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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C07F 1/08 A23K 1/17 C07C 229/26 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Utilización de complejos de cobre de alfa amino ácidos que contienen grupos amino terminales como suplemento nutritivo. k Prioridad: US US k 73 Titular/es: Zinpro Corporation 782 Washington Avenue Suite 80 Bloomington Minnesota 43, US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Abdel-Monem, Mahmoud M. y Anderson, Michael Dean k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCION Utilización de cobre de alfa amino ácidos que contienen grupos amino terminales, como suplemento nutritivo Antecedentes de la invención El importante papel fisiológico del cobre en los vertebrados fue demostrado primeramente en Desde ese momento, se encontró que el cobre era un componente clave de diversos enzimas. La mayoría de estos enzimas conteniendo cobre son conocidos para catalizar fisiológicamente importantes reacciones. La deficiencia dietética del cobre en los vertebrados tiene como resultado diversos trastornos patológicos. Una de las inmediatas manifestaciones de la deficiencia de cobre es la fractura espontánea de los huesos en ovejas y reses que pastan en pastos deficientes en cobre. La deficiencia de cobre inducida experimentalmente tiene como resultado anomalías de huesos en conejos, cerdos, pollos y perros. El defecto de los huesos parece residir en la matriz orgánica y no en el conjunto mineral del hueso. La deficiencia de cobre tiene como resultado la falta de pigmentación del pelo y lana en numerosas especies incluyendo ovejas de lana negra en las que las bandas de lana pigmentada y no pigmentada pueden correlacionarse con la suplementación de cobre. Los plumajes de los pavos alimentados con dietas deficientes en cobre también carecen de pigmentación. La deficiencia de cobre puede provocar lesión cardíaca en el ganado que puede incluso tener como resultado la muerte repentina. Además, los pollos y cerdos alimentados con dietas deficientes en cobre pueden morir repentinamente de hemorragia interna masiva debida a defectos estructurales en las arterias principales. Los niveles subnormales del cobre en el forraje tienen como resultado ataxia o incoordinación ( swayback ) neonatal en corderos. Los cerdos deficientes en cobre no absorben el hierro a una velocidad normal. Parece que el cobre es también esencial para la liberación del hierro de la mucosa intestinal y los tejidos de almacenamiento del hierro. En general, las deficiencias de cobre causan anemia en todas las especies que se han estudiado hasta aquí. Solamente una fracción del cobre ingerido en la dieta es finalmente utilizado en la formación de proteínas de cobre. La forma del cobre ingerido influencia el grado de su utilización como se mide por la actividad de ceruloplasmina (enzima de cobre-proteína). Se ha sabido que la presencia de ciertos aminoácidos provoca un aumento en la absorción y utilización del cobre (Kirchgessner y Girassmann, Z. Tierphysiol. Tierenahrung Futtermittelk. 26:3(1970); Girassmann y col., Z. Tierphysiol. Tierernahrung Futtermittelk. 28:28 (1971); Schwarz y col., ibid. 31:98 (1973)). Puede, por lo tanto, verse que un equilibrio dietético apropiado de cobre altamente bioasequible es importante para los animales, incluyendo cerdo y aves. En fechas recientes, se ha dado a conocer, particularmente para cerdos y aves, que pueden tener deficiencias de cobre debidas a la naturaleza de sus raciones alimenticias. Por otra parte, se ha encontrado que de vez en cuando, las micotoxinas que están presentes en las raciones alimenticias, particularmente maíz, tienen una tendencia a enlazar el cobre disponible en una forma que lo hace no bioasequible. Así, el resultado neto es que los alimentos para cerdos y aves conteniendo micotoxinas puede en cierto modo enlazar el cobre disponible en el alimento haciéndolo no bioasequible. El resultado neto es que incluso aunque se suministren a los animales niveles mucho más altos de cobre que las raciones diarias recomendadas por el NRC (National Research Council), el animal no consigue en modo alguno su requerimiento NRC adecuado. Se origina un problema adicional suministrando niveles altos de cobre que son simplemente excretados después sin captar. El cobre en el