ESTANDARIZACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS ALTERNATIVOS USADOS EN CALIDAD EN LA COMPAÑÍA PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A.

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1 ESTANDARIZACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS ALTERNATIVOS USADOS EN CALIDAD EN LA COMPAÑÍA PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A. Presentado por: CARLOS ALBERTO ARIZA TIRADO UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BOGOTÁ 2006

2 ESTANDARIZACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS ALTERNATIVOS USADOS EN CALIDAD EN LA COMPAÑÍA PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A. Presentado por: CARLOS ALBERTO ARIZA TIRADO Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de Ingeniero de Alimentos Director Luz Myriam Moncada UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BOGOTÁ 2006

3 Nota de aceptación Directora Jurado Jurado

4 A Dios por ser el mudo testigo e incondicional mentor en los avatares de mi vida enseñándome amorosa y pacientemente el camino de la superación y la luz de esperanza donde todo está provisto para seguir alcanzando nuevas metas y venciendo obstáculos cada vez más grandes A mis padres quienes han sacrificado todo en la vida para hacer de sus hijos personas emprendedoras y útiles a la sociedad, con su incondicional amor y perseverancia, con su ternura y sabiduría han dispuesto en mi vida los preceptos morales, espirituales y académicos necesarios para la realización de mis sueños A mi hermano que desde el cielo me observa y acompaña en todos los momentos de mi vida A mi esposa, quien tierna y valientemente ha sacrificado su juventud y lozanía siendo mi apoyo, mi complemento, mi compañera, mi confidente la madre de mi hijo! A mi hijo, que con su inocencia, perspicacia y alegría inunda mi vida de gran felicidad, me llena de esperanza y de motivación es el sustento de mi Fe!

5 AGRADECIMIENTOS El autor expresa sus agradecimientos a: Productos Alimenticios Doria S.A por facilitar los medios y los recursos para la realización del proyecto. La Dra. Luz Myriam Moncada, asesora académica por parte de la Universidad de la Salle, por su invaluable orientación y colaboración en el desarrollo del trabajo. A la Dra. Patricia Jiménez, secretaria académica de la universidad de la Salle por su significativo apoyo y colaboración en la realización de la pasantía empresarial. La Dra. Claudia Patricia Collazos por su apoyo y preocupación permanentes en la evolución del proyecto y en el aprovechamiento de la experiencia empresarial y personal por parte del practicante. A la Ingeniera Luz Marina Varón por su valiosa colaboración, su constante acompañamiento y su generosa orientación en la ejecución de las diversas actividades realizadas en el área de calidad de la compañía. A la Ingeniera Lina Escobar por su permanente apoyo, comprensión y consejo incondicional en los avances del proyecto y en el aprendizaje para el desarrollo de nuevos productos. A la doctora Ivonne Bernier por su importante contribución en la asesoría para el mejoramiento de las buenas prácticas de laboratorio y del aseguramiento de la calidad analítica para los ensayos de rutina en el laboratorio de control de calidad de la compañía.

6 Al equipo de calidad por su generosidad, compañerismo y apoyo constante en todas las experiencias vividas a nivel laboral y particular durante tiempo de desarrollo de la práctica empresarial.

7 INTRODUCCIÓN CONTENIDO OBJETIVOS 1 MARCO DE REFERENCIA METODOS ANALÍTICOS CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALITICOS Según el Alcance Según el Tamaño de la Muestra Según Concentración del Analito Según su Precisión y Exactitud Según su Trazabilidad Según la Jerarquía y Calidad Propia del Método VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS Incertidumbre y Garantía de Calidad Analítica Referentes Normativos Mecanismos para Validación y Verificación de Métodos Analíticos Atributos de Los Métodos TRAZABILIDAD Elementos de la Trazabilidad METODOLOGÍA ETAPAS DE DESARROLLO...22

8 2.1.1 Etapa preliminar Etapa de planeación Etapa de ejecución CONDICIONES OPERATIVAS DE LOS MÉTODOS Equipos e instrumentos Materiales Legislación y normatividad Patrones Químicos VERIFICACIÓN DE CUMPLIMIENTO DE LOS MÉTODOS Determinación de humedad en estufa de Secado Determinación de humedad en el Analizador Sartorius Determinación de humedad por Analizador de Lámpara Halógena Determinación de humedad en el Analizador por Infrarrojo Cercano Determinación de cenizas por calcinación en NIR vs Mufla Determinación de Proteína en NIR vs KJELDAHL Determinación de Acidez ESTANDARIZACIÓN DE LOS MÉTODOS ALTERNATIVOS...35 RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONDICIONES OPERATIVAS DE LOS MÉTODOS Equipos e Instrumentos Legislación y Normatividad...40

