PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD

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1 MEM. CONF. INTERNA MED. APROVECH. FAUNA SILV. EXÓT. CONV. 2014, 10: 2 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU POSIBLE CONTROL ANTI-PRIÓNICO Millán-González R (1) y Soler-Tovar D (2) 1 MV, Programa de Medicina Veterinaria, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle. Correo e: ricardmillango@gmail.com 2 MV, MSc, Profesor, Facultad de Ciencias Agropecuarias, e Investigador, Grupo de Investigación Epidemiología y Salud Pública, Universidad de La Salle. Correo e: diegosoler@unisalle.edu.co, dsolert@gmail.com. Resumen Los priones son proteínas del sistema nervioso, que cuando sufren cambios en su estructura protéica son responsables de generar enfermedades neurodegenerativas. Existe un gran interés por la alta estabilidad de estas moléculas. Estudios señalan que poseen una alta resistencia a ser inactivadas por varios agentes y que pueden persistir en la tierra años después de ser enterradas, generando una reserva de infectividad ambiental. En la medicina veterinaria existen varios animales domésticos susceptibles a estas enfermedades, pero en la medicina de animales silvestres sólo se ha registrado una familia: los cérvidos. El objetivo del artículo es recopilar la información más reciente y relevante de las enfermedades priónicas y analizar desde una perspectiva general la enfermedad debilitante crónica con el fin de facilitar el entendimiento del prion como agente etiológico, de los tipos de enfermedades priónicas y a manera de estudio de caso desarrollar la enfermedad priónica en vida silvestre. Las enfermedades priónicas en la medicina veterinaria de animales silvestres es en pocas ocasiones tema de estudio. Sin embargo, la resistencia de la proteína priónica junto con su propagación agresiva en los Estados Unidos y Canadá han convertido estas enfermedades en un tema de estudio relevante. La enfermedad debilitante crónica no aparenta ser zoonótica, pero en el pasado ha habido evidencia de enfermedades priónicas adaptándose y pudiendo afectar a humanos. El hallazgo reciente de una proteína anti-priónica se constituye en una nueva forma para tratar y poder controlar estas enfermedades priónicas. Palabras clave: cérvido, enfermedad debilitante crónica, PrP TSE PRION: A REVIEW OF CHRONIC WASTING DISEASE AND ITS POSSIBLE ANTI- PRION CONTROL. Abstract. Prions are proteins of the nervous system, which when subjected to changes in protein structure are responsible for generating neurodegenerative diseases. There is great interest in the high stability of these molecules. Studies show that having a high resistance to be inactivated by several agents and that may persist in the soil year after being buried, creating a reservoir of environmental infectivity. In veterinary medicine there are several domestic animals susceptible to these diseases, but in wildlife veterinary medicine has been only one Página 64

2 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL family: cervids. The objective of this article is to collect the most recent and relevant information on prion diseases and analyze from a general perspective of chronic wasting disease in order to facilitate the understanding of prion etiologic agent, the types of prion diseases and how to study if developing prion disease in wildlife. Prion diseases in wildlife veterinary medicine is rarely a subject of study. However, the resistance of the prion protein with its aggressive spreading in the US and Canada these diseases have become a subject of significant study. Chronic wasting disease does not appear to be zoonotic, but in the past there has been evidence of prion diseases and may adapted affect humans. The recent discovery of an anti-prion protein constitutes a new way to treat and to control these prion diseases. Keywords: chronic wasting disease, deer, PrP TSE. Priones Los priones son proteínas que se encuentran en el sistema nervioso de todo tipo de mamífero. Este tipo de proteína se ubica en la superficie de la células y son conocidas simplemente como la proteína priónica normal celular (PrP C ) [1]. Cambios en la estructura secundaria y terciaria de PrP C [2, 3] generan la creación de una isoforma designada PrP TSE (de las siglas para encefalopatías espongiformes trasmisibles en Inglés) [4-8]. Esta proteína anormal posee otras terminologías debido a las diferentes formas en que se presenta PrP Sc (proteína priónica scrapie); PrP BSE (proteína priónica de encefalopatía espongiforme bovina); PrP CWD (proteína priónica de enfermedad debilitante crónica). Esto genera cierta confusión, por lo cual PrP TSE se utiliza para referirse a todas las isoformas anormales de PrP C [7, 8]. Las encefalopatías espongiformes trasmisibles son generadas por la isoforma anormal de PrP C [9]. Estudios sugieren que PrP TSE es el agente infeccioso para este tipo de patologías y la molécula necesaria su trasmisión [1, 10]. Estas proteínas infecciosas se dividen por cepas, en donde ciertos grupos poseen atributos fenotípicos (ej., tiempo de incubación, neuropatología, grados de glicosilación, grado de resistencia a proteinasas) dentro del mismo grupo genotípico de huéspedes [11-14]. Estructura y Química de Priones PrP C y PrP TSE poseen la misma estructura primaria [15]. En hámsteres sirios, PrP C y PrP TSE consisten en una proteína de 209 aminoácidos que contienen dos sitios de glicosilación y un anclaje glicosilfosfatidilinositol (GPI) [15]. En ratones, la forma madura de PrP C consiste en una proteína de 210 aminoácidos, que contiene dos sitios de glicosilación y un anclaje glicosilfosfatidilinositol (GPI) [16, 17]. Subdirección Técnico Científica 65

