trtdos en un estción de trtmiento de gus ntes de ser vertidos en el colector generl, los sólidos son utoclvdos ntes de su eliminción en contenedores cerrdos y como residuos biopeligrosos. L empres gestor es CONSENUR. Servicios uxilires: sistem de trtmiento de residuos sólidos y líquidos. Existe un procedimiento de ctución pr el cso de que se produzc un derrme de mteril biológico. Ver punto Informción dicionl reltiv l ubicción de l instlción (proximidd fuentes de peligro potenciles, condiciones climátics predominntes, etc.) El lbortorio de contención de nivel 3 está loclizdos en l plnt sótno del edificio CIMA. L instlción no se encuentr próxim fuentes de peligro potenciles y el lbortorio está ubicdo en zons con tempertur regulble, climtizd y dotd de sistem de eliminción de ire con control microbiológico medinte filtros HEPA del 99,9%. Ls posibiliddes de un liberción ccidentl son mínims debido los equipos y sistems empledos en l mnipulción del microorgnismo y los protocolos estblecidos pr l eliminción de los residuos, que son inctivdos (por utoclvdo, trtmiento en SAS o trtmiento de gus residules) previmente su eliminción. No se estimn peligros derivdos de l ubicción de l instlción Condiciones en ls que podrí producirse un ccidente. El ccidente podrí producirse por rotur de tubos, derrmes ccidentles, pinchzos o cortes con mteril que contuvier el microorgnismo o contcto trvés de mucoss con erosoles que contuviern el microorgnismo. Existe un procedimiento pr l recogid de derrmes. 5 Ministerio de Agricultur,

27 Existe un protocolo, conocido por los investigdores, pr evitr infecciones locles, l herid será trtd con un desinfectnte eficz (povidon yodd, clorhexidrin l 5% u otro en su defecto). Será tendido en el Servicio de Urgenci de l Clínic Universidd de Nvrr y se plicrá el protocolo nte ccidente biológico, como medid preventiv nte un ccidente grve se podrí trtr con ntibióticos l sujeto del ccidente Equipos de seguridd, sistems de lrm y métodos de confinmiento dicionles. Vigilnci de ls instlciones medinte cámr de video vigilnci, teléfono, sistems de lrms y de domótic. El cceso está limitdo l personl que tiene l formción necesri pr trbjr con microorgnismos de nivel 3. Este personl tiene un únic trjet de cceso. Medids de confinmiento: Mnipulción de los microorgnismos en cbins de bioseguridd IIA, (Telstr). Autoclve y SAS. Presión negtiv en cscd. Esclus de entrd y slid de l sl con bloqueo de puerts. Luz ultrviolet. Buzo de trbjo desechble. Guntes de nitrilo. Mscrills respirtoris tipo FFP3. Gfs de protección. Duch y dispositivo pr lvdo oculr. Botiquín de primeros uxilios Plnes de emergenci. El Edificio donde está situdo el lbortorio de contención 3 dispone de Pln de Emergenci de Autoprotección, nulmente se relizn simulcros de evcución. Están nombrdos Equipos de Primer Intervención, sus integrntes hn recibido un formción específic cerc de ls norms tender en cso de producirse un emergenci y un formción práctic sobre el uso de los medios de extinción. Principles riesgos en el lbortorio: Aerosoles (riesgo más importnte), trs producirse un derrme o un ml prxis. Cortes y punciones en el mnejo de gujs. Ante derrmes derivdos de l ctividd se tomrán ls siguientes medids Retirr del áre l resto del personl e impedir el cceso l áre. Avisr (por orden): 6 Ministerio de Agricultur,

28 l Responsble de Seguridd (Dr. I.Moriyón) (si es necesrio l propio domicilio). uno de los Doctores del Deprtmento (si es necesrio l propio domicilio). En l limpiez y desinfección de derrmes se deben seguir ls siguientes norms: 1. Colocr el equipo completo de protección personl: Guntes de nitrilo, gfs de protección y mscrill FFP3. 2. Accidentes menores (tubos o mtrces con menos de 100 ml de cldo, plcs con cultivo): Cubrir los derrmes con el desinfectnte bsorbente que hy en el locl. Dejr ctur durnte 30 minutos ntes de limpir. Desechr el ppel y restos en un bols de utoclve y utoclvrl. Retirr en contenedor mrillo de residuos específicos 3. Accidentes en el incubdor (rotur de vidrios o cíd de tpones). Detener l ventilción y el giro del rcón. Encender l luz UV (20 min). Preprr un vso de precipitdos con 50 ml de formldehído. Apgr l luz UV. Introducir el vso en el rcón y cerrrlo. Dejr que ctúe el vpor del formldehído durnte 24 h. Abrir el incubdor y dejr ventilr el locl que será precintdo. Posteriormente, limpir el incubdor. L mnipulción del formldehído se relizrá con máscr con filtro específico pr este producto químico, guntes de nitrilo y gfs de protección. En el cso de ccidente por inhlción, contcto, punción o corte: Exposición oculr erosoles o slpicdurs: Lvr l menos 15 minutos con gu. Acudir l Urgencis pr vlorción y trtmiento. Exposición por gujs o mteril punznte. Lvr cuiddosmente l zon herid con gu corriente, sin restregr. Dejr mnr l sngre durnte 2-3 minutos (inducir el sngrdo). Desinfectr l herid con povidon yodd (u otro desinfectnte). Cubrir l herid con un pósito impermeble. Acudir l Urgencis pr vlorción y trtmiento. Inmunoprofilxis y profilxis ntibiótic: * No existen vcuns humns fibles. * De form inmedit, nte l sospech de infección ccidentl en el lbortorio, relizr un trtmiento profiláctico con doxiciclin dosis norml durnte 7 dís. 7 Ministerio de Agricultur,

29 Trtmiento: * Estreptomicin (15 dís) combind con doxiciclin (45 dís). * En csos en los que se sospech infección por l cep B. melitensis Rev1, se sustituye l estreptomicin por rifmpicin, lo mismo que en embrzds. 8 Ministerio de Agricultur,