EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL

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1 ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA BOGOTÁ 2008

2 ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA Autor: Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL Código Tesis de grado para optar por el titulo de: ESPECIALISTA EN ONCOHEMATOLOGÍA PEDIÁTRICA Director de Tesis: Dr. EDUARDO BELTRÁN DUSSAN Profesor Titular Departamento de Pediatría Coordinador Académico División de Oncohematología Pediátrica Coordinador de la Especialidad en Oncohematología Pediátrica Codirector de Tesis: Dr. JORGE EDUARDO CAMINOS PINZÓN Profesor de la Facultad de Medicina División de Bioquímica UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA BOGOTÁ 2008

3 A mi compañera Adriana, impulsora incansable de todas mis batallas y a quien pertenece también este triunfo A mis hijas: Laura, Juliana y Camilita: a quienes debo el amor a la vida A mis padres Zoila y William, ejemplo de lucha, lealtad, rectitud y bondad A mis maestros A mis pacientes A todos mis colaboradores

4 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Susana Bravo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, España Al Dr. Justo Castaño de la Universidad de Córdoba, España A la Universidad Nacional de Colombia A la Fundación Hospital de la Misericordia Al Departamento de Pediatría de la Universidad Nacional de Colombia Al Servicio de Oncohematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia

5 CONTENIDO Pág. INTRODUCCION JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECIFICOS MARCO TEORICO ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS DIAGNOSTICO TRATAMIENTO METODOLOGIA TIPO DE ESTUDIO CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION RECURSOS INSTITUCIONALES RECURSO HUMANO CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS RESULTADOS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS HALLAZGOS DE LABORATORIO CURVA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA RESULTADOS DE ELECTROFORESIS 1D RESULTADOS DE 2D-PAGE Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI- TOF 51

6 6. DISCUSION CONCLUSIONES 56 BIBLIOGRAFIA 57 ANEXOS 60

7 LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito 24 Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía 29 Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes 47 Tabla 4. Antecedentes personales y familiares 49 Tabla 5. Características de laboratorios 50

8 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Malla del citoesqueleto. Modificado de William s Hematology 7ª edición. 18 Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito. 21 Figura 3. Principales métodos proteómicos. 35 Figura 4. Diferencia de expresión de los pacientes con EH versus los controles 52

9 LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo A. Consentimiento informado 61 Anexo B. Curvas de fragilidad osmótica 62 Anexo C. Gel de Coomasie donde se observan las proteínas similares(cuadros verdes) y diferentes(cuadros rojos) de los pacientes versus los controles 70 Anexo D. Electroforesis en 2D-PAGE, donde se observa las proteínas que se expresan en los pacientes con respecto a los controles. 71 Anexo E. Geles en 2D-PAGE: se observan las diferencias entre los controles y el paciente 3 (subrayado por un cuadro rojo) 72 Anexo F. Resultados de espectrometría de masas de algunas de las proteínas identificadas en los geles de los paciente 73

10 INTRODUCCION La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa de anemia hemolítica más frecuente en todo el mundo y es secundaria a alteraciones o deficiencias en las proteínas del citoesqueleto del eritrocito principalmente la espectrina, la ankirina, banda 3 y banda 4.2, entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos étnicos y raciales, con mayor prevalencia en la raza blanca. Tiene una incidencia que varía entre 1 por cada a nacidos vivos dependiendo del sitio geográfico; lamentablemente no hay estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia y la prevalencia de esta enfermedad. Las manifestaciones clínicas son muy variadas por su comportamiento genético que es también heterogéneo. Es autosómica dominante aproximadamente en el 75% de los casos y en el restante es: autosómica recesiva, autosómica dominante con penetrancia variable o por mutaciones de novo. El estudio y diagnóstico de la EH en nuestro medio es relativamente sencillo en aquellos pacientes con antecedentes familiares y con un cuadro clínico y examen físico clásico, el cual se complementa con los estudios de laboratorio que de manera indirecta nos ayudan al diagnóstico. Pero el problema son los pacientes con enfermedades leves o portadores (con rasgo) porque pueden cursar con síntomas mínimos o incluso asintomáticos y las pruebas diagnósticas de rutina pueden no revelar el diagnóstico por su baja sensibilidad en estos casos. Los estudios de laboratorio generales son: cuadro hemático con evaluación de la hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media y concentración de hemoglobina corpuscular media, conteo de reticulocitos corregido, frotis de sangre periférica, Coombs directo y fraccionado y curva de fragilidad osmótica. Se complementa con: bilirrubina total y diferencial, ecografía 10

11 de abdomen superior para evaluar el tamaño del bazo y la presencia de cálculos en la vesícula biliar. Una de las pruebas confirmatorias es la electroforesis de proteínas de membrana del glóbulo rojo en gel de poliacrilamida solubilizada en sodio dodecil sulfato (SDS- PAGE, de sus siglas en ingles) con la cual se puede identificar la ausencia única o combinada de las proteínas del citoesqueleto y del cual hay sólo un estudio en Colombia realizado por Torres et al (1) quienes describieron las características clínicas y de laboratorio de 29 pacientes adultos con EH y a quienes se les practicó electroforesis de proteínas de membrana del eritrocito en SDS-PAGE, encontrando mayor deficiencia de Banda 3 que de espectrina a diferencia de lo descrito en la mayoría de estudios y finalmente plantean completar los datos con estudios de biología molecular. Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología Molecular permiten la evaluación simultánea de las características genéticas y proteicas de una muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes campos de la medicina con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están las llamadas técnicas omic : Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes (analizados por la genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la transcriptómica). Hasta este nivel hay cierto grado de variabilidad generado por inicios, transcripción y procesamientos de intrones alternativos. La mayoría del ARN es traducido para generar proteínas (evaluadas por la proteómica). En este último proceso existe un alto nivel de heterogeneidad ya que la proteína recién sintetizada puede experimentar multitud de modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con relevante significado funcional (2). Finalmente, el futuro en el diagnóstico, pronóstico y establecimiento de factores de riesgo de las enfermedades en general, se realizarán con técnicas moleculares como la proteómica que ayudará a establecer el significado funcional de las diferentes proteínas en los tejidos. Para el diagnostico de EH, no se realizan, hasta el momento, estudios electroforéticos 11