3 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D La estructura de PrP C posee dos dominios: un dominio N-terminal flexible desordenado que es capaz de unir cobre; y un dominio C-terminal alfa-hélice [16, 17]. En contraste, la estructura de PrP TSE es rica en hojas plegadas beta, y se caracteriza por su solubilidad limitada en detergentes no desnaturalizantes, su tendencia a agregarse, y su resistencia parcial a la proteinasa K (PK) [18]. La proteinasa K (PK) es una serín proteasa que degrada completamente PrP C, pero al tratar PrP TSE remueve sólo aminoácidos del terminal-n. Esta acción produce una molécula más pequeña y resistente de aproximadamente 142 aminoácidos; molécula conocida como PrP o PrP res (proteína priónica resistente), la cual es un determinante diagnóstico para las enfermedades espongiformes trasmisibles [13, 14, 19-24]. Normalmente PrP res tiene un tamaño de kda cuando es di-glicosilada, kda cuando es monoglicosilada y 18 kda cuando es no glicosilada [25-27]. Hay evidencia limitada de que existe alguna otra proteína resistente a la proteinasa K diferente a PrP TSE [28]. Sin embargo, no todas las moléculas de PrP TSE son resistentes a la degradación por proteasas. Algunas cepas demuestran diferentes grados de resistencia a las proteinasas, y otras una sensibilidad completa a ellas [13, 14, 20-22]; formas denominadas sprp TSE. Esta excepción no ha sido reportada en los procesos digestivos. Estudios señalan que PrP TSE posee una resistencia variada a la digestión ruminal [29-31] y que esta no disminuye la abundancia de PrP TSE en el tracto digestivo [32, 33]. Otros hallazgos reportan que PrP TSE es luego expuesto a digestión gástrica e intestinal antes de ser absorbida; procesos enzimáticos en donde PrP TSE demuestra resistencia en ambas circunstancias [34, 35]. Esta evidencia señala que PrP TSE es difícilmente degradada por digestión. Proceso de Conversión PrP TSE estimula la conversión de PrP C a PrP TSE [15]. El fenómeno ocurre con un proceso asistido en donde PrP TSE actúa como plantilla sobre la cual PrP C cambia su estructura secundaria y terciaria. La proteína priónica anormal se propaga con esta conversión [36]. La acumulación de PrP TSE en el cerebro causa neurodegeneración [15]. PrP C necesita estar en un estado intermedio en donde se encuentra parcialmente desplegado para poder interactuar con PrP TSE y así cambiar su estructura. Este estado intermedio se denomina PrP* [37]. Científicos creen que la conversión de PrP C a PrP* requiere de uno o más cofactores no identificados, los cuales son designados proteína X. Los cofactores aparentemente se unen a PrP C y permiten la interacción con PrP TSE [38]. 66 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

4 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Las encefalopatías espongiformes trasmisibles son enfermedades neurodegenerativas incurables que producen un deterioro y muerte lenta del individuo afectado [39]. Producidas por una proteína llamada PrP TSE, ellas poseen un periodo de incubación amplio [39] y representan un grupo de patologías caracterizadas por generar demencia, ataxia, vacuolización, gliosis astrocítica, deposición de PrP TSE y formación de placas amiloides en el sistema nervioso central (SNC) [40, 41]. Estas enfermedades pueden atacar a humanos, bovinos, ovinos, y fauna silvestre (ciervos/venados) [9, 42]; y entre su clasificación se puede encontrar a: la encefalopatía espongiforme bovina, el scrapie ovino, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), la encefalopatía espongiforme felina, la encefalopatía espongiforme del visón y la enfermedad debilitante crónica [20, 28, 43]. A lo largo del tiempo, los mamíferos han presentado genes que codifican para PrP C, proteína esencial para ser susceptible a las encefalopatías espongiformes trasmisibles. Estudios encontraron que los genes de PrP C en mamíferos demuestran un grado de conservación significante a lo largo de la evolución; sin embargo, los genes presentan también variaciones entre especies e individuos de la misma especie. Factor que afecta la susceptibilidad del individuo o especie [40]. La inoculación intracerebral de priones con una secuencia idéntica a la del animal huésped acelera el periodo de incubación de la enfermedad. En casos donde los priones provienen de otra especie, el periodo de incubación puede aumentar y varía entre individuos. En ocasiones los individuos no desarrollan la enfermedad [44-47]; fenómeno llamado la barrera específica [48]. Los priones presentan un rango de huéspedes. Esto permite que el PrP TSE pueda adaptarse a ciertas especies o ser impedida para infectarlas [48, 49]. Varias de estas encefalopatías espongiformes trasmisibles se adaptaron a roedores; orden que propagó dichas enfermedades. Investigaciones relacionadas con estas encefalopatías espongiformes trasmisibles utilizan rutinariamente cerebros de roedores infectados para sus experimentos [41, 50]. El cerebro y otros tejidos del sistema nervioso central (SNC) poseen en las encefalopatías espongiformes trasmisibles los títulos de inefectividad más altos [51, 52]. Enfermedad Debilitante Crónica Generalidades y Epidemiología La enfermedad debilitante crónica es la única enfermedad priónica identificada en animales silvestres [53]. La patología fue descrita por primera Subdirección Técnico Científica 67