excremento es retornado al suelo, elevando significativamente el nivel de cobre. Esto puede producir problemas de contaminación ambiental indeseados. Puede verse, por lo tanto, que son necesarios niveles dietéticos adecuados de cobre altamente bioasequible para el desarrollo del ganado, incluyendo reses, cerdos y aves. Por otra parte, existe la necesidad de presentar el cobre en una forma altamente bioasequible que asegure que el animal tenga un elevado nivel de captación del cobre sin excretarlo para dar lugar a potencial contaminación ambiental. Es una ventaja especialmente preferida producir los complejos de la presente invención a partir de amino ácidos esenciales. Esto permite no solamente una bioasequibilidad aumentada del cobre, sino que también proporciona al animal una cantidad nutricional apropiada de un amino ácido esencial necesario 2

3 ES T para el crecimiento apropiado. Para el cobre, es especialmente difícil formar complejos en forma sólida de cobre y alfa-amino ácidos. Por ejemplo, si se intenta formar un complejo tal como con metionina de acuerdo con los procedimientos generales indicados en la Patente U.S concedida el 2 de Marzo de 1976 y la Patente U.S concedida el 3 de Mayo de 1977, el resultado es una reacción de oxidación-reducción entre la metionina y el cobre, dando como resultado un producto de reacción inutilizable. Se ha descubierto que cuando se emplean complejos de cobre de alfa-amino ácidos con un grupo amino terminal, no tiene lugar la reacción redox interna. A este respecto, puede hacerse referencia al CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 1, 1984, p. 26, n 1.386n; vol. 81, 1974, p.4, n g; vol. 90, 1979, p.413, n x; vol. 34, 1976, p. 6, n h; vol. 1, 1984, p. 9, n 6.397s; vol. 86, 1977, p. 673, n s; JOURNAL of the AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 92, n, 1970, p ; y JOURNAL of MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 19, n 1, 1976, p Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar un método de acuerdo con las reivindicaciones1a6desuplementación de un alimento de animales con un aditivo apropiado para asegurar los requerimientos dietéticos adecuados de cobre para el crecimiento y la salud, utilizando como dicho aditivo sales complejas de cobre y ciertos alfa-amino ácidos conteniendo un resto amino terminal, en las que el cobre está en una forma que puede ser fácilmente absorbida después de la ingestión por el ganado, particularmente cerdos, aves y reses. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un alimento de animales de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende dicho aditivo. Incluso un objetivo adicional de la presente invención es el empleo de acuerdo con la reivindicación 8 de dichas sales complejas para la fabricación de aditivos alimenticios en nutrición animal. En un aspecto más específico de la presente invención, dichas sales complejas son complejos de relación 1:1 donde la relación del cobre al alfa-amino ácido es 1:1 ó complejos 1:2 donde la relación del cobre al alfa-amino ácido es 1:2. De acuerdo con la presente invención, las sales complejas tienen la siguiente fórmula general: H O (H + 3 N-(CH 2 ) n C C O ) m.cu ++ Z y NH 2 donde n esde1a, m es1ó2, Z esunanión e y es el número requerido para equilibrar electrostáticamente el conjunto. Debido a un complejo formado entre el cobre y el alfa-amino ácido, se cree que estos compuestos están en una forma que es fácilmente absorbida por el ganado doméstico, incluyendo reses, cerdos y aves. Así, estos complejos funcionan como una fuente fácilmente asequible de cobre para la suplementación dietética al tiempo que proporcionan simultáneamente alfa-amino ácidos esenciales para la salud y el crecimiento normal. Descripción detallada de la invención Los compuestos de la presente invención pueden describirse como sales complejas de cobre entre el catión cobre y ciertos alfa-amino ácidos con un resto amino terminal de la fórmula general H H 2 N-(CH 2 ) n -C-COOH NH 2 donde n es igual a 1-. El ácido preferido es cuando n es igual a 4, lisina. Sin embargo, n no aumentará sustancialmente más allá de porque los compuestos para n mayor de no son fácilmente asequibles y no son comercialmente factibles. También es importante apuntar que los compuestos de esta invención son complejos de cobre en los que los enlaces de coordinación están formados entre el catión cobre y el grupo alfa-amino del ácido, 3