12 de rutina y menos estudios de proteómica pues por su complejidad y costo, sólo se puede acceder a esta tecnología en muy pocos centros de investigación a nivel mundial. Para los estudios de proteómica se emplea el sistema de electroforesis en 2 dimensiones (2D) que separa las proteínas por cargas y peso molecular y luego sobre el gel se hace la identificación y aislamiento de spots diferentes, luego se realiza la extracción de la proteína mediante digestión enzimática con tripsina y se determina el patrón peptídico empleando espectrometría de masas. Este patrón se compara con la masa esperada de las proteínas incluídas en potentes bases de datos (como DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un listado de posibles candidatos (2). Dentro del estudio de la EH es muy importante conocer la alteración de la proteína de del citoesqueleto de la membrana del glóbulo rojo, primero para confirmar el diagnóstico, establecer cuál es el déficit más frecuente, asociarlo con la severidad de la enfermedad, las alteraciones genéticas y finalmente para el manejo y el pronóstico. En nuestro medio no es posible realizar las pruebas de proteómica, pero conociendo la importancia de desarrollar esta técnica en nuestro país y especialmente en patologías hematológicas, este hecho nos llevó a plantear este estudio en pacientes con esferocitosis hereditaria (EH) en quienes se propone encontrar el déficit de proteínas de membrana pero además encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o proteínas alteradas por medio del estudio de masas. Es así como se realizó la toma de muestras de sangre de pacientes con EH que asisten a control de Hematología Pediátrica en la Fundación Hospital de la Misericordia, luego se llevó a cabo el aislamiento de las membranas del eritrocito en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia y posteriormente se realizó la electroforesis en 2D y la identificación de la(s) proteína(s) deficitaria(s) o alterada(s) con respecto a los controles, en el Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela en España con colaboración del grupo del Dr Justo Castaño en la Universidad de Córdoba. 12

13 1. JUSTIFICACIÓN La EH es la anemia hemolítica más frecuente en el mundo, causada por alteración en las proteínas de citoesqueleto del glóbulo rojo, de carácter hereditario autosómica dominante en un poco más del 70% de los casos, con una gran variabilidad en las manifestaciones clínicas desde asintomáticos en aquellos pacientes portadores hasta anemias severas, ictericia, esplenomegalia y requerimientos transfusionales. El diagnóstico es relativamente sencillo en los casos severos y moderados, pero la dificultad es en aquellos portadores asintomáticos o con mínimos síntomas, en los cuales las pruebas con las que contamos en nuestro medio no pueden confirmarlo por su baja sensibilidad. Los estudios básicos son: cuadro hemático completo para evaluar: hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio, concentración de hemoglobina corpuscular media, conteo de reticulocitos corregido, frotis de sangre periférica, además de Coombs directo y fraccionado y curva de fragilidad osmótica. Con esta última se confirma el diagnóstico, pero es una prueba con baja sensibilidad y frecuentes falsos positivos. Otro estudio de laboratorio de mayor complejidad y que no está estandarizado en nuestro medio para su realización de rutina en el diagnóstico de EH, es la electroforesis de proteínas del citoesqueleto del glóbulo rojo en SDS-PAGE. En Colombia sólo hay publicado un estudio realizado entre 1995 y 1997 por Torres et al, quienes hacen la descripción de las características clínicas de 29 pacientes adultos con EH y realizan posteriormente electroforesis en SDS-PAGE demostrando que la deficiencia más frecuente en este grupo es de Banda 3, a diferencia de lo reportado a nivel mundial. Finalmente concluyen que este estudio se debe confirmar con estudios de Biología Molecular (1), como serían los de 13

14 genómica (estudios de las alteraciones en los genes), transcriptómica (estudio de la trascripción del ARN) y proteómica (estudio de la codificación de las proteínas), técnicas de alta complejidad y con las cuales se cuentan en laboratorios de investigación de alto nivel. Con el advenimiento de nuevas técnicas de estudio en Biología Molecular en Medicina, como es la genómica, transcriptómica y ahora la proteómica, se planteó y realizó un estudio piloto de Proteómica en los pacientes con EH que asisten a la consulta de Hematología Pediátrica en la Fundación Hospital de la Misericordia para confirmar el diagnóstico, determinar la alteración más frecuente en las proteínas del citoesqueleto y su relación con la severidad clínica, el tratamiento quirúrgico y con la pruebas diagnósticas disponibles de rutina en el Hospital, además se quiere encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o proteínas alteradas en las membranas de eritrocitos de los pacientes con EH que puedan ayudar a explicar la adaptación de los glóbulos rojos a la mutación de las proteínas que generan la EH. 14

15 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Realizar y estandarizar las pruebas de electroforesis en 2D-PAGE y espectrometría de masas MALDI-TOF de proteínas de membrana del eritrocito a pacientes que consultan en la Fundación Hospital de la Misericordia con diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) y compararlas con las de individuos sanos para detectar la deficiencia de proteínas de membrana e identificar la modificación de otras. 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Identificar por estudios moleculares las alteraciones en las proteínas de la membrana del eritrocito en pacientes con diagnóstico de EH. Establecer la posible relación entre los estudios moleculares de las proteínas de membrana del eritrocito con los resultados de laboratorio de los pacientes con diagnóstico de EH. Establecer la posible relación entre los estudios moleculares de las proteínas de membrana con las características clínicas de los pacientes con diagnóstico de EH. Encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o proteínas modificadas en la membrana de los eritrocitos de pacientes con EH. 15