5 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D vez en 1967, en donde científicos la reconocieron como un síndrome clínico de etiología desconocida [54]. Debido a hallazgos histopatológicos cerebrales, patólogos reconocen la enfermedad debilitante crónica por primera vez en 1978 en Colorado como una encefalopatía espongiforme trasmisible de los ciervos mulo [53]; pero al poco tiempo identifican también la enfermedad priónica en ciervos canadienses en Wyoming [55]. Por dos décadas, científicos creían que esta enfermedad se limitaba a esta región central de los Estados Unidos; sin embargo, durante los últimos 16 años monitoreos han demostrado la amplía distribución que posee la enfermedad. Estudios identificaron focos no continuos tanto al occidente (Utah) como al oriente (New York y Virginia del Oeste) del país [54]. Canadá reporta casos en poblaciones silvestres y de cría en Alberta y Saskatchewan [1, 56]. Las prevalencias han reportado un involucramiento del 15-30% en poblaciones de vida silvestre [54, 57], y en poblaciones de cautiverio hasta un 100% de los individuos [54]. Estudios estiman que la incidencia de la enfermedad en cérvidos de vida silvestre es aproximadamente 15% [57]. Estos datos aciertan la propagación agresiva de la enfermedad, permitiendo considerarla como una amenaza emergente. La preocupación aumenta cuando se considera que la enfermedad se ha adaptado a los alces, y que existe la posibilidad de que se infecte a una nueva especie en la tundra o bosque borreal [1]. La Enfermedad Debilitante Crónica sólo ocurre en Estados Unidos, Sur Corea [54, 56, 58, 59] y en dos provincias de Canadá [1, 56]. Con excepción de Alemania, el monitoreo internacional para esta enfermedad ha sido mínima [60] creando la posibilidad de que sí esté presente en otros países, pero aún no haya sido detectada. El aumento en la distribución de la enfermedad provocó una profundización en su estudio, centrada principalmente en: susceptibilidad específica, trasmisión, patogénesis, epidemiología espacial, técnicas de diagnóstico, cepas y estructura de la proteína priónica (PrP) del cérvido [42]. Tomando una perspectiva epidemiológica, la enfermedad debilitante crónica afecta dos tipos de poblaciones de cérvidos: la silvestre y la de cría. En ambas aumenta la incidencia, lo que permite referirse a la enfermedad como una epidemia. En las poblaciones silvestres, científicos han localizado un epicentro en las partes contiguas de la esquina noreste de Colorado, el sureste de Wyoming, y el extremo suroeste de la esquina de Nebraska. Otros estados de las Montañas rocosa y de las grandes planicies también presentan casos, al igual que estados no aledaños como Wisconsin e Illinois. En las poblaciones de cría, estudios señalan casos en los estados de Colorado, Kansas, Oklahoma, Minnesota, Nebraska, South Dakota, Wisconsin y Wyoming. Canadá presenta también casos en ambas 68 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

6 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL poblaciones en las provincias de Saskatchewan y Alberta, aunque en menos número que los Estados Unidos. La dinámica de la enfermedad en las población de cría es difícil de predecir, ya que su comportamiento depende de movimientos comerciales, los cuales no son regulados en varios estados [1]. En la enfermedad crónica debilitante existen dos características principales que merecen ser resaltadas: es la única enfermedad priónica conocida que afecta ciervo mulo, venado de cola blanca, ciervo canadiense y alce; y es una enfermedad en donde existe trasmisión horizontal [53, 57, 61]. Esta alteración aparenta ser más trasmisible que otras enfermedades priónicas [53] y se genera por la acumulación de un confórmero malformado rico en hojas plegadas beta de la proteína priónica celular (PrP C ), la cual conduce a una neurodegeneración y muerte inminente [53]. Cepas Se sabe que PrP TSE se puede clasificar por cepas [11-14] y no hay excepción en la enfermedad debilitante crónica. Científicos creían la enfermedad debilitante crónica en venados y ciervos como el mismo ente infeccioso, pero hallazgos sugieren que existen variantes conformacionales o cepas [62-65]. Las cepas priónicas producen en ratones tiempos de incubación distintos y lesiones en diferentes áreas del cerebro [66-68]. Transmisión La exposición por vía oral aparenta ser responsable por la transmisión ambiental de la enfermedad [69, 70]. La presencia de PrP TSE en el tejido linfoide del tracto alimentario refuerza esta noción [70, 71]. Científicos han identificado diferentes vías de diseminación de PrP TSE : en las heces de animales sintomáticos y presintomáticos [72, 73], en la saliva, o en la orina [74]. Todas estas pueden tener un papel importante en la trasmisión de la enfermedad, pero también ayudar a generar una reserva ambiental. Dicha reserva de infectividad mediaría el proceso de trasmisión [75-78], afectando varios factores epidemiológicos como: la frecuencia de contacto, el tiempo de exposición, y la probabilidad de transmisión. La característica más preocupante es la capacidad de trasmisión horizontal [56, 69]. Hay reportes que describen como la introducción de un animal enfermo en una producción genera la enfermedad en otros individuos de la manada [56]; y como la incidencia aumenta cuando hay proximidad física por encierro [70, 71]. Esta característica con lleva a que científicos se interesen por la capacidad que tiene la enfermedad para cruzar barreras específicas. Hasta el 2006, la enfermedad anteriormente se pensaba limitada a venados de cola blanca, ciervos mulo, y ciervos canadienses, pero esto cambió Subdirección Técnico Científica 69

