TIPOS DE MICROSCOPIOS

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1 TIPOS DE MICROSCOPIOS

2 ÍNDICE 1. El microscopio óptico El microscopio óptico compuesto El microscopio óptico de contraste de fases El microscopio óptico de campo oscuro El microscopio óptico de fluorescencia 8 2. El microscopio electrónico El sombreado La tinción negativa Réplicas de carbono Criocorrosión El microscopio electrónico explorador 12 Editado por: 2

3 1.1. El microscopio óptico 1. TIPOS DE MICROSCOPIOS El microscopio óptico es un instrumento que sirve para aumentar el tamaño de un objeto a través de un sistema de lentes. Puede conseguirse con este método un aumento de hasta 2000 veces. Las partes de las que se compone un microscopio se pueden dividir en parte mecánica y en parte óptica (figura 1): Parte mecánica: Sistema de soporte: Pie: Sirve de apoyo y para darle estabilidad al microscopio. En él está integrada la fuente luminosa. Brazo: Es una columna que parte del pie sirve para sujetar el tubo. Puede ser recto o arqueado. Tubo: Es una cámara oscura que está unida al brazo. En su parte inferior está el revolver son los objetivos y en su parte superior los oculares. Platina: Es una plataforma horizontal sobre la que se engancha con dos pinzas el portaobjetos. Tiene en su zona central un orificio que permite el paso de la luz y un sistema de cremallera manejado por dos tornillos que permiten el movimiento de la muestra. Revolver: Sujeta los objetivos y gira para permitir el cambio de objetivo. Sistema de ajuste: Parte óptica: Tornillo macrométrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma brusca y poco precisa. Tornillo micrométrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma lenta y muy precisa. Fuente de iluminación: Es una lámpara halógena que permite el encendido o el apagado con un interruptor y cuya intensidad puede ser graduada. Puede tener en su parte superior un anillo para permitir la colocación de filtros que facilitan la visualización. Condensador: Es un sistema de lentes situado bajo la platina que permite concentrar la luz de la fuente de iluminación hacia la preparación. Diafragma iris: Está en el interior del condensador y sirve para limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la luz y ajusta la apertura numérica). Oculares: Están colocados en la parte superior del tubo y su función es captar y ampliar la imagen obtenida por los objetivos. Actualmente se suelen usar los microscopios binoculares que tienen dos oculares unidos por un mecanismo que permite ajustar la separación interpupilar. Son normalmente de x10 y x12. Objetivos: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en el revolver y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Sobre su superficie está indicado su aumento y su apertura numérica. Suelen llevar dibujado un anillo de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo), x10 (amarillo), x40 (azul) y x100 (blanco). Editado por: 3

4 Figura 1: Esquema de un moderno microscopio óptico El microscopio óptico compuesto El microscopio compuesto ha sido de importancia crucial para la microbiología como ciencia y es todavía, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigación microbiológica rutinaria. Un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes, el objetivo, situado cerca del objeto que se observa, y el ocular, que está colocado cerca del ojo. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. Con un objetivo que aumenta x40 y un ocular que aumenta x10 el aumento total es de x400. El microscopio compuesto es pues capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Además del aumento una propiedad del microscopio es su poder resolutivo. Esta es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos y, por tanto, cuanto mayor sea le poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como la longitud de onda habitualmente está fijada, la resolución de un objeto es función de la apertura numérica: cuánto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño. Hay una correspondencia aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numérica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrán mayores aperturas numéricas (el valor de la apertura numérica está marcado al lado de la lente). El poder resolutivo viene dado por la siguiente fórmula: Editado por: 4

