2. Instrumentación. de microscopía óptica

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1 2. Instrumentación de microscopía óptica

2 Lentes Un medio transparente limitado por dos superficies curvas

3 Lentes Diferente curvatura

4 Lentes Diferente curvatura

5 Lentes Diferente curvatura

6 Lentes Diferente índice de refracción

7 Lentes Diferente índice de refracción

8 Lentes Distancia focal: El punto de convergencia de los rayos refractados cuando los rayos incidentes provienen de una fuente tan lejana que pueden considerarse paralelos entre sí. Distancia focal

9 Lentes positivas (convergentes) Enfocan los rayos paralelos en un punto detrás de la lente Biconvexa Plano-convexa Menisco

10 Lentes negativas (cóncavas) Bicóncava Plano-cóncava Menisco

11 Lentes negativas (cóncavas) Divergen los rayos de luz

12 Lentes negativas (cóncavas) Distancia focal F

13 Aberraciones de las lentes ABERRACIÓN: Imperfección de un sistema óptico que produce una imagen defectuosa, deficiente en nitidez o en su semejanza al objeto.

14 Tipos de aberraciones Aberraciones geométricas Aberraciones cromáticas Aberración esférica De posición Astigmatismo De magnitud Coma Distorsión Curvatura de campo

15 Aberración esférica Los rayos que atraviesan la lente cerca de sus extremos convergen en un punto más cercano a la lente que los que cruzan por el centro.

16 Aberración esférica Causas: Daños en el objetivo, grasa de los dedos y restos de aceite de inmersión en la lente frontal del objetivo. Cubreobjetos de espesor o índice de refracción inadecuado. Longitud de tubo incorrecta. Medio de montaje inadecuado. Espesor excesivo de la muestra.

17 Aberración esférica Corrección: Combinación de lentes convergentes y divergentes con aberraciones esféricas opuestas. Insertando diafragmas fijos en el objetivo reduciendo el campo visual a la región central de la imagen.

18 Astigmatismo Las líneas verticales y horizontales se enfocan en dos puntos distintos del eje óptico. Punto de enfoque de las líneas verticales Punto de enfoque de las líneas horizontales Punto objeto

19 Coma Diferentes zonas circulares concéntricas de la lente proporcionan aumentos distintos a una imagen desplazada del eje. Imagen Punto objeto

20 Distorsión La imagen aparece deformada a causa de un incremento o descenso gradual desde el centro hasta el contorno. Las líneas rectas aparecen curvadas. Se produce en lentes a las que se les pone un diafragma. Imagen normal Distorsión de cojín Distorsión de barril

21 Curvatura de campo La lente enfoca una superficie plana del objeto como si fuese esférica. Cuando están enfocados los bordes del objeto no lo está el centro y al revés. El centro y los límites de la imagen se enfocan a distancias distintas.

22 Aberración cromática de posición Los distintos colores o longitudes de onda de la luz se enfocan a diferentes distancias de la lente. La imagen aparece rodeada de anillos con variedad de colores según el enfoque. λ azul < λ verde < λ rojo

23 Aberración cromática de magnitud Los rayos de luz de un determinado color se proyectan con más aumentos que los rayos de luz de otro color.

24 Aberración cromática CORRECCIÓN: Utilizar una fuente de luz monocromática. Introducir un sistema de filtros que solo dejen pasar unas pocas longitudes de onda. Sustituir la lente simple por un doblete de lentes combinando distintos tipos con los índices de refracción y dispersión adecuados.

25 Descripción del microscopio óptico Partes mecánicas: Son las partes y dispositivos que tienen la misión de soportar los componentes ópticos a la vez que facilitan las manipulaciones y el uso del instrumento.

26 Descripción del microscopio óptico Tubo (binocular) Revólver Platina Movimiento (foco) Pie Columna o brazo

27 Descripción del microscopio óptico Objetivo:

28 Descripción del microscopio óptico Objetivo: Es el sistema óptico convergente colocado en el extremo correspondiente al objeto. La lente o conjunto de lentes que se sitúan más cerca de la preparación. Su finalidad es formar una imagen real de ésta que será observada a través de un ocular o recogida en una pantalla.