7 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D cuando reportaron: un caso en donde un alce de Yellowstone podía ser infectado por vía oral; y un caso natural de enfermedad debilitante crónica en un alce [53, 55, 73, 79, 80]. Dinámica de Priones entre Animales La contaminación ambiental por priones expone a rumiantes domésticos a la enfermedad debilitante crónica por las zonas de pastoreo común [77]. Los ovinos y bovinos parecen ser poco susceptibles a la enfermedad debilitante crónica de los ciervos mulo [81], pero los bovinos aparentan ser altamente susceptibles a la enfermedad debilitante crónica de los venados de cola blanca [82]. Estudios demostraron que la enfermedad debilitante crónica se podía trasmitir a ganado después de inoculación intracerebral. Aunque la tasa de infección fue baja [83], este hallazgo genera preocupación de que el ganado puede padecer de la enfermedad al entrar en contacto con pastos contaminados. Esta diferencia en susceptibilidad apoya la hipótesis de la existencia de cepas, y que la enfermedad debilitante crónica puede cruzar la barrera específica dependiendo de la cepa. Futuros estudios indagarán si el ganado es susceptible a priones de venado de cola blanca por medio de la vía oral [42]. Respecto a los animales silvestres, depredadores y carroñeros se alimentan presumiblemente de cadáveres infectados. Conociendo que el músculo esquelético contiene PrP TSE [84], se deduce que varias especies son expuestas a la enfermedad debilitante crónica por la alimentación. Sin embargo, tanto en animales silvestres como en domésticos la enfermedad no presenta casos de trasmisión oral por fuera de la familia de los cérvidos, indicativo de una barrera específica fuerte [42]. Dinámica de Priones entre Humanos Millones de Norteamericanos se exponen a la enfermedad debilitante crónica por medio de la cacería y consumo de la carne de venado y ciervo. Aunque el músculo esquelético alberga PrP TSE, no han existido brotes de encefalopatías espongiformes trasmisibles en humanos en sitios en donde la enfermedad ha existido por décadas [85]. Estudios concluyen que la susceptibilidad de humanos a esta enfermedad es baja. Hay una incompatibilidad en la conversión del PrP C humano por la enfermedad debilitante crónica, el scrapie ovino y la encefalopatía espongiforme bovina; por lo que casos en humanos pueden ser escasos. Sin embargo, la encefalopatía espongiforme bovina logró infectar a humanos, lo que hace ver prudente limitar la exposición de humanos a la enfermedad debilitante crónica [86]. 70 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

8 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL Evidencia recolectada apoya la idea de que la barrera específica es demasiado fuerte como para que la enfermedad debilitante crónica se trasmita a humanos, pero hay un reporte de susceptibilidad a la enfermedad en un primate no humano. El caso ocurrió en un mono ardilla [87]; no obstante, el PrP de los monos del nuevo mundo son los más distantes del de los humanos, por lo que no demuestra completamente que el PrP C humano pueda ser afectado por el PrP TSE de la enfermedad debilitante crónica [88]. La susceptibilidad humana sigue siendo cuestionable [89, 90]. Patogénesis La patogénesis de la enfermedad debilitante crónica revela depósito de PrP TSE en el sistema nervioso central (SNC) y tejidos extraneurales. Los priones se distribuyen en los tejidos en base a: la genética del individuo; la vía de inoculación; y el tipo, dosis y origen de la cepa priónica. Sólo la enfermedad variante de Creutzfeldt-Jakob, el scrapie ovino, y la encefalopatía trasmisible del visón asemejan un grado de involucramiento sistémico similar [91-96]. Debido a que los individuos entran en contacto con el agente infeccioso por la vía oral [69, 70], el PrP TSE se detecta en las placas de peyer, folículos linfoides aislados, y tejido linfoide asociado a intestino, frecuentemente en el íleo. El agente se acumula en el tejido linfoideo y luego entra al sistema nervioso central por el sistema nervioso entérico [70, ]. El tejido linfoideo asociado a intestino acumula PrP TSE alrededor de las células foliculares dendríticas maduras y macrófagos de cuerpos tingibles en los nódulos linfáticos [101]. Se hipotetiza que las células M del epitelio asociado al folículo son el puerto de entrada del antígeno, captándolo en la luz intestinal y presentándoselo a las células mencionadas [102, 103]. La mucosa intestinal es altamente inervada, pero se creía que los centros germinales de los nódulos linfáticos carecían de inervación [104]; se pensaba que no había ningún vínculo entre el sistema nervioso entérico y los folículos linfoides. Estudios revelaron que folículos linfoides en las placas de peyer poseen nervios que están en contacto cercano con células foliculares dendríticas maduras y macrófagos de cuerpos tingibles [105]. Científicos creen que PrP TSE llega al sistema nervioso central (SNC) por el nervio vago, una vez este se reproduce en el tejido linfoide asociado a intestino [29]. Otros estudios creen que el sistema linforreticular y el sistema nervioso entérico entran en contacto con PrP TSE casi simultáneamente. Ellos describen que PrP TSE es transportado también a través de los enterocitos y lámina propia hasta llegar al conducto lacteal [29] investigaciones han encontrado que hay nervios adyacentes en la membrana basal del epitelio de la vellosidades, la lámina propia y las paredes de los conductos lacteales [105]. Subdirección Técnico Científica 71