4 ES T3 además de la atracción electrostática entre el catión y los iones carboxilo. Esta sal compleja involucrando ambos, enlaces de coordinación y atracción electrostática, parece mejorar la bioasequibilidad del cobre. Para los complejos 1:2, la fórmula ilustrando ambos, el enlace de coordinación y la atracción electrostática, puede representarse como sigue: Para los complejos 1:1, la fórmula ilustrando ambos, el enlace de coordinación y la atracción electrostática, puede representarse como sigue: H C O Z y H + 3 N-(CH 2 ) n H 2 N- - - Cu ++ donde y es un número requerido para equilibrar electrostáticamente la sal y Z es un anión. Aunque las fórmulas anteriores representan los compuestos estéricamente, los compuestos pueden representarse también por la siguiente fórmula: H O (H + 3 N-(CH 2) n -C- C-O ) m.cu ++ Z y NH 2 donde 0 n es1-, m es1ó2, Z esunanión, e y es el número requerido para equilibrar electrostáticamente la sal. Es importante recordar que estas sales son capaces de existir en forma de estado sólido estable. Ellas son así procesables y utilizables en alimentos animales. Esto es para distinguirlas de la mera existencia en estados de transición no aislables en un equilibrio de una solución. Las sales preferidas son las del alfa-amino ácido lisina donde n es igual a 4. La sal más preferida es el lisin sulfato de cobre ya sea en los complejos 1:2 ó1:1.enlafórmula presentada, Z es igual al anión, y puede ser un anión inorgánico ounanión orgánico. Preferiblemente, Z está seleccionado del grupo formado por cloruro, bromuro, yoduro, sulfatos y fosfatos. Mediante el término sulfatos y fosfatos se pretende incluir sulfatos ácidos yfosfatosácidos, así como los que no tienen restos hidrógeno asociados con ya sea el sulfato o el fosfato, esto es, simplemente el sulfato SO = 4 yelfosfatopo 3 4. Para los complejos de cobre en forma sólida preferidos de lisina y cloruro de cobre, o sulfato de cobre, los complejos son materiales cristalinos azules, muy solubles en agua, estables. 4

5 ES T Los complejos 1:1 son ligeramente menos estables pero son también más económicos debido a que consumen menos lisina en la fabricación. Generalmente, los complejos 1:1 se conseguirán si el ph se controla en el lado más ácido, por ejemplo, de aproximadamente 3,0 hasta aproximadamente 4,0. Se cree que incluso los complejos 1:2 más estables se convierten en complejos 1:1 en el entorno ácido del tubo digestivo. Para detalles de otros complejos de cobre de los hidroxi ácidos para usos similares, ver solicitud copendiente y comúnmente asignada para Complejos de cobre de alfa hidroxi ácidos orgánicos y su uso como suplementos nutricionales, No. de Serie 2.023, presentada el de Octubre de Se han desarrollado procedimientos simples y económicamente factibles de preparación de estos complejos de cobre. De acuerdo con el procedimiento de esta invención, se calienta una solución del monohidrato de lisina a -80 C. Se añade cuidadosamente ácido clorhídrico seguido por la adición cuidadosa de óxido de cobre. La mezcla se agita durante aproximadamente minutos. La pequeña cantidad de óxido de cobre insoluble se separa por filtración. El filtrado se concentra hasta sequedad utilizando métodos convencionales, tales como horno de aire caliente, secado por pulverización, secado por congelación o evaporación a presión reducida, para dar el producto deseado. Pueden obtenerse los mismos productos mezclando cuidadosamente una solución de monohidrocloruro de lisina con carbonato cúprico básico. La mezcla se calienta a reflujo durante dos horas. La solución se filtra mientras todavía esta caliente y se enfria a C. Se añade acetona a modo de etapas al filtrado enfriado hasta que se observa turbidez. La mezcla se almacena durante la noche a 4 C para precipitar el producto deseado. El producto deseado también puede obtenerse a partir del filtrado utilizando un método convencional de secado. El producto deseado se purifica adicionalmente por recristalización de acetona-agua. Otro método conveniente para obtener los complejos de cobre implica la adición cuidadosa de sulfato de cobre en polvo a una solución caliente de monohidrato de lisina. El producto deseado se obtiene a partir de la mezcla como se describe en los ejemplos anteriores. La