16 3. MARCO TEORICO La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa más frecuente de anemia hemolítica y es secundaria a deficiencias en las proteínas de la membrana y del citoesqueleto del eritrocito como son principalmente la espectrina, ankirina, banda 3, banda 4.2, entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos raciales, con mayor prevalencia en la raza blanca provenientes del norte de Europa. Tiene una incidencia que varía entre 1 por cada a nacidos vivos dependiendo del sitio geográfico, como en Europa donde alcanza a 1 en 2000 nacidos vivos, como se deduce de los estudios realizados en Alemania y Escandinavia, en donde a donadores de sangre se les realizó la prueba de fragilidad osmótica, encontrándose que el 1% estaban alteradas (3). Lamentablemente no hay estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia y la prevalencia de esta enfermedad. Las manifestaciones clínicas son muy variadas y dependen de las alteraciones genéticas que también son heterogéneas. Es autosómica dominante aproximadamente en el 70% de los casos; no se ha detectado homocigotos posiblemente porque es incompatible con la vida (4,5). En el restante es: autosómica recesiva, autosómica dominante con penetrancia variable o son mutaciones de novo. 3.1 ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA La membrana del glóbulo rojo es aproximadamente el 1% de su peso. Está conformada por dos grandes estructuras: la primera, la bicapa lipídica que en un 80% son fosfolípidos y colesterol y el 20% restante son glicolípidos y aminofosfolípidos; una característica de la bicapa es que los fosfolípidos son distribuídos asimétricamente: fosfatidilcolina y esfingomielina se localizan en la 16

17 monocapa externa mientras que la fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina (PS) y fosfoinosítidos en la monocapa interna. Las proteínas escramblasas y flipasas, han sido implicadas en la función de mantener esta asimetría de la bicapa lipídica, la cual tiene importancia fisiológica porque la PS y los fosfoinositidos interactúan con las proteínas del citoesqueleto, espectrina y proteína 4.1R, para anclarlas a la bicapa lipídica y darle estabilidad. Por otro lado, la pérdida de la asimetría de la bicapa, resulta en traslocación de la PS a la monocapa externa, favoreciendo el reconocimiento y la fagocitosis por el macrófago. Este tipo de reconocimiento juega un papel importante en la destrucción prematura en el caso de células falciformes y de talasemias (6,7). La segunda, por proteínas integrales y periféricas. Las proteínas integrales se han descrito más de 50 y van de varios cientos a más de un millón de copias por eritrocito; aproximadamente 25 de estas proteínas son antígenos de subgrupos sanguíneos. Las proteínas periféricas conforman el citoesqueleto en la cara citoplasmática de la membrana e interactúan entre sí y con los filamentos y túbulos del citoesqueleto creando una malla que es importante para la estructura y estabilidad y le confieren las propiedades viscoelásticas al eritrocito. Entre estas proteínas periféricas se destacan: la espectrina, ankirina (bandas 2.1, 2.2, 2.3, y 2.6), banda 4.1, banda 4.2, banda 4.9, aducina, tropomiosina y banda 7 (8) Proteínas del citoesqueleto. El citoesqueleto del glóbulo rojo está constituido primordialmente por: espectrina con sus cadenas α y β, proteínas 4.1R, y actina. Están conectadas entre sí en dos sitios: primero, dos o más dímeros de α y β espectrina se articulan cabeza con cabeza (como se explica más adelante) en el sitio de unión (self association). Segundo, la parte final de los tetrámeros de espectrina convergen formando un complejo de unión (caja C en la figura 2) donde la proteína 4.1R interactúa con su dominio de 10 kd con la región N-terminal de la cadena beta de espectrina, manteniendo los tetrámeros juntos. Participan también en este complejo filamentos cortos de actina y una variedad de otras proteínas (demantina (proteína 4.9), β aducina, tropomiosina, tropomodulina). 17

18 De una manera simplificada la malla básica del citoesqueleto es un hexágono, donde los lados y los radios están formados por los tetrámeros de espectrina y en la mitad de estos están los puntos de unión de las cadenas de espectrina y los puntos de convergencia son los complejos de unión (5). Figura 1. La espectrina conforma una red localizada en el lado citoplasmático de la bicapa lipídica de la membrana. Cada proteína de espectrina tiene una cadena α y otra β constituídas por repeticiones de 106 aminoácidos que forman hélices y se enrollan de forma antiparalela. Los heterodímeros α y β forman tetrámeros al unirse cabeza con cabeza en el sitio conocido como el punto de unión donde la porción NH2- terminal de α espectrina se une con la COOH-terminal de β espectrina. Otros residuos terminales de los heterodímeros de espectrina se asocian con las proteínas 4.1R y actina (Figura 2). La unión vertical de la espectrina a la bicapa lipídica involucra dos proteínas transmembrana: la banda 3 y la glicoforina C las cuales se encuentran unidas formando dímeros y oligómeros móviles que pueden variar en su configuración dándole flexibilidad al glóbulo rojo. Las anormalidades de la espectrina, llevan a una inestabilidad de la bicapa lipídica con pérdida progresiva de ésta, alterando la relación volumen-superficie del eritrocito(3) Figura 1. Malla del citoesqueleto. Modificado de William s Hematology 7ª edición. COMPLEJOS DE UNION Fuente: Autor ESPECTRINA 18

19 3.1.2 Proteínas transmembrana. La Banda 3 (AE-1) es la principal proteína integral siendo aproximadamente el 30% de las proteínas de la membrana. Hace parte de la familia de proteínas de intercambio aniónico, AE 0-3 (de las siglas en inglés de Anion Exchanger) y está involucrada en un gran número de actividades fisiológicas que tiene que ver con el volumen y la osmolaridad celular, intercambio de iones de cloro y bicarbonato, envejecimiento del eritrocito, unión con IgG y remoción celular y finalmente con el mantenimiento de la integridad estructural de las células. Se encuentra en todas las membranas celulares e incluso de organelas como las mitocondrias, el aparato de Golgi y el núcleo. Se han descrito más de 50 mutaciones del gen de Banda 3 algunas de las cuales generan diferentes enfermedades como ovalocitosis (una deleción de 9 aminoácidos de los residuos 400 al 408), acidosis tubular renal distal que puede estar asociado con ovalocitosis. Alteraciones en Banda 3 también son asociadas a enfermedades neurológicas tales como disquinesia paroxística familiar, epilepsia generalizada idiopática y neuroacantosis. La mutación en el gen de Banda 3 también genera la EH, que se comporta como deficiencia ya sea porque la proteína mutada no se incorpora dentro de la membrana o por que no es funcional (9). En la cara externa la Banda 3 porta glicanos N- y/o O- algunos de los cuales son antígenos del grupo sanguíneo (sistema ABO)(6). Su dominio citoplasmático N- terminal media el anclaje del citoesqueleto através de la Ankirina-1 y se une a varias enzimas importantes para el control de la glicolisis. El dominio transmembrana C-terminal tiene 12 segmentos y contiene el canal de intercambio aniónico para el bicarbonato y cloro, permitiendo el transporte de dióxido de carbono de los tejidos a los pulmones. Existe como dímero y tetrámero que interactúa con la Ankirina, la cual a su vez se une a la beta espectrina y a la Proteína 4.1R (banda 4.1R) en su dominio N- terminal. La banda 3 se une también a la Proteína 4.2 para dar más estabilidad al citoesqueleto (Ver grafica 2)(5). La Banda 3 es el centro del complejo Banda 3 (caja A en Figura 2) el cual está compuesto por: ankirina-1; proteína 4.2 y Glicoforina A. Con este está asociado el 19

20 complejo Rh que incluye 5 proteínas: polipéptido Rh, glicoproteína asociada a Rh, el CD 47, glicoforina B y glicoproteína Landsteiner-Wiener, una glicoproteína integral de membrana de 241 residuos y miembro de la superfamilia de Ig (caja B en figura 2)(5). Las proteínas que unen glicosilfosfatidilinositol (GPI-proteins: glycosylphosphati dylinosito l-linked proteins) están en la cara externa de la bicapa lipídica y unida a su estructura por glicanos cortos y complejos y residuos de fosfatidilinositol. Están involucradas en la hemoglobinuria paroxística nocturna (Figura 2). Las glicoforinas son las glicoproteínas integrales más abundantes del eritrocito. Están compuestas de un único dominio extracelular hidrofílico N-terminal, un dominio transmembrana y una cola intracelular C-terminal. Estudios de genómica han revelado que las glicoforinas se pueden dividir en dos diferentes grupos, el primero, las glicoforinas A y B son homólogas entre sí y son codificadas por dos genes que están estrechamente relacionados, el segundo, son las glicoforinas C y D que derivan de un único locus, pero se diferencias por el uso de un inicio de traslación creado por splicing alternativo (3). Las glicoforinas por tener ácido siálico en la porción N terminal extracelular, son las responsables de más del 60% de la carga negativa de la superficie del eritrocito, lo cual modula las interacciones entre eritrocito y eritrocito y entre eritrocito-endotelio. La Glicoforina C interactúa con la proteína p55 y con la proteína 4.1R, que a su vez se une a la cadena β de la espectrina, desempeñando un papel fundamental en la estabilización del citoesqueleto. Las glicoforinas sirven como receptores a algunos agentes infecciosos como el Plasmodium falciparum, además son portadoras de algunos antígenos del grupo sanguíneo como MN, Ss, Miltenberger V entre otros (3) Proteínas de unión. Estas moléculas median la unión entre las proteínas del citoesqueleto y las de transmembrana. Primero, la Ankirina-1 une la Espectrina (en el dominio 15 de la cadena β porción C-terminal) a la Banda 3 en su dominio citoplasmático. La Proteína 4.2 juega un papel aún no bien definido en esta 20

21 interacción. Segundo, la función principal de la proteína 4.1R es unir la red de espectrina con las proteínas de transmembrana Glicoforina C/D (5). Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito. Actina Tropomiosina Ankirina-1 α-espectrina β-espectrina Interacciones verticales a Interacciones horizontales Caja A: Complejo Banda 3, Caja B: Complejo Rh, Caja C: Complejo de unión, Caja D: espectrina. GPA: glicoforina A, GPC/D: glicoforina C/D, GPI: (glycosylphosphatidylinositol-linked protein) proteína que une glicosilfosfatidilinositol, LW: glicoproteína Landsteiner-Wiener, RhAG: (Rhassociated glycoprotein) glicoproteína asociada a Rh, Rh: polipéptidos de Rh. Fuente: Delaunay J. The molecular basis of hereditary red cell membrane disorders. Blood Reviews 2007; 21: La proteína 4.1R interactúa con la espectrina mediante uno de sus dominios en el complejo de unión y con otro dominio se une a la glicoforina C/D inmediatamente al lado del complejo de unión (5). 21

22 La proteína p55 es un miembro de la familia MAG-UK (Homólogas de la guanilato kinasa asociada a membrana, de las siglas en inglés de membrana-associated guanylate kinase homologues) y contiene un dominio PDZ, que interactúa con 4.1R y Glicoforina C/D. Estos dominios PDZ, están en proteínas localizadas en sitios submembranosos especializados y parecen tener una función de receptores, canales iónicos y de señalización intracelular (5). La ankirina es una proteína polar que se puede separar en tres dominios funcionales: un dominio N-terminal unido a la membrana, que tiene sitios de unión para banda 3, otro dominio intermedio que tiene sitios de unión para espectrina y otro dominio C-terminal con funciones regulatorias de unión entre ankirina y las otras proteínas. El dominio regulatorio C-terminal, tiene múltiples isoformas generadas por splicing alternativo; una de estas isoformas (ankirina 2.2) tiene mayor afinidad y se une más fuertemente a la espectrina y a Banda 3 (3). Las anomalías de ankirina son las más frecuentes en la EH por su importancia en la unión entre la bicapa lipídica por medio de la banda 3 y con el citoesqueleto através de la espectrina. Los estudios moleculares han permitido conocer la localización cromosómica de estas proteínas así como la secuencia de cada uno de los genes (Tabla1). Las interacciones de las proteínas integrales y del citoesqueleto son fundamentales para la estabilidad e integridad de la membrana y son de dos tipos: Verticales: que fijan el citoesqueleto a la doble capa lipídica y están dadas por la unión entre espectrina y banda 3 por medio de ankirina y regulada por proteína 4.2 como también por la unión de proteína 4.1R y banda 3. Horizontales: son responsables de la estabilidad global del citoesqueleto y se establecen por la unión entre moléculas de espectrina para formar dímeros y oligómeros de mayor peso molecular y por la unión entre espectrina, actina y la proteína 4.1R, regulada por la proteína 4.9 (8). (ver figura 2). 22