9 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D La infección se disemina por sangre o linfa a otras partes del sistema linforreticular una vez esta se replique en los nódulos linfáticos del tejido linfoide asociado a intestino [29]. En ciervos mula, PrP TSE se detecta en los ganglios linfáticos retrofaríngeos a las 6 semanas de infección oral [70]; y a los 3 meses está ampliamente distribuido en el tejido linfático y es detectable en el cerebro por primera vez [106]. PrP TSE se detecta también en páncreas, glándula adrenal [106, 107], músculo esquelético [84], corazón [108] y bazo [70, 97]. La patogénesis difiere entre venados y ciervos, principalmente en los niveles de PrP TSE en tejido linfoide, los cuales son más altos en venados [109]. Signos Clínicos Los signos clínicos en venados y ciervos son sutiles y no específicos en etapas tempranas, en donde se presenta comúnmente pérdida de peso y cambios comportamentales (depresión o aislamiento de la manada). Otros signos registrados son: hipersalivación, polidipsia/poliuria, ataxia, regurgitación ocasional, y/o distención esofágica [42]. Tratamiento y Manejo Los Parques Nacionales de los Estados Unidos han optado manejar la enfermedad anestesiando individuos, muestreándolos, instaurándoles un radiolocalizador, y sacrificando a cualquier individuo infectado. El proceso es costoso y exige mucha mano de obra [110]. No existe ninguna cura conocida para esta enfermedad. Priones y Suelo Los priones contaminan el suelo mediante: cadáveres o materiales contaminados [111], derramamiento alimentario [70, 91, 112], enterramiento deliberado de cadáveres o material contaminado [77, 113], y excreción urinaria [114].Se plantea que el suelo puede servir como una reserva de infectividad para los animales [75, 77, 115, 116]. La ingestión deliberada o accidental de suelo contaminado por rumiantes los expone a cientos de gramos de tierra diarios [117, 118] y permite el contacto del agente infeccioso con el huésped. A diferencia de la ruta de exposición oral, se observa en roedores que la inoculación intracerebral es 10 5 veces más efectiva en el momento de inducirla [119]. Hallazgos señalan que la transmisión oral de la enfermedad es ineficiente y que la cantidad de PrP TSE excretada al medio ambiente es aparentemente pequeña. Esto ha generado que científicos empiezan a creer que las reservas ambientales de infectividad no poseen muchas influencia en 72 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

10 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL la transmisión de enfermedades priónicas [120], pero nuevas investigaciones demuestran lo contrario. Los priones permanecen en el suelo por años [113]. Ellos demuestran una alta resistencia a ser inactivados por agentes químicos, radiación y calor [121], y se ha encontrado que pueden persistir en el suelo por lo menos tres años después de ser enterrados [113]. Ellos se unen a las partículas de tierra [115, 122, 123], en donde estudios demuestran una unión ávida con ciertos tipos de minerales. Esto crean complejos que siguen siendo infecciosos para los animales [115]. Estudios reportan que la unión con partículas de tierra no disminuye la biodisponibilidad del agente infeccioso, sino incrementa su transmisión por vía oral y mantiene la enfermedad en el medio ambiente [120]. La razón por la cual ciertos tipos de suelo potencian la infectividad de los priones se desconoce, pero este fenómeno permite explicar reportes de animales que padecen de la enfermedad después de ser expuestos a pequeñas dosis de PrP TSE en el ambiente [75, 77, 78, 124]. Liquenes Los líquenes son un organismo simbiótico, los cuales están conformados por un hongo y un agente fotosintético, conocidos como micobionte y fotobionte respectivamente. Estos agentes simbióticos son ubicuos, y son capaces de sobrevivir ambientes muy hostiles, como la tundra ártica. Es conocido que los líquenes producen una amplia gama de metabolitos secundarios. Estos metabolitos secundarios han sido estudiados, y se les ha atribuido cualidades antibióticas y antivirales, entre otras. Además, se han encontrado producción de biomoléculas, las cuales son han sido completamente identificadas pero se cree entre ellas pueden haber algunas que actúen como enzima proteolíticas. [125, 126]. Generalidades del Líquen Los líquenes son una simbiosis autoportante formada por un hongo (micobionte) y uno o varios asociados principales que pueden ser algas o cianobacterias (fotobionte) [ ]. Normalmente único en la simbiosis, el micobionte domina la asociación, razón por la cual los líquenes son catalogados con base al ente fúngico y anteriormente eran considerados un tipo de hongo [127, 129]. La ciencia reporta alrededor de 100 especie de fotobiontes que se asocian con especies de micobiontes; varios micobiontes comparte el mismo fotobionte [129]. Este tipo de organismo ha existido más de 660 millones de años [131], y ocurre sobre más del 10% de la superficie de la Tierra [126]. Este organismo se pueden encontrar en casi todo los hábitats terrestres, desde los polos hasta los trópicos [129]. Los líquenes poseen una habilidad Subdirección Técnico Científica 73