5 siendo: d = poder resolutivo, λ = longitud de onda, N = índice de refracción del medio, α = semiapertura del objetivo, N*senα = apertura numérica. Para conseguir un aumento total máximo e idóneo este debe estar comprendido entre 500 y 1000 veces la apertura numérica. Si se busca una mayor ampliación de la imagen lo que se consigue es un mayor aumento, pero una nitidez baja. Un factor que afecta a la apertura numérica además de la construcción de la lente es el medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor de 1 0. Para conseguir aperturas numéricas mayores que ésta el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. Se utilizan aceites de varios tipos, y las lentes preparadas para usarse con aceite se denominan lentes de inmersión. La apertura numérica de un objetivo de inmersión de alta calidad esta entre 1 2 y 1 4. Aunque las lentes de inmersión en aceite tienen habitualmente mayores aumentos que las lentes para observación en seco, esto no es siempre así. Una lente de inmersión utilizada en el aire da una imagen muy poco satisfactoria, por lo que nunca deberá emplearse sin aceite. Aumento del objetivo x10 x40 x90 1 Aumento con un ocular de x10 x100 x400 x900 Apertura numérica Poder resolutivo, µm Profundidad de campo aproximada, µm Área de campo aprox. con un ocular de x10, mm Lentes de inmersión Tabla 1: Datos ópticos para los objetivos utilizados comúnmente. De acuerdo con la teoría de la óptica, las mayores resoluciones posibles con un microscopio óptico compuesto permitirán la observación de un objeto cuyo diámetro sea de unos 0 2 µm (1 µm = 10-6 m). Si un objeto de 0 2 µm de diámetro se aumenta 1000 veces, aparecerá a la vista como un objeto de 0 2 mm de diámetro que puede apreciarse fácilmente. Con el microscopio compuesto pueden obtenerse aumentos mayores de x1000 escogiendo los oculares adecuados, pero con ello no se da mayor resolución del objeto (esto se denomina aumento ineficaz, puesto que no añade nada a la resolución). La mayor parte de los microscopios usados en microbiología tienen oculares de diez aumentos (x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total x100), x40 (aumento total x400) y x90 o x100 (objetivos de inmersión, aumento total x900 ó x1000). Las lentes de menor aumento se utilizan para rastrear la preparación buscando objetos de interés, el objetivo de 40 aumentos permite la observación detallada de los microorganismos grandes tales como algas, protozoos y hongos, y los objetivos de 90 ó 100 aumentos se emplean para ver las bacterias y los pequeños microorganismos eucarióticos. El sistema de iluminación de un microscopio es también de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza un sistema de lentes llamado condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El condensador tiene también un diafragma iris, que controla el diámetro del círculo de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris Editado por: 5

6 es demasiado grande parte de la luz pasará no sólo al objetivo sino también alrededor de él y no se utilizará. Si la luz es demasiado brillante no deberá reducirse alterando la posición del condensador o del diafragma iris, sino usando filtros de neutralización o disminuyendo el voltaje de la lámpara. Nunca se insistirá lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopia, especialmente a los mayores aumentos. Otros dos factores relacionados con el sistema de lentes utilizado son la profundidad de campo y el área de campo. Profundidad de campo significa el espesor de la preparación enfocada en cualquier momento y es siempre mayor a pequeño que a gran aumento. Con inmersión en aceite la profundidad de campo es muy escasa, habitualmente menor de 1 µm. El área de campo se representa por el diámetro de la parte de la preparación que se está viendo. El área de campo es siempre mayor con pequeño que con gran aumento, y por esta razón las lentes de pequeño aumento son útiles para rastrear la preparación. Figura 2: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo claro. (b) Microfotografía de campo claro El microscopio óptico de contraste de fases El microscopio de contraste de fases hace posible ver fácilmente pequeñas células, incluso sin teñir. Las células tienen un índice de refracción distinto de su alrededor y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste que la que puede obtenerse con el microscopio óptico normal. En este microscopio la fuente de luz es un cono hueco de luz que pasa a través de un diafragma anular al condensador. En el objetivo un anillo de contraste de fases desplaza la fase de luz que lo atraviesa en un cuarto de longitud de onda. La luz que pasa retardada atraviesa el anillo y el ojo la ve como luz blanca normal. La luz que pasa a través de una muestra con índice de refracción diferente del índice del medio es retardada y tiene un recorrido más largo, llegando al ocular fuera de fase. La interferencia entre la luz retardada y la no retardada produce una imagen de la Editado por: 6

7 muestra. En la mayoría de los microscopios de contraste de fases la imagen aparece clara sobre un fondo oscuro. Puesto que la imagen depende de las diferencias en el índice de refracción de la muestra y del medio circundante, la imagen desaparece si la muestra es sumergida en un líquido de igual índice de refracción. Para obtener mejores resultados con el microscopio de contraste de fases es esencial que el sistema óptico esté cuidadosamente alineado y se emplea un dispositivo especial, el telescopio controlador, para ajustar el diafragma anular en relación con el anillo de contraste de fases. La microscopia de contraste de fases hace posible observar células en estado vivo, ayudándonos así a evitar la creación de artefactos tales como los introducidos por la tinción. En muchos laboratorios de bacteriología el microscopio de contraste de fases ha reemplazado prácticamente al microscopio óptico común como instrumento de investigación. Pero hay que tener en cuenta que el objetivo de contraste de fases es menos apropiado que el normal para la observación de material teñido, por lo cual los objetivos de campo claro son todavía necesarios y deberían emplearse siempre para observar muestras teñidas. Figura 3: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de contraste de fases. (b) Microfotografía de contraste de fases El microscopio óptico de campo oscuro El microscopio de campo oscuro es un microscopio óptico ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados de tal modo que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta disposición la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro. La microscopia de campo oscuro ha posible la observación en estado vivo de partículas y células que de otra manera estarían por debajo de los límites de resolución del microscopio óptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la Editado por: 7