23 Las proteínas de la membrana del glóbulo rojo tienen una gran variedad de isoformas por cambios postraduccionales o postranslacionales generados por mecanismos de splicing alternativo. Esto hace que a pesar de provenir de un mismo gen y gracias al splicing alternativo, las isoformas puedan estar en diferentes células o incluso en las mismas células en diferentes organelas o en el mismo lugar subcelular con diferentes estados de diferenciación (3). 3.2 ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA El defecto primario es en las proteínas de membrana y del citoesqueleto del eritrocito incluyendo espectrina α y β, ankirina y proteína 4.2. Puede ser cuantitativo o cualitativo, causando inestabilidad del citoesqueleto y fragilidad de la membrana llevándola a formar microvesículas en los puntos en los cuales no hay proteínas ancladas y pérdida de superficie con disminución en la relación entre superficie y volumen del eritrocito tornándose esférico, más sensible a los cambios de volumen y menos flexible, lo que hace que sea más fácilmente atrapado en los sinusoides del bazo y destruído por el sistema retículo-endotelial (3,8,10). Esto hace que el bazo sea un órgano importante en la fisiopatología de la hemólisis que sufren los pacientes con EH, la cual como vemos es secundaria a los defectos de membrana (5). También se ha descrito que los esferocitos son vulnerables a las alteraciones metabólicas llevándolos más rápidamente a la autohemólisis cuando se incuban en ausencia de glucosa. Esto se explica porque los esferocitos en ausencia de glucosa se depletan más rápidamente de ATP, lo que causa una falla en la bomba de cationes, penetrando agua y sodio intracelular. Si continúan los niveles bajos de ATP, también falla la bomba de calcio causando una salida de potasio, cambiando la osmolaridad intracelular y saliendo agua deshidratándose el eritrocito. Los esferocitos son muy susceptibles a estos cambios de osmolaridad lo que también causa vesiculación de la membrana predominando sobre la disminución del volumen y se produce la auto hemólisis (8). 23

24 Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito Banda el GEL SDS- PAGE Proteína Localización Cromosómica Símbolo del gen Tamaño del gen (Kb) Número de exones Número de amino ácidos PM (kd) aprox / deducido PI 1 α-espectrina 1q22-25 SPTA /241 4,96 2 β-espectrina 14q SPTB > /246 4, Ankirina 8p11.2 ANK1 ~ /206 5, α-aducina β-aducina 4p16.3 2p13-14 ADDA ADDB 85 ~ /81 97/80 3 Banda 3 17q12-21 EPB /102 5, Proteína 4.1 1p EL1 > / Palidina 15q15-21 ELB /27 5, Demantina p55 β-actina tropomodulina 8p21.1 Xq28 7pter-q22 9q22 - MPP1 ACTB TMOD - - > /43 55/53 43/42 43/41 6 G3PD 12p13 G3PD /36 7 Estomatina Tropomiosina pi: punto isoeléctrico Fuente: Autor 9q34.1 1q31 EPB72 TPM /31 27/28 24

25 Por otro lado en la dinámica del atrapamiento esplénico, aún no está claro cuál es el mecanismo de la hemólisis. Se sabe que los esferocitos son selectivamente atrapados por el bazo, produciendo una pérdida de la membrana y la eventual hemólisis. El tiempo de tránsito en el bazo se correlaciona inversamente con la supervivencia del glóbulo rojo, pero también hay evidencia que el bazo genera cambios metabólicos y de ph en el esferocito lo que acelera su autohemólisis (8,11) Defectos de las proteínas de membrana. El estudio de la membrana del eritrocito ha revelado varios defectos cualitativos y cuantitativos en la EH. En frecuencia, las alteraciones son: Deficiencia de ankirina combinada con deficiencia de espectrina Deficiencia de banda 3 Deficiencia aislada de espectrina Deficiencia aislada de banda 4.2 (3,12) Ankirina. La deficiencia de ankirina junto con espectrina es la más frecuente en EH y se han incluído varios mecanismos desde disminución en la síntesis de ankirina, disminución en el ensamble o un ensamble anormal lo cual lleva a que la espectrina no se una a la membrana. Tiene un patrón hereditario autosómico dominante (AD) pero no es infrecuente que también sean debidas a mutaciones de novo dentro de una familia (5). La mayoría son mutaciones nonsense o de cambio en el marco de lectura lo que genera una ankirina defectuosa y/o deficiente (3). Con una excepción, todas las mutaciones descritas en el gen ANK-1 son individuales y no se repiten en otras familias. El cuadro clínico puede ser moderado, pero generalmente no requieren de trasfusión al menos durante el primer año de vida (8). En pacientes con herencia autosómica recesiva (AR) han sido descritas variantes genéticas en el promotor del gen de ANK-1, pero no se ha revelado la importancia funcional de esta mutación. 25