11 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D casi ubicua, en donde pueden colonizar substratos diversos [129]. Muchas especies pueden tolerar condiciones ambientales extremas desfavorables para la supervivencia de sus componentes individuales, y lograr una edad de varios miles de años [132]. La mayoría de los líquenes exponen sus partes vegetativas en la superficie del sustrato, a diferencia de varios tipos de hongos que se incrustan en ellos. Los fotobiontes aprovechan esto para hacer fotosíntesis, y se crean cuerpos vegetativos compactos, llamados talos [126]. Varios ungulados consumen líquenes arbóreos durante el invierno en los bosques templados nórdicos y hacen un parte importante de su dieta [133, 134]. Sustancias Liquénicas Los líquenes demuestran colores distintivos como resultado de la acumulación de diversas sustancias liquénicas; componentes secundarios que son en su mayoría moléculas pequeñas de estructura compleja [135, 136]. Los pigmentos cristalinos se depositan a nivel extracelular (extrolitos) o en las superficies vegetativas, mientras que sustancias incoloras se acumulan en partes del talo no expuestas a la luz [126]. Investigaciones demuestran que los metabolitos son formados principalmente por el agente fúngico [137, 138]; sin embargo, ciertas especies de cianobacterias y microbios asociados a líquenes pueden contribuir en la producción de metabolitos secundarios. Mientras que otras especies producen metabolitos activos sólo en asociación con un compañera de algas adecuado [126]. Hasta la actualidad se reportan más de mil sustancias diferentes [126]. Los micobiontes sintetizan cantidades significantes de metabolitos secundarios sólo bajo condiciones permisivas [ ]; aquellas a las que está expuesta el liquen en la naturaleza [144]. Científicos reportan producción de nuevos metabolitos ausentes en la naturaleza en cultivos artificiales, en donde se pueden alterar las situaciones de estrés; y la concentración y tipo de nutrientes [145]. La producción de metabolitos secundarios por fotobiontes no ha sido investigado a profundidad [126]. Los metabolitos poseen diferentes funciones [ ]: filtros de radiación para el fotobionte [149], disuasivos que hacen daño al momento de pastorear para herbívoros invertebrados, antibióticos contra la degradación microbiana [150], metabolitos para el mantenimiento del balance simbiótico [151, 152] o metabolitos que erosionan rocas para mejorar la fijación del líquen al sustrato [153]. En el ámbito farmacéutico, las sustancias liquénicas demuestran varios efectos biológicos: antimicrobial, antiinflamatorio, antipirético, citotóxicos y antiproliferativos [154]; no obstante, se han examinado pocas de ellas en detalle por las dificultades que hay para obtenerlas en cantidades y purezas necesarias [126]. 74 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

12 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL Aunque los líquenes son una simbiosis entre un micobionte y un fotobionte, se demuestra que pueden tener una relación estable con otros microorganismos como: hongos parasíticos [155], hongos endófitos [156], y bacterias [157]. Ellos también poseen la capacidad de producir otros tipos de metabolitos [158]. Esto demuestra que la gama de metabolitos que poseen los líquenes es amplia. Proteasa Anti-Priónica Liquénica y Priones Estudios recientes, llevado a cabo en el National Wildlife Health Center (NWHC) en los Estado Unidos, han encontrado que ciertas especies de líquenes son capaces de producir una proteasa que puede degradar PrP Sc [125]. Hasta el momento se pensaba que las condiciones ambientales que inactivan otros patógenos difícilmente afectan la infectividad priónica debido a la alta resistencia que presentan [159]. Esta característica permitía que los priones pudieran mantenerse infecciosos en el ambiente por décadas [75] y generar así un reservorio de infectividad que mediaba el proceso de transmisión. Los resultados han dado hasta evidencia que los líquenes son capaces de hacer individuos más resistentes a infección priónica [160], lo cual pueda estar conduciendo al descubrimiento de un tratamiento antiprónico. Este hallazgo señala que existen sustancias en el ambiente que pueden degradar priones. Aunque se desconoce el porqué los líquenes son capaces de producir dicha proteasa. Científicos han observado que las levaduras pueden ser infectadas por varios priones fúngicos [161], pero los líquenes nunca han sido examinados como huéspedes potenciales. Los priones fúngicos y mamíferos poseen una estructura amiloidea común [162], sugiriendo que las proteasas liquénicas pueden actuar contra estos priones fúngicos. Esto genera la teoría de la presencia de esta proteasa puede proteger al liquen de priones y amiloides. Líquenes, Rumiantes y La Proteasa Anti-Priónica Las interacciones entre líquenes y animales silvestres están bien documentadas [163]. Científicos conocen que los cérvidos consumen líquenes. En los bosques boreales, ellos constituyen un 60% de la dieta invernal de los caribúes [164]; y en otros climas, aunque su consumo en cérvidos varía, siguen siendo deseables y en algunos casos preferidos [133, 165]. El descubrimiento de una proteasa anti-priónica en líquenes permite pensar que la ingestión de estos puede afectar la trasmisión o patogénesis en cérvidos [125]. Evidencia demuestra que en rumiantes alimentados con líquenes existe poca biodisponibilidad de proteína [166]. Esto sugiere que Subdirección Técnico Científica 75

13 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D puede haber actividad de proteasas en las partes distales del sistema digestivo. El potencial de los líquenes de afectar la transmisión de la enfermedad debilitante crónica aumenta en donde éstos se consiguen en cantidades abundantes y hacen parte de la dieta de los cérvidos [159]. Características y Naturaleza de La Proteasa Anti-Priónica A nivel in vitro, estudios reportan que muestras infecciosas tratadas con extractos liquénicos y líquenes intactos disminuían en cien veces sus niveles de PrP TSE [125]. Identificando la molécula responsable de esto, se encontró que al utilizar un inhibidor de serín proteasa los niveles de PrP TSE no disminuían de forma significante. Científicos observaron que otros inhibidores de proteasas eran incapaces de hacer esto, evento que confirma el involucramiento de una serín proteasa en el proceso de degradación de PrP TSE [125]. Aunque se cree que una serín proteasa liquénica es el factor más importante para la degradación de PrP TSE, no se descarta la posibilidad de que metabolitos secundarios u otros componentes puedan: funcionar como cofactores enzimáticos, regular la actividad de la proteasa o sensibilizar la proteína priónica a la degradación [125, 167]. Estudios también sugieren la posibilidad de que exista más de una proteasa, y que estas tengan diferentes rangos de acción [167]. El nivel de degradación que posee cada liquen puede reflejar la cantidad de proteasa presente en él o la cantidad de cofactores necesarios para degradación. Se cree que los extractos liquénicos pueden ser ricos en metabolitos secundarios que frecuentemente poseen actividades potentes [125, 168, 169]; sin embargo, hasta el momento se desconoce la contribución que tienen los metabolitos secundarios de los líquenes para la degradación de PrP TSE. La evidencia señala que la proteolisis es un factor importante en la degradación de PrP TSE, pero no necesariamente es el único involucrado [125]. Especies de Liquen y La Proteasa Anti-Priónica La actividad anti-priónica se ha identificado en más de 10 géneros de líquenes. Esto sugiere que es una cualidad común en dichos organismos [159]; sin embargo, aparenta ser especie específica [125]. Estudios demostraron que en líquenes del mismo género esta cualidad estaba presente en algunas, pero ausente en otras [125]; indicando que no es distribuida de forma uniforme entre los géneros [159]. El micobionte aparenta ser el componente que define si la especie de liquen es capaz de degradar PrP TSE, ya que líquenes positivos y negativos a la proteasa anti-priónica comparten en ocasiones fotobiontes idénticos o similares. En publicaciones pasadas Parmelia sulcata, Lobaria pulmonaria y 76 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