9 2.5.3 Patrones Químicos Sulfato de Sodio Decahidratado Sulfato de Amonio Oxido de Zinc Ftalato Ácido de Potasio VERIFICACIÓN DE CUMPLIMIENTO DE LOS MÉTODOS APLICADOS Ensayo de humedad semolato I Método de referencia para humedad con Estufa de Secado Con crisoles de porcelana Con cajas de Petri Analizador por Lámpara Halógena Mettler Analizador Electrónico Sartorius Equipo I y Equipo II Determinador en el Infrarrojo Cercano NIR Ensayo de Humedad Semolato II Método de referencia para humedad con Estufa de Secado Con crisoles de porcelana Con cajas de Petri Analizador por Lámpara Halógena Mettler Analizador Electrónico Sartorius Equipo I Equipo II...63

10 Determinación en el Infrarrojo Cercano NIR (II) Tiempo Optimo de Secado Comprobación de la temperatura en la Estufa Memmert Valoración de la temperatura en Sartorius I y II Determinación de cenizas por calcinación en NIR vs Mufla Determinación de Proteína Kjeldahl vs NIR Determinación de acidez ESTANDARIZACIÓN DE LOS MÉTODOS ALTERNATIVOS Métodos para la determinación de Humedad Ensayo de humedad I Ensayo de humedad II Verificación de los métodos de humedad Equivalencia de resultados Sartorius I y Sartorius II Vs Estufa Equivalencia de resultados Nir Vs Estufa Equivalencia de los resultados Mettler (Laboratorio) Vs Estufa Verificación del método por Lámpara Halógena Utilizando Fideos Verificación del método Infrarrojo NIR para cenizas Equivalencia de los resultados para Nir Vs Mufla Verificación de Proteína Equivalencia de resultados para NIR vs KJELDAHL Procedimientos para el Aseguramiento de Calidad Analítica...107

11 3 CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS...118

12 LISTA DE TABLAS TABLA 1 CLASIFICACIÓN DE LOS CRITERIOS DE CALIDAD ANALÍTICOS...9 TABLA 2 VARIABLES VS INDICADORES EN LA DETERMINACIÓN DE ANALITOS...23 TABLA 3 ESTADO METROLÓGICO DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS...39 TABLA 4. COMPENDIO NORMATIVO PARA EL PROYECTO DE ESTANDARIZACIÓN...40 TABLA 5 PARÁMETROS DE CONTROL DEL SULFATO DE SODIO DECAHIDRATADO PARA EL ASEGURAMIENTO ANALÍTICO DE HUMEDAD EN ESTUFA...41 TABLA 6 PARÁMETROS DE CONTROL DEL SULFATO DE AMONIO PARA EL ASEGURAMIENTO ANALÍTICO DE PROTEÍNAS KJELDAHL...43 TABLA 7 PARÁMETROS DE CONTROL DEL ÓXIDO DE ZINC PARA EL ASEGURAMIENTO ANALÍTICO DE CENIZAS EN MUFLA...45 TABLA 8: NORMALIDAD PROMEDIO NAOH...47 TABLA 9. RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS PRIMERAS PRUEBAS CON SEMOLATO I PARA DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD CON EL MÉTODO DE ESTUFA Y DOS RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS TABLA 10. PRIMERA PRUEBA PARA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD EN SEMOLATO 1 POR MÉTODO DE LÁMPARA HALÓGENA METTLER TABLA 11 PRIMERA PRUEBA PARA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD EN SEMOLATO 1 POR MÉTODO DE SARTORIUS I Y SARTORIUS II...55 TABLA 12. PRIMERA PRUEBA PARA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR INFRARROJO CERCANO NIR...57

13 TABLA 13. SEGUNDA PRUEBA PARA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR MÉTODO DE ESTUFA CON SEMOLATO II TABLA 14. SEGUNDA PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR LÁMPARA HALÓGENA METTLER EN SEMOLATO II TABLA 15. SEGUNDA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR ANALIZADOR ELECTRÓNICO SARTORIUS EN SEMOLATO TABLA 16. SEGUNDA DETERMINACIÓN DE HUMEDAD POR MÉTODO DE CERCANO INFRARROJO NIR EN SEMOLATO II...66 TABLA 17 ENSAYO PARA DETERMINAR EL TIEMPO ÓPTIMO DE SECADO EN LA ESTUFA MEMMERT UTILIZANDO DOS RECPIENTES...70 TABLA 18. PRUEBA T-STUDEN PARA DIFERENCIA DE SECADO EN CRISOLES...71 TABLA 19. PRUEBA T-STUDEN PARA DIFERENCIA DE SECADO EN PETRI...71 TABLA 20 PRUEBA T-SUDENT PARA DIFERENCIA DE SECADO CRISOLES VS PETRI EN 2 HORAS...72 TABLA 21 PRUEBA T-SUDENT PARA DIFERENCIA DE SECADO CRISOLES VS PETRI EN 3 HORAS...72 TABLA 22 TEMPERATURAS DE SECADO AL INTERIOR DE LA ESTUFA MEMMERT...73 TABLA 23 DETERMINACIÓN DE CENIZAS POR MÉTODO DE REFERENCIA Y NIR...76 TABLA 24 ENSAYO PARA DETERMINAR EL PORCENTAJE DE CENIZAS UTILIZANDO SEMOLATO II...76 TABLA 25 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA KJELDAHL VS NIR...80 TABLA 26 DETERMINACIÓN DE ACIDEZ...83