26 No se han reportado casos homocigotos en humanos, sin poder aclarar si esta condición es incompatible con la vida (8). Se han descrito pacientes con EH por deficiencia de ankirina, con dismorfismo, retardo psicomotor e hipogonadismo. Estos pacientes sufren de un síndrome de gen contiguo que incluye el locus del gen ANK-1, 8p11.2. Banda 3. Las mutaciones en el gen de banda 3 (SLC4A1) tienen un patrón de herencia AD. En los heterocigotos todas las mutaciones son en los dominios transmembrana y citoplasmático con un cuadro clínico de hemólisis moderado (8). Un subgrupo de pacientes tienen disminución del 20 al 30% de banda 3 concomitante con proteína 4.2, con un cuadro leve a moderado y esferocitos pincered en el frotis de sangre periférica (3,13). Hay una gran variabilidad en la expresión de la mutación lo cual hace que el cuadro clínico no sea siempre severo. Se han descrito 3 grupos de homocigotos para mutaciones de banda 3 en humanos dentro de familias consanguíneas: Banda 3 Coimbra, Neapolis y Algerian. Excepto por un grupo, las demás tiene algunas proteínas banda 3 en las membranas celulares. En su mayoría se asocian a acidosis tubular renal distal. Lo que es importante resaltar es que a pesar de la ausencia de la proteína banda 3, pueden ser compatibles con la vida con determinados tratamientos a diferencia de la ausencia de ankirina o espectrina las cuales como se ha visto no son viables (8,13). Espectrina. Los esferocitos de muchos pacientes son en su mayoría deficientes de espectrina. El grado de deficiencia de espectrina se correlaciona bien con la esferocidad del eritrocito, la habilidad para soportar las fuerzas de cizallamiento, el grado de hemolisis y la respuesta a la esplenectomía (3,8,12,13) 26

27 Las mutaciones de α-espectrina son AR mientras que las de β-espectrina son AD, esto es debido a que la cadena α de la espectrina se sintetiza en exceso comparada con la de la β espectrina, haciendo que una reducción en la síntesis de esta última tenga una mayor efecto en la configuración del citoesqueleto en los pacientes heterocigotos (autosómica dominante), (12,14). Al final el grado de deficiencia de espectrina y de la cadena α o β, se asocia con la severidad de la hemólisis (13,14). Proteína 4.2. La variedad de EH por mutación en el gen EPB42 es rara y tiene una herencia AR. El cuadro clínico usualmente es de sintomatología moderada (8). Se han descrito 9 mutaciones hasta ahora y la mayoría en el Japón. La deficiencia de proteína 4.2 también se ha asociado a mutaciones en el dominio citoplasmático de banda 3 por compromiso de los sitios de interacción entre estas proteínas Herencia. Los genes implicados son los de α y β espectrina, banda 3, ankirina y proteína 4.2. Entre el 50 y 75% de los casos, la EH es AD. En los restantes pacientes puede ser AR o mutaciones de novo. Los casos de herencia AR resultan en defectos de α-espectrina o proteína 4.2. Unos pocos casos de EH resultado de mutaciones homocigotos o heterocigotos compuestos en banda 3 o espectrina dan como resultado anemias hemolíticas severas en el periodo neonatal o muertes fetales por hidrops (3). Un estudio realizado en Italia con 80 niños con diagnóstico de EH de diferente severidad pero con padres normales, demostró que las mutaciones de novo dominante son 6 veces más frecuentes que las mutaciones recesivas, lo cual debe ser tenido en cuenta para consejería genética de una pareja normal con un hijo con EH (15). 27

28 3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS Las manifestaciones clínicas son muy heterogéneas. El cuadro clínico típico combina manifestaciones de hemólisis (ictericia, esplenomegalia y anemia con reticulocitos elevados) con extendido de sangre periférica con esferocitosis y antecedentes familiares positivos (3). La severidad del cuadro es variable, desde asintomático en los casos de portadores hasta severo con todo el cuadro clínico evidente. Se puede clasificar como: portador (rasgo), leve, moderada (también denominada típica) y severa, dependiendo del valor de Hb, bilirrubinas, reticulocitos y de la concentración de espectrina en el glóbulo rojo (esta última se correlaciona con la severidad de la hemolisis) (Tabla 2). Portadores asintomáticos: corresponden a menos del 2% de los pacientes. Presentan mínimos síntomas o generalmente asintomáticos. Pueden ser un miembro de una familia con herencia AR con laboratorios ligeramente alterados, elevación leve de reticulocitos, aproximadamente 2%, escasos esferocitos y fragilidad osmótica incubada alterada. También pueden ser mutaciones nuevas dentro de una familia, lo que aparentaría una herencia AR, por lo que siempre es importante el estudio de la familia (3,8,16). Los casos de esferocitosis leve son aproximadamente entre el 20 y 30%. Presentan una hemólisis ligera compensada con valores de Hb normales. La sintomatología es mínima, cursan con esplenomegalia e ictericia muy leves lo que hace difícil el diagnóstico y generalmente se encuentran en estudios de rutina de EH familiar. También se pueden manifestar durante una infección viral por ejemplo Parvovirosis, con anemia, esplenomegalia e ictericia (3; 8). La esferocitosis típica se presenta en la mayoría de los pacientes con EH AD y pueden ser entre el 50 y el 60% de los casos. Se presenta con una hemólisis descompensada y anemia moderada. Se puede manifestar con ictericia en niños, pero también en adultos y asociado a esplenomegalia leve entre 2 a 6 cm de su 28

29 tamaño, generalmente después de una infección viral por la estimulación que produce del sistema reticuloendotelial. Los requerimientos trasfusionales son ocasionales y generalmente son después del primer año de vida (3,8). Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía CLASIFICACIÓN RASGO LEVE MODERADA SEVERA Hb (g/dl) > Conteo de reticulocitos Bilirrubina T. (mg/dl) Espectrina por eritrocito (% del normal) Esplenectomía Normal (<3%) 3-6% > 6 % > 10 % < > No requerida Usualmente no necesaria Necesaria antes de la pubertad Necesaria, en lo posible > 6 años Modificado de: Bolton-Maggs PHB. The diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Baillère s Clinical Haematology. 2000; 13: Fuente: Autor La esferocitosis severa, se presenta en el 5 al 10% de los casos, con ictericia y anemia severa que requiere múltiples trasfusiones. Se manifiesta generalmente desde recién nacido con ictericia intensa que requiere incluso exsanguinotransfusión. Se presenta en la EH tanto AD como AR, generalmente por mutaciones en el gen de la α-espectrina. Dentro de las complicaciones más frecuentes esta el retardo en el crecimiento, retardo en la maduración sexual y anemias aplásicas transitorias. El tratamiento de elección es la esplenectomía. (3,8): 29

30 3.4 DIAGNOSTICO La esferocitosis hereditaria generalmente es fácilmente sospechada por el cuadro clínico, los laboratorios de rutina y cuando existen antecedentes familiares, pero hay varias situaciones que pueden hacer difícil el diagnóstico como la anemia hemolítica neonatal o durante una crisis hemolítica aguda, o cuando no hay antecedentes familiares y es una mutación de novo o cuando uno de los padres es un portador asintomático o en otras patologías que también aumentan la relación superficie-volumen de los glóbulos rojos como en la ictericia obstructiva, la deficiencia de hierro, las talasemias, la deficiencia de vitamina B12 o folato y las hemoglobinopatías SC que pueden mimetizar una EH. El diagnóstico por laboratorios se basa fundamentalmente en el hemograma en donde se puede encontrar la Hb baja, el volumen corpuscular medio (VCM) normal o levemente disminuída, la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) alta (entre 35 y 38%) y el aumento en el conteo de los reticulocitos. En el extendido de sangre periférica típico se debe encontrar un número variable de esferocitos (eritrocitos de menor tamaño y sin el halo claro central), estando presentes en un 3 al 5% en las formas leves y en un 25 al 30% en las formas moderadas. Con menor frecuencia se encuentran esferocitos pequeños y densos, eritrocitos con formas bizarras y anisocitosis y poiquilocitosis. Se han descrito características morfológicas específicas de ciertos déficits como los esferocitos pincered (por déficit de banda 3) y esfero-acantocitos (por déficit de β-espectrina). También se analizan los niveles de bilirrubinas total y diferencial y se realiza ecografía de abdomen superior para evaluar tamaño del bazo y presencia de colelitiasis. Dentro de los estudios de laboratorio para completar el diagnóstico se encuentran: 30

31 Test de fragilidad osmótica: se basa en la fragilidad aumentada que tienen los esferocitos a la solución salina hipotónica en comparación con las células normales (22). Este test tiene como desventajas en primer lugar la baja sensibilidad, en donde los casos leves hasta el 20% pueden ser omitidos después de la prueba con incubación. No es fiable en pacientes con escaso número de esferocitos incluyendo los transfundidos y finalmente no diferencia la esferocitosis causada por trastornos inmunológicos, deficiencia de hierro o ictericia obstructiva. La fragilidad osmótica se encuentra incrementada en el 66% de los pacientes con EH no esplenectomizados. Se considera que la prueba de resistencia osmótica está disminuída cuando existe evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina 0,55g/dl. Según la clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se divide en tipo I si había desplazamiento de la curva hacia la derecha con hemólisis que inicia en concentraciones de solución salina de 0,55g/dl. Curva de resistencia osmótica disminuída tipo II cuando hay desplazamiento de la curva hacia la derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl y curva de resistencia osmótica disminuída tipo III si hay desplazamiento de la curva hacia la derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85 g/dl (1,17) Test de lisis con glicerol: útil en neonatos porque la cantidad de muestra requerida es mínima. Se realiza colocando una mezcla de solución salina de glicerol hipotónica a la muestra de sangre con anticoagulante y tomando el tiempo en que la densidad óptica medida por espectrofotometría cae al 50% de la inicial (50%de lisis); los eritrocitos normales toman más de 30 minutos y los esferocitos tiene un rango de 25 a 150 segundos. Tiene igual sensibilidad que el test de fragilidad osmótica (16,18). No disponible en Colombia como prueba de rutina. 31

32 Gradiente osmótico ektacitométrico: es un examen muy sensible, pero de alto costo, que requiere de experiencia por parte del operador. Mide con un láser los cambios de forma del glóbulo rojo al ser expuesto a fuerzas de cizallamiento. Ventaja: distingue curvas entre EH, Eliptocitosis hereditaria y drepanocitosis (16,18). No se dispone de esta prueba en Colombia. Citometría de flujo: se emplea una sonda fluorescente que reacciona con la banda 3. Pacientes con esferocitosis hereditaria que tengan defecto en la espectrina, banda 3 o proteína 4.2 tienen disminución en la señal de fluorescencia, comparado con los controles, con neonatos o con pacientes con otras anemias. Tiene la ventaja de requerir un volumen muy pequeño de sangre y que los resultados se obtienen en pocas horas. Sensibilidad de 92.7% y especificidad de 99.1% (16,18). No se dispone de esta prueba estandarizada en Colombia (3,16,18). Análisis bioquímico de las proteínas de membrana de los glóbulos rojos: se realiza mediante separación por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE-SDS polyacrylamide gel electrophoresis in the presencia sodium dodecylsulate).que detecta defectos en las proteínas de membrana. Es una prueba especializada, tiene alto costo, es útil en los pacientes con diagnóstico poco claro y es una prueba confirmatoria de EH. No se hace de rutina en Colombia (3,16,18). Análisis genético molecular: está disponible en unos pocos laboratorios especializados. Busca identificar alteraciones en la expresión de las proteínas de membrana por mutaciones en los genes que las codifican. Varias técnicas han sido utilizadas como secuenciación de nucleótidos y amplificación del gen mutado con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (16,18). Técnicas de mapeo en 2D y espectrometría de masas: es una herramienta invaluable en la exploración de patologías relacionadas con defectos genéticos y alteraciones en las proteínas (19). Se realiza mediante el análisis de 32