8 espiroqueta causante de la sífilis, que es invisible con la microscopia óptica ordinaria. Figura 4: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo oscuro. (b) Microfotografía de campo oscuro El microscopio óptico de fluorescencia Se utiliza para poner de manifiesto muestras que tienen fluorescencia, bien a causa de la presencia en su interior de sustancias materiales fluorescentes o que han sido tratadas con colorantes fluorescentes. La fluorescencia es la propiedad que tienen muchas sustancias químicas de emitir luz de un color después de excitarlas con luz de otro color. En el microscopio de fluorescencia la luz de excitación es eliminada con un filtro colocado entre el objetivo y el ocular, de modo que sólo se ve la luz emitida. Figura 5: Comparación entre los métodos microscópicos: (a) De campo claro. (b) De campo oscuro. (c) De contraste de fases. (d) De fluorescencia. Editado por: 8

9 1.2. El microscopio electrónico Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del microscopio electrónico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el vacío. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La resolución obtenida con el microscopio electrónico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio óptico. Mientras que con estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0 2 µm, con el microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de µm (= 1 nm = 10-9 m). Con el microscopio electrónico es posible ver muchas sustancias incluso de tamaño molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados. Si se está interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto último transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la deshidratación la muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrótomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y, por tanto, se ven mejor. Figura 6: Microscopio electrónico moderno. Editado por: 9

10 La fina sección es montada sobre una rejilla metálica recubierta de colodión y es incorporada al instrumento, luego se aplica el alto vacío. Una vez es evacuada la cámara de la muestra, se enfoca el haz electrónico y la imagen se observa en una pequeña pantalla. Se toman fotografías de las imágenes interesantes, ya que sólo en la placa fotográfica se obtiene la resolución última del microscopio electrónico. El intenso haz electrónico causa el deterioro gradual de la muestra, de forma que no es posible una observación a largo plazo. La fijación, la inclusión y la tinción son tratamientos potencialmente perjudiciales y pueden alterar grandemente las estructuras celulares. Por esta razón debe tenerse gran cuidado en la interpretación de las imágenes obtenidas con el microscopio electrónico. Los artefactos o creaciones artificiales son mucho más comunes que en la microscopia óptica. Procedimientos que van bien con ciertos organismos pueden fallar con otros. En general, se utilizan métodos diferentes para los organismos procarióticos y para los eucarióticos. La microscopia electrónica es un arte altamente desarrollado y con esta técnica somos capaces de observar estructuras celulares que no pueden verse de ninguna otra manera. La resolución mucho mayor que puede obtenerse justifica el cuidado, el tiempo y el gasto que representa la preparación de micrografías electrónicas. Figura 7: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrónico. (b) Microfotografía de músculo atrial aumentado x El sombreado Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas y sobre la rejilla metálica pueden montarse células enteras. Para aumentar el contraste de las células entras se recurre generalmente al sombreado. Esto implica el recubrimiento de la muestra con una fina capa de metal como, por ejemplo, paladio, cromo u oro. El metal se deposita sobre el objeto por un lado de forma que se crea una sombra. De esta manera el objeto aparece con grosor y Editado por: 10

11 forma. El sombreado se utiliza a menudo para observar apéndices superficiales en las bacterias. Figura 8: Micrografía electrónica de una célula sombreada mostrando los flagelos La tinción negativa Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrónico es la tinción negativa. Se aplica el mismo principio que en la tinción negativa del microscopio óptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas más comúnmente utilizadas en la microscopia electrónica se realiza con ácido fosfovolfrámico (fosfotúngstico) Réplicas de carbono Figura 9: Micrografía electrónica con tinción negativa. Para examinar las superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrónico. Figura 10: Micrografía electrónica de una réplica de carbono de una aleación de niquel Criocorrosión Otra técnica de la microscopia electrónica recientemente desarrollada es la de criocorrosión ( freeze-etching ), que evita la formación de artefactos al eliminar la fijación química y la inclusión. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento químico y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, Editado por: 11

12 de tal modo que quedan expuestas porciones de las superficies de las células. Se hacen y se examinan entonces réplicas en carbono de esas superficies, pudiéndose observar estructuras superficiales o internas de las células. La mayoría de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas químicamente se ven también en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos. Figura 11: Micrografía electrónica de una réplica celular por criocorrosión El microscopio electrónico explorador Otro instrumento reciente para examinar las estructuras superficiales es el microscopio electrónico explorador ( scanning electron microscope ). El material que se estudia es recubierto con una película fina de un metal pesado tal como el oro. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparación y la va recorriendo y explorando por todas la superficie. Los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen. Con el microscopio electrónico explorador pueden observarse incluso muestras muy grandes, siendo muy buena la profundidad de campo. El aumento que puede obtenerse oscila entre uno tan bajo como x15 y uno tan alto como x100000, pero sólo puede observarse la superficie de un objeto. Figura 12: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrónico explorador. (b) Microfotografía de la cabeza de una hormiga. Editado por: 12

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