29 Descripción del microscopio óptico Objetivo: Sus principales características son Aumento Apertura numérica

30 Descripción del microscopio óptico: objetivo Aumento: Aumento total = Aumento objetivo x aumento ocular Generalmente ocular = 10X Por ejemplo, para un objetivo de 100X Aumento total = 100 x 10 = 1000 aumentos

31 Descripción del microscopio óptico: objetivo Aumento: Qué significa un aumento de 1000X? Hay que poner siempre la escala en las imágenes!

32 Descripción del microscopio óptico: objetivo Ángulo de apertura: Es el formado por los rayos extremos que intervienen en la imagen. Objetivo 2α Muestra

33 Descripción del microscopio óptico: objetivo Apertura numérica: Es una medida de la capacidad para recoger la luz y resolver detalles pequeños a una distancia objeto fija. Apertura numérica, A.N. = n x sen α n es el índice de refracción del medio α es el semiángulo de apertura

34 Descripción del microscopio óptico: objetivo Apertura numérica: Expresa el diámetro del haz luminoso que puede recoger el objetivo. Se entiende que cuantos más rayos procedentes del objeto entren en la lente para formar la imagen mejor será la calidad de ésta, así como su definición.

35 Descripción del microscopio óptico: objetivo Apertura numérica: A.N. = n x sen α Se puede aumentar α. Pero llegar al máximo teórico de 90º se ve limitado en la práctica. Se puede aumentar n. Mediante líquidos de inmersión.

36 Descripción del microscopio óptico: objetivo Aumento útil: Es la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto. Hay un mínimo para que se puedan resolver los detalles que está en torno a 500 veces la A.N. Hay un máximo más allá del cual no se obtiene más resolución ni más información y está en torno a 1000 veces la A.N., son aumentos vacíos.

37 Descripción del microscopio óptico: objetivo Poder de resolución: El inverso de la mínima distancia entre dos puntos que todavía se entienden como separados, d. Se define en relación a la A.N. y a λ. d = 0,61λ / A.N.

38 Descripción del microscopio óptico: objetivo Poder de resolución: d = 0,61λ / A.N. Plan-apo (inmersión) 100 X - A.N.=1,40 Luz azul (400 nm) d = 0,61*400/1,40 = 174 nm Luz roja (650 nm) d = 0,61*650/1,40 = 283 nm

39 Descripción del microscopio óptico: objetivo Distancia de trabajo: La distancia entre la lente frontal del objetivo y la muestra cuando ésta está enfocada. Objetivo Distancia de trabajo (WD) Muestra

40 Descripción del microscopio óptico: objetivo Distancia de trabajo elevada: Distancia de trabajo corta: Baja resolución Alta resolución d = 0,61λ / A.N. A.N. = n x sen α

41 Descripción del microscopio óptico: objetivo Tipos de objetivos según las correcciones: Acromáticos: corregida la a. cromática para rojo y azul, y la esférica para verde. Semiapocromáticos (fluorita): corregida la a. cromática y esférica para 2 ó 3 colores. Apocromáticos: corrección cromática y esférica para 4 ó más colores. De campo plano: curvatura de campo muy corregida.

42 Descripción del microscopio óptico: objetivo Tipos de objetivos según las correcciones: A. esférica Acromáticos A. cromática Curv. campo 1 color 2 color no Plan-acromáticos 1 color 2 color sí Fluorita 2 3 colores 2 3 colores no Plan-fluorita 3 4 colores 2 4 colores sí Plan-apocromát. 3 4 colores 4 5 colores sí

43 Descripción del microscopio óptico: objetivo Indicaciones en el exterior de los objetivos: Fabricante Correcciones Aumentos Óptica corregida a infinito Sin cubreobjetos Apertura numérica Distancia de trabajo

44 Descripción del microscopio óptico: objetivo

45 Descripción del microscopio óptico: objetivo

46 Descripción del microscopio óptico Longitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS) tubo

47 Descripción del microscopio óptico Longitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS) La distancia imagen se sitúa en el infinito, es decir, los rayos de luz que salen del objetivo son tan paralelos que parece que la imagen se forme en el infinito. Se coloca estratégicamente una lente de tubo dentro del cuerpo del tubo entre el objetivo y el ocular para producir la imagen intermedia.

48 Descripción del microscopio óptico: (ICS) Óptica corregida a infinito ocular objeto objetivo lente intermedia Óptica finita ocular objeto objetivo

49 Descripción del microscopio óptico Sistemas de iluminación: Condensadora Fuentes de iluminación

50 Descripción del microscopio óptico Condensadora: Es el sistema óptico convergente situado antes de la platina encargado de iluminar adecuadamente el objeto para obtener el máximo rendimiento del objetivo.

51 Descripción del m. óptico: condensadora Cuando la A.N. de iluminación es casi igual a la A.N. máxima del objetivo se disminuye el contraste. En las muestras de contraste alto con detalles diminutos se debería iluminar la A.N. del objetivo por completo. Pero si la muestra tiene poco contraste se debe disminuir el cono de iluminación de la A.N. del objetivo para impedir que la imagen quede borrosa debido al poco contraste.

52 Descripción del m. óptico: condensadora El cono de luz que ilumina la A.N. de objetivo se controla por medio de un diafragma de iris. Si el diafragma está muy cerrado la imagen está demasiado contrastada y se pierde resolución. Pero si está muy abierto la imagen sufre alteraciones a causa de la difracción. La posición correcta será cerrar hasta aproximadamente 2/3 del campo de visión cuando se observa el plano focal posterior de la lente objetivo.

53 Descripción del microscopio óptico Fuentes de iluminación: Luz natural: ya no se usa. Lámpara incandescente: la más usada Lámpara de arco: iluminación intensa y sin estructura Lámpara de descarga: vapor de mercurio

54 Descripción del microscopio óptico Tipos de iluminación: Iluminación crítica Iluminación de Köhler

55 Descripción del microscopio óptico Iluminación crítica: Se forma la imagen de la fuente luminosa sobre la imagen a observar, en el plano de la muestra. Iluminación muy brillante pero desigual con puntos de diferente brillo.

56 Descripción del microscopio óptico Iluminación de Köhler: Se ilumina estricta y únicamente la parte observada del objeto. Proporciona una intensidad suficiente y uniforme. Evita la luz parásita que se produce en las partes iluminadas y no observadas de la muestra.

57 Mantenimiento, limpieza y conservación del microscopio óptico

58 Mantenimiento, limpieza y conservación Cualquier componente es INCREÍBLEMENTE CARO Enemigos primordiales del microscopio: Polvo Enemigo número 1!! Agua y humedad ambiental Grasa procedente de los dedos o del propio equipo Restos de medios de inmersión, medios de montaje y medios de cultivo Ambientes químicamente agresivos Sol directo y fuentes de calor

59 Mantenimiento, limpieza y conservación Normas básicas: Cuando se hace mantenimiento de instrumentación hay que invertir paciencia, no energía. Siempre es mejor prevenir que reparar. El microscopio óptico es un instrumento de precisión. Hay que trabajar sobre una superficie absolutamente limpia y con buena iluminación. estable, Usar la herramienta del tamaño apropiado. No forzar nunca ningún elemento mecánico ni óptico cuando se procede a desmontar y montar.

60 Mantenimiento, limpieza y conservación Cuando se retira cualquier elemento óptico o mecánico que deje abierto el camino óptico, es imprescindible cegar inmediatamente el hueco que queda libre con la ayuda de una tapa ciega, o bolsa de plástico y cinta adhesiva con el fin de evitar la entrada de polvo y suciedad. No dejar nunca los tubos oculares o alguna posición del portaobjetivos vacío, colocar un tapón ciego. Cuando se desmonta un objetivo, mientras una mano lo desenrosca la otra lo sujeta. Cuando se monta un elemento óptico, no retirar la mano hasta que no tengamos la absoluta certeza de que ha quedado bien sujeto.