33 mezcla de proteínas y la posterior identificación por espectrometría de masas. Es un método muy preciso, sensible y específico, con alta resolución y automatización, la desventaja es su alto costo y que se realiza a nivel de investigación en pocos centros especializados. No está disponible en Colombia y no hay estudios de proteínas de membranas en EH Proteómica. Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología Molecular permiten la evaluación simultánea de las características genéticas y proteicas de una muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes campos de la medicina con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están las llamadas técnicas omic : Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes (analizados por la genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la transcriptómica). En este nivel existe cierto grado de variabilidad generado por inicios, transcripción y procesamientos de intrones alternativos (splicing alternativo). La mayoría del ARN es traducido para generar proteínas (evaluadas por la proteómica). En este último proceso existe un alto nivel de heterogeneidad ya que la proteína recién sintetizada puede experimentar multitud de modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con relevante significado funcional y patológico (2,20). Alteraciones cuantitativas o cualitativas (estructura, localización y función) de una proteína, que son aspectos que son valorados mediante técnicas de proteómica, pueden ser biomarcadores de anomalías patológicas previas al desarrollo de manifestaciones clínicas, útiles marcadores diagnósticos o pronósticos. Es por estas características de la proteómica que está superando a la genómica como herramienta de análisis más amplio de los elementos relacionados con procesos fisiopatológicos y en la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos. La proteómica que en un inicio tenía el objetivo de identificar las proteínas que se modifican como causa de diferentes factores (genéticos o no), ahora permite conocer aspectos más profundos de la estructura, función, interacciones, las modificaciones postraduccionales e incluso la localización celular de las proteínas identificadas (2,20). 33

34 La técnica que se ha desarrollado para analizar mezclas de proteínas y que ha permitido que la proteómica evolucione se llama espectrometría de masas. Se trata de un método muy avanzado con alta precisión, sensibilidad (a nivel de fentomoles), especificidad, resolución y automatización. Existen diferentes equipos para preparar y cargar las proteínas en estos sistemas de espectrometría de masas, el más usado es el matrix assited laser desorption/ionization (MALDI). La muestra ionizada posteriormente se pasa a analizadores de masas, el más empleado es el time of flight (TOF). Primero se deben separar las proteínas de la muestra y hay dos aproximaciones: Empleando el sistema de electroforesis en 2 dimensiones (2D) que separa las proteínas por cargas y peso molecular y luego, sobre el gel, se hace la identificación y aislamiento de spots diferentes, identificación de la proteína mediante digestión enzimática con tripsina y determinación del patrón de masas peptídico empleando espectrometría de masas. Este patrón se compara con la masa esperada de las proteínas incluídas en potentes bases de datos (como DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un listado de posibles candidatos. También se puede separar por cromatografía líquida, un sistema multidimensional que separa proteínas usando cromatografía de intercambio iónico y de fases reversas, acoplado directamente a sistemas de espectrometría de masas o por trampa iónica, en este caso la ionización es distinta a la empleada en la espectroscopia de masas por MALDI-TOF, puesto que aquí la ionización es en fase líquida al aplicar un alto voltaje a la salida de la cromatografía líquida. El tipo de ionización se conoce como ESI. El empleo de uno u otro método depende de la proteína y de por cuál de los dos métodos se obtenga una mejor ionización de sus péptidos. En general este método detecta proteínas que no entran o no se separan fácilmente en geles 2-DE. Mediante el estudio sistemático y a gran escala de muestras sin separación electroforética de las proteínas para la identificación de perfiles proteicos. 34

35 Emplea como sistema el SELDI-TOF (surface enhaced laser/desorption ionization) de alta resolución tras capturar las proteínas de una muestra con diferentes chips analíticos (diferentes tipos de matrices que unen las proteínas de una muestra empleando distintas características físico químicas) Figura 3. Figura 3. Principales métodos proteómicos. a Las proteínas de una muestra se pueden separar 1) en geles 2D, 2) en cromatografía líquida y 3) por utilización de chips. LC: cromatografía líquida, MS: espectrometría de masas. Fuente: Corral J, González-Conejero R, Hernández-Espinosa D, Martínez C, Vicente V. Genómica y proteómica en hemostasia. Haematologica 2005;90:

36 La principal limitación de las técnicas proteómicas es la incapacidad de amplificar las proteínas, a diferencia de los ácidos nucleicos. También la gran heterogeneidad proteica de un tejido o plasma puede hacer que dos muestras de un mismo paciente sean ligeramente diferentes, lo que exige al menos repetir 3 veces la prueba para obtener resultados fiables (20). También se ha avanzado significativamente en el proteoma de las células, especialmente del eritrocito (21). Los trabajos realizados en estas células muestran un proteoma complejo, mayor del que se podía esperar (teniendo en cuenta que el 98% del citoplasma del eritrocito es Hb y que no tiene núcleo ni organelas) mostrando nuevamente las diferencias entre genómica y proteómica. Además de la Hb, el eritrocito tiene otras proteínas importantes para su metabolismo y su conformación estructural, e incluso otras funciones como las oxidativas e inflamatorias. Hasta el momento los estudios realizados en eritrocitos han detectado más de 1500 proteínas (22,23) que abarcan múltiples funciones (citoesqueleto, señalización, receptores de membrana, metabolismo intermediario), aunque el número real de proteínas es mucho mayor. En un estudio de proteómica del eritrocito (21) se identificaron 340 proteínas de membrana discriminadas así: 105 proteínas integrales, 54 unidas a la membrana, 5 como GPI, 40 del citoesqueleto, 21 como organelos, 41 del citoplasma (8 de las cuales tiene actividad en la glucolisis), 20 extracelulares y para 54 proteínas su localización subcelular no fue posible. Estos estudios de proteómica además permiten describir las proteínas y sus modificaciones implicadas en procesos específicos de la función del eritrocito. 36