14 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL Cladonia rangiferina reportaban poder degradar PrP TSE, mientras que Parmelia squarrosa, Lobaria quercizans, Lobaria oregano y Cladonia stellaris carecían de dicha habilidad [125]. No se ha encontrado evidencia que señale que la filogenia determina la presencia de dicha habilidad anti-priónica [167]. La ubicación de la proteasa todavía se desconoce [167]. Científicos comprobaron que los extractos de cianobacterias y algas fotobiontes no degradaban tanto PrP TSE como PrP C, pero esto no elimina la posibilidad de que fotobiontes puedan actuar de forma diferente cuando viven en simbiosis con un micobionte [125]. Tampoco se descarta la posibilidad de que bacterias asociadas a líquenes pueden contribuir a la degradación de PrP TSE [125]; ni que sea un trabajo en conjunto en donde proteínas producidas por un organismo pueden ser modificadas por otro organismo presente en la simbiosis [170]. Ninguna asociación se encontró entre la habilidad de degradar priones y el origen o hábitat del liquen. Esto demuestra que esta cualidad no es mediada por ubicación geográfica ni factores ambientales. Hallazgo que apoya la teoría de que dicha cualidad es especie específica [125, 167]. Investigadores creen que entre las especies de líquenes que degradan PrP TSE existen mecanismos diferentes de proteólisis [125]. Deteccion de Priones La detección de PrP TSE puede ser llevado a cabo por diferentes técnicas. Según Watts, Balachandran (1) estas técnicas pueden ser agrupadas en dos grupos principales: las de diagnóstico estático y las de diagnóstico activo. Técnicas de Diagnóstico Estático Las técnicas de diagnóstico estático son principalmente cuatro: histopatología, inmunohistoquímica, y dos ensayos inmunológicos. Este grupo se utiliza principalmente para el diagnóstico post-mortem de una enfermedad priónica [171]. Los procedimientos estándares de histopatología demuestran cambios espongiformes (área de vacuolización), degeneración neuronal, astrogliosis, y en ocasiones la acumulación de placas amiloides que contienen PrP TSE. Los depósitos de PrP TSE pueden ser observadas después de un pretratamiento con ácido fórmico y un autoclave hidratado o hidrolítico para reducir la inmunoreactividad de PrP C, antes de hacer una tinción con un anticuerpo PrP específico [172]. La inmunohistoquímica puede ser realizada sobre secciones de tejido congeladas o fijadas en formol para detectar presencia de PrP TSE in situ. Esta técnica diagnóstica es capaz de demonstrar la distribución de PrP TSE en el cerebro y tejido linfoideo [70]. Detección de PrP anormal por el proceso de Subdirección Técnico Científica 77

15 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D inmunohistoquímica ha demostrado ser una técnica diagnóstica más efectiva que la evaluación histopatológica. Hallazgos han demostrado que exanimación por histopatología no es suficiente para la detección de muchos casos preclínicos de la enfermedad [173, 174]. Estudios han demostrado que la inmunohistoquímica es capaz de detectar PrP TSE en tejido linfoideo 42 días después de inoculación oral de PrP TSE en venados [70]. Biopsias rectales y de amígdalas pueden ser usadas en técnicas de monitoreo a grande escala para poblaciones silvestres o de cautiverio de venados. En un estudio se reporta que PrP TSE fue detectado por inmunohistoquímica en los folículos linfoides rectales de vanados, en donde 19 de 19 venados fueron positivos un año después de inoculación oral. En otra investigación que trabajaba con individuos infectados de forma natural, 45 de 50 ciervo mulos confirmados por inmunohistoquímica sobre amígdalas o ganglios linfáticos retro faríngeos salieron positivos con inmunohistoquímica por medio de la biopsia rectal [175]. Laboratorios utilizan ensayos inmunológicos para detectar PrP res y usarlo como un marcador diagnóstico de infección para las encefalopatías espongiformes trasmisibles [176, 177]. Las pruebas diagnósticas utilizadas para las encefalopatías espongiformes trasmisibles son: el inmunoblot sensible y el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). El ELISA no separa las proteínas por tamaño, a diferencia del inmunoblot que presenta dos ventajas principales. Un indicador visual de pesos moleculares alterados de las bandas proteicas confirmando que sólo PrP res está siendo detectado; y el análisis de una señal en forma de 3 bandas obtenida de las 3 glicoformas de PrP res que contribuyen a confirman la presencia de la proteína priónica [25-27, 178]. Estudios reportan que la sensibilidad del inmunoblot utilizado para detectar priones por lo menos iguala a la de varios ELISA y otros sistemas de inmunoblot [176, 179, 180]. El sistema de inmunoblot sensible detecta, según un estudio, PrP TSE en muestras cerebrales de hasta 10 ng [177], otros estudios reportan posibilidad de detectar PrP TSE en muestras cerebrales van de 2.5 µg [179] a 0.3 mg [180] y PrP res en muestras cerebrales de 5pg [178]. El inmunoblot aumenta su seguridad como prueba diagnóstica implementando el uso de anticuerpos específicos y proteinasa K (PK) [178]. Técnicas De Diagnóstico Activo A diferencia del diagnóstico estático en donde se detecta bioquímicamente PrP TSE, el diagnóstico activo amplifica el PrP TSE o la infectividad in vivo o in vitro antes de la detección [1]. Las técnicas de diagnóstico estático son principalmente tres: bioensayos de priones en ratones, ensayos de células scrapie y PMCA. 78 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