formación de complejos de cobre de alfa-amino ácidos tal como lisina, ornitina y ácido gamma amino butírico se utilizan comúnmente como un medio de protección o bloqueo del grupo alfa-amino en reacciones sintéticas en las que se desea derivatizar el grupo amino de la cadena lateral. (Ref. A. C. Kurtz, J. Biol. Chem., 180, 123 (1949); R. Ledger and F.H.C. Stewart, R.J. Stedman y Vincent Du Vigneaud, J. American Chemical Society, 78, 883 (196)). Sin embargo, los procedimientos utilizados en las reacciones implican pequeñas cantidades de reactivos y métodos complejos que no son aplicables para la preparación de grandes cantidades de producto. Adicionalmente, los complejos de cobre no se aíslan habitualmente en forma cristalina y no se caracterizan. Una ventaja distinta de los compuestos de la presente invención es que son compuestos cristalinos, estables y solubles en agua que pueden obtenerse fácilmente en grandes cantidades para uso como aditivos alimenticios a un coste relativamente bajo. Los compuestos de esta invención proporcionan una fuente fácilmente asequible de cobre y del alfa-amino ácido esencial lisina. El nivel de adición de los alfa-amino ácidos de cobre, conteniendo los ácidos un resto amino terminal, de esta invención para uso como suplemento alimenticio puede variar en un amplio rango. Preferiblemente, el nivel de adición es tal que proporcione una cantidad dietética de cobre de aproximadamente 0,2 partes por millón hasta aproximadamente 2,0 partes por millón, y más preferiblemente de aproximadamente 1,0 partes por millón. Estos niveles se consiguen satisfactoriamente cuando la cantidad de la sal compleja preferida de lisina de cobre, incluyendo, ambos, complejos 1:1 y 1:2, así como otros, añadida al alimento animal, es de aproximadamente 0,1 g por cabeza de ganado por día hasta aproximadamente 1,0 g por cabeza de ganado por día, preferiblemente 0,6 g, por cabeza de ganado por día. Se entenderá, sin embargo, que pueden utilizarse otros niveles de adición y que el nivel de adición preciso no es, de hecho, crítico, ajustándose a las condiciones de los animales que se estén tratando con el suplemento nutricional. Esencialmente, una de las ventajas distintas de los compuestos de la presente invención es que son compuestos cristalinos solubles en agua fácilmente procesables y tamaño reducible a polvo para uso en una forma de suplemento alimenticio conveniente. En otras palabras, su forma física es una que sea fácilmente mezclable con alimentos de animales rumiantes típicos. En la producción de suplementos nutricionales para adición a las dietas de animales, se prefiere añadir los complejos de la presente invención al portador o materiales de carga para procesabilidad, facilidad de

6 ES T3 manejo y venta. Ejemplos de portadores adecuados incluyen restos de destilación de fermentados, granos alimenticios, sub-productos animales, de volatería y pescado y carne, suero y otros materiales celulósicos bien conocidos en las técnicas de preparación de productos minerales del campo. El siguiente ejemplo se ofrece para ilustrar, pero no limitar, la preparación de los compuestos de la presente invención. Ejemplo 1 1 Se añadiócarbonatocúprico básico (12 gm) a modo de porciones muy cuidadosamente a una solución de monohidrocloruro de lisina ( gm) en agua (0 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas. La solución se filtró aún caliente. El filtrado se enfrió a Cyseañadió acetona en etapas hasta observarse turbidez. La mezcla se almacenó a4 C durante la noche. El precipitado se recogió y se secó. Se preparó una muestra analítica por recristalización de agua-acetona. La muestra se secó sobre pentóxido de fósforo. Se registró el espectro infrarrojo del producto en pastilla de KBr y se encontró que era compatible con la estructura aquí dada. Análisis elemental para C 12 H 28 O 4 N 4 Cl 2 Cu, 2 H 2 Ocalculado encontrado: C, 31,14 (13,1); H, 6,96 (6,93); N, 12, (11,86); Cl, 1,31 (1,1). Análisis del cobre utilizando el procedimiento de cenizas. Ceniza 14,33 por ciento; cobre calculado al 11,44 por ciento a partir de la ceniza. El teórico era 13,73 por ciento. Este análisis elemental confirma la estructura de los complejos 1:2. Ejemplo Se mezcló monohidrato de lisina (16,7 gm) con agua (2 ml) y la mezcla se calentó con agitación a -80 Chastaquetodoelsólido se