61 Mantenimiento, limpieza y conservación Está desaconsejado desarmar los elementos de los conjuntos ópticos (ocular, objetivo, condensador, ) si no es absolutamente imprescindible, puesto que se pueden producir desajustes irreversibles en el posicionamiento de las lentes, ya que, en muchos casos, han sido centradas en fábrica por medio de banco óptico, y hacerlos reajustar es caro. Si se tuviera forzosamente que desarmar, es recomendable apuntar la posición, el orden y la orientación de todos los elementos ópticos y de las respectivas piezas de sujeción.

62 Mantenimiento, limpieza y conservación Las ópticas y demás piezas que se vayan desmontando hay que dejarlas en lugar seguro (cajas, estuches, ) para evitar que rueden y caigan al suelo, depositándolas en posición vertical y con el extremo que queda en el interior del camino óptico protegido del polvo. Si hay que reparar cualquier elemento situado en la base del microscopio y para ello hay que tumbarlo o darle la vuelta, primero es necesario retirar todos los elementos que se sostienen por gravedad (filtros, oculares, ). En ningún caso tocar el interior de los caminos ópticos con los dedos, puesto que éstos suelen tener un tratamiento superficial de color negro mate, y cualquier huella de los dedos podría ocasionar brillos no deseados.

63 Mantenimiento, limpieza y conservación Evitar golpear la lente frontal de los objetivos contra la preparación que se observa o contra cualquier otro objeto. Esto podría producir rayas o señales sobre la lente, fisuras en el cemento que fija la lente, e incluso su desplazamiento hacia atrás. Si se fisura el cemento se corre el riesgo de que entren líquidos como los medios de inmersión o de montaje. Los objetivos de inmersión hay que limpiarlos inmediatamente al finalizar la sesión de observación.

64 Mantenimiento, limpieza y conservación Los restos de aceite o de otros medios de inmersión, además de retener suciedad, pueden acabar introduciéndose por capilaridad entre la montura y la lente frontal del objetivo. Al acabar la observación, limpiar el microscopio. Siempre que no se esté utilizando el microscopio, debe estar completamente tapado por medio de una funda. Las fundas de plástico son un buen aliado para proteger los microscopios.

65 Mantenimiento, limpieza y conservación Electrónica, fuentes de alimentación y sistemas de iluminación: Retirar el polvo de las ranuras de ventilación. -Soplando con una pera de goma -Aire o nitrógeno a presión -Aspiración Ayudándose de un pincel limpio, seco y libre de grasa.

66 Mantenimiento, limpieza y conservación Limpieza de la lámpara: Alta temperatura, refrigeración por aire = polvo adherido Dejar enfriar Guantes de algodón Retirar y limpiar con etanol Suciedad carbonizada, usar amoníaco

67 Mantenimiento, limpieza y conservación Sustitución de la lámpara: Respetar la duración máxima de las lámparas de vapor de mercurio Se limpia antes de colocarla como si fuese una lámpara usada

68 Mantenimiento, limpieza y conservación Parte mecánica: Retirar el polvo superficial con un trapo fino. En caso de vertido accidental de medios de montaje líquidos o medios de inmersión, etc. Absorber el líquido con papel Disolver y limpiar los restos con agua destilada Secar bien

69 Mantenimiento, limpieza y conservación Parte óptica: Retirar el polvo soplando con pera, nitrógeno o aire. Limpiar en húmedo con papel óptico o trapo suave humedecido en etanol, cristasol, isopropanol... con movimiento circular. Secar.

70 Mantenimiento, limpieza y conservación En aquellos microscopios en que trabajan varias personas la limpieza periódica de los oculares contribuye a minimizar el riesgo de contraer conjuntivitis. Las huellas, los restos de medios de inclusión o de montaje y el polvo presentes en el objetivo, sean del tipo que sean, ocasionan una pérdida de resolución y contraste debido a que dispersan la luz, dando la sensación de que se tiene una aberración de esfericidad elevada.

71 Mantenimiento, limpieza y conservación No usar nunca benceno, tolueno o xileno! Son disolventes altamente tóxicos y muy agresivos frente a pinturas y cemento de unión.

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