16 PRIONES: UNA REVISIÓN DE LA ENFERMEDAD DEBILITANTE CRÓNICA Y SU CONTROL El bioensayo en ratones es la técnica más común para medir la infectividad in vivo. Los animales son inoculados la muestra de forma intracerebral y luego evaluados si padecen de la enfermedad. Aunque esta técnica es efectiva, posee ciertas desventajas. El bioensayo es costoso, tedioso y consume mucho tiempo (los ratones normalmente sucumben a la enfermedad aproximadamente 150 después de la inoculación, aunque depende mucho de la cepa priónica y la cepa de ratón utilizadas). Además, la prueba puede ser afectada por la barrera específica, dando lugar a tiempos de incubación largos o transmisión ineficiente de la enfermedad [1]. Otra técnica activa es el ensayo de células de scrapie; 10 veces más rápido que los bioensayos convencionales y 2 veces más barato. Esta prueba basada en cultivos celulares utiliza sublíneas de células de nueroblastoma N2a de ratón seleccionadas por su alta susceptibilidad a priones y mide la habilidad de una muestra para generar células positivas a PrP TSE. Una desventaja de esta técnica es que intentos con algún agente priónico diferente al agente priónico RML adaptado para ratones han sido un fracaso [181]. La técnica de amplificación cíclica de de proteínas mal plegadas (PMCA, Por sus Siglas en Inglés) también es considerada una prueba de diagnóstico activo, la cual genera grandes cantidades de PrP res in vitro [182]. PMCA es invaluable para la detección de bajos niveles de PrP TSE en tejidos y fluidos corporales y permite aumentar los niveles de PrP TSE en las muestras infectadas. Esto facilita entender a mayor profundidad la patogénesis de la enfermedad debilitante crónica, y detectar animales en etapas tempranas de infección [183]. Investigadores han desarrollado una técnica sensible de PMCA que es capaz de detectar hasta 50 ag de PrP TSE, demostrando lo sensible que puede llegar a ser [184]. Conclusiones La enfermedad debilitante crónica es una enfermedad que se ha propagado agresivamente por los Estados Unidos y Canadá. Inicialmente afectaba a los ciervos y los venados, sin embargo se ha observado su capacidad de adaptarse a otras especies, como los alces. Esto permite pensar de ella como un posible agente zoonótico, aunque hasta el momento no hay evidencia de que pueda afectar a los seres humanos. El manejo de esta enfermedad es un poco complicado, debido a los altos costos y a la ausencia de cura o tratamiento efectivo. El hallazgo de una proteasa anti-priónica aumenta la esperanza de una nueva forma de control o tratamiento. Los resultados obtenidos por en el National Wildlife Health Center son prometedores, sin embargo falta mucho tiempo para tener una respuesta conclusiva. Subdirección Técnico Científica 79

17 MILLÁN-GONZÁLEZ R Y SOLER-TOVAR D Las enfermedades priónicas son de poco estudio en el área de medicina de animales silvestres. Los médicos veterinarios deberían estar más familiarizados con la enfermedad y involucrarse más en el control de esta enfermedad. Agradecimientos Agradecemos todas las enseñanzas y apoyo brindado por la institución y personal del National Wildlife Health Center, especialmente al Dr. Christopher Johnson. Referencias 1. Watts JC, Balachandran A, Westaway D. The Expanding Universe of Prion Diseases. PLoS Pathog. 2006;2(3):e Pan KM, Baldwin M, Nguyen J, Gasset M, Serban A, Groth D, et al. Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(23): Safar J, Ceroni M, Piccardo P, Liberski PP, Miyazaki M, Gajdusek DC, et al. Subcellular distribution and physicochemical properties of scrapie-associated precursor protein and relationship with scrapie agent. Neurology. 1990;40(3 Pt 1): Gabizon R, McKinley MP, Prusiner SB. Purified prion proteins and scrapie infectivity copartition into liposomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84(12): Meyer RK, McKinley MP, Bowman KA, Braunfeld MB, Barry RA, Prusiner SB. Separation and properties of cellular and scrapie prion proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(8): Prusiner SB. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 1982;216(4542): Spickler AR. Transmissible Spongiform Encephalopathies2008 Apr 16, World Health Organization. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform encephalopathies. Geneva, Switzerland: World Health Organization; Moore C. Introduction to Western Blotting. United Kingdom: MorphoSys UK Ltd; Bueler H, Aguzzi A, Sailer A, Greiner RA, Autenried P, Aguet M, et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 1993;73(7): Bessen RA, Kocisko DA, Raymond GJ, Nandan S, Lansbury PT, Caughey B. Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein. Nature. 1995;375(6533): Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

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