disolvió. Se añadió ácido clorhídrico concentrado (9,8 ml del 37,3 por ciento) muy cuidadosamente. Se continuó la agitación de la solución durante la adición del ácido. Se añadióóxido de cobre (4,0 gm) a la solución agitada y se continuólaagitación a 70 C durante minutos. La mezcla caliente se filtró para separar el óxido de cobre sin reaccionar. El filtrado se concentró hasta sequedad para dar el producto deseado (21 gm). El producto es muy soluble en agua y da una solución azul obscuro transparente. El color del producto sólido depende del grado de hidratación. Un producto anhidro tiene un color amarillo-verde, y cuando el sólido se hidrata, cambia a azul obscuro. El sólido tiene las mismas propiedades físicas y químicas que las del producto obtenido en el Ejemplo 1. Ejemplo 3 Se mezcló monohidrato de lisina (800 libras; 362,88 kg) con 1, libras (63 kg) de agua caliente. La solución se mezcló hasta que toda la lisina se hubo disuelto (aproximadamente minutos). Seguidamente, se continuó la agitación mientras se añadía lentamente sulfato de cobre pentahidrato (0 libras, 272,16 kg). Después de que se hubo añadido todo el sulfato de cobre pentahidrato a la solución de lisina, se continuó laagitación y la solución se mantuvo a F (71-82,2 C) durante -1 minutos para permitir que tuviera lugar la reacción de complejación. El complejo de lisina cobre se secó utilizando una técnica de secado por pulverización convencional. El producto deseado resultante fue un polvo fino verde. Este compuesto, si se alimenta al ganado, particularmente cerdos, reses y aves y también por ejemplo, ovejas, a los niveles especificados aquí, mostrará que el cobre está en una forma altamente bioasequible y lo proporcionará a niveles suficientes para la cantidad dietética adecuada de cobre para proporcionar crecimiento saludable normal, buena producción de glóbulos rojos, apropiada pigmentación para pelo y lana y a niveles suficientes para pautas reproductivas normales. Ejemplo 4 Este ejemplo prepara el complejo de lisina cobre 1:1. Para el complejo 1:1, la relación de sulfato de cobre pentahidrato a hidrocloruro de lisina será de 1,4:1. Se mezcló monohidrocloruro de lisina (36 libras; 16,6 kg) con libras (44,3 kg) de agua caliente. La solución se mezcló hasta que toda la lisina se hubo disuelto (aproximadamente minutos). Seguidamente, se continuó laagitación mientras se añadía lentamente sulfato de cobre pentahidrato (00 libras; 226,8 kg). 6

7 ES T3 Después de que se hubo añadido todo el sulfato de cobre pentahidrato a la solución de lisina, se continuó laagitación y la solución se mantuvo a F (71-82,2 C) durante -1 minutos para permitir que tuviera lugar la reacción de complejación. La solución de lisina cobre se secó utilizando una técnica de secado por pulverización convencional. El producto deseado resultante fue un polvo fino. Puede por lo tanto verse que la invención efectúa y conseguirá la totalidad de los objetivos establecidos

8 ES T3 REIVINDICACIONES Un método de suplementación de un alimento de animales con cobre bioasequible, caracterizado porque comprende añadir a dicho alimento de animales una cantidad efectiva de una sal compleja de cobre, en forma sólida, de la fórmula: H O (H + 3 N-(CH 2 ) n -C- C-O ) m.cu ++ NH 2 Z y donde n es de 1 a, m es 1 ó2, Z esunanión e y es el número requerido para equilibrar electrostáticamente la sal. 2. El método de la reivindicación 1, donde en la fórmula de dicha sal compleja de cobre, n = El método de la reivindicación 1 ó 2, donde en la fórmula de dicha sal compleja de cobre, Z es un anión inorgánico. 4. El método de la reivindicación 3, donde Z está seleccionado del grupo formado por cloruro, bromuro, yoduro, sulfatos y fosfatos.. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha sal compleja de cobre es el sulfato de lisina cobre 1:1 en forma sólida. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha sal compleja de cobre es el sulfato de lisina cobre 1:2 en forma sólida Un alimento de animales, caracterizado porque comprende, como un aditivo, una sal compleja de cobre como se define en una cualquiera de las reivindicaciones Uso de una sal compleja de cobre, en forma sólida, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la fabricación de un aditivo alimenticio en nutrición animal. 4 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 8