14 TABLA 27 DETERMINACIÓN DE ACIDEZ. ANALISTAS I Y II...84 TABLA 28 PRUEBA T-STUDENT PARA LA DETERMINACIÓN DE ACIDEZ...85 TABLA 29 RESUMEN ANÁLISIS DE VARIANZA...88 TABLA 30 PRUEBA T-STUDENT PARA CRISOLES - CAJAS DE PETRI CON SEMOLATO I...89 TABLA 31 PRUEBA T STUDENT PARA MÉTODOS ALTRNATIVOS DE HUMEDAD...89 TABLA 32 PRUEBA TUKEY PARA MÉTODOS DE HUMEDAD...90 TABLA 33 PRUEBA FISCHER PARA MÉTODOS DE HUMEDAD...90 TABLA 34 PRUEBA T-STUDENT PARA CRISOLES - CAJAS DE PETRI CON SEMOLATO II...91 TABLA 35 PRUEBA T STUDENT PARA MÉTODOS ALTERNATIVOS CON SEMOLATO II...91 TABLA 36 PRUEBA DE TUKEY PARA MÉTODOS DE HUMEDAD...92 TABLA 37 PRUEBA FISHER PARA MÉTODOS DE HUMEDAD...92 TABLA 38 DESCRIPCIÓN ESTADÍSTICA ESTUFA CON CRISOLES USANDO FIDEOS...97 TABLA 39 PRUEBA T PARA ESTUFA CON CRISOLES...97 TABLA 40 DESCRIPCIÓN ESTADÍSTICA LÁMPARA HALÓGENA METTLER...99 TABLA 41 PRUEBA T-STUDENT PARA LÁMPARA HALÓGENA METTLER DE PRODUCCIÓN...99 TABLA 42 PRUEBA T-STUDENT PARA METTLER VS ESTUFA TABLA 43 PRUEBA T-STUDENT PARA METTLER I VS ESTUFA II TABLA 44 PRUEBA T-STUDENT PARA CENZAS BASE HÚMEDA NIR VS MUFLA TABLA 45 PRUEBA T-STUDENT PARA CENZAS BASE HÚMEDA NIT II VS MUFLA TABLA 46 PRUEBA T-STUDENT PARA CENZAS BASE SECA METTLER I VS NIR I TABLA 47 PRUEBA T-STUDENT PARA CENZAS BASE SECA METTLER II VS NIR II TABLA 48 PRUEBA T-STUDENT PARA PROTEÍNA KJELDAHL I VS NR I...105

15 TABLA 49 PRUEBA T-STUDENT PARA PROTEÍNA KJELDAHL I VS NR I TABLA 50 RESMUEN ESTADÍSTICO ENSAYO I Y ENSAYO II TABLA 51 RESUMEN ESTADÍSTICO DETERMINACIÓN DE CENIZAS TABLA 52 RESUMEN ESTADÍSTICO DETERMINACIÓN PROTEÍNA TABLA 53 RESUMEN ESTADÍSTICO DETERMINACIÓN ACIDEZ TABLA 54 PARÁMETROS NORMATIVOS DE LOS MÉTODOS DE REFERENCIA TABLA 55. DISTRIBUCIÓN DE TAMAÑO DE PARTÍCULA DE PRODUCTOS QUE NO REQUIEREN...145

16 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 DATOS OBTENIDOS SULFATO DE SODIO DECAHIDRATADO...42 GRÁFICO 2 DATOS OBTENIDOS SULFATO DE AMONIO...44 GRÁFICO 3. DATOS OBTENIDOS OXIDO DE ZINC...46 GRÁFICO 4 DETERMINACIÓN DE CENIZAS MUFLA...75 GRÁFICO 5 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA KJELDAHL VS NIR...79 GRÁFICO 6 COMPARACIÓN DE ACIDEZ...83 GRÁFICO 7 DIFERENCIAS SARTORIUS I VS ESTUFA...93 GRÁFICO 8 DIFERENCIAS SARTORUS II VS ESTUFA...94 GRÁFICO 9 DIFERENCIAS NIR VS ESTUFA...95 GRÁFICO 10 DIFERENCIAS METTLER LABORATORIO VS ESTUFA...95 GRÁFICO 11. DIFERENCIAS METTLER PRODUCCIÓN VS ESTUFA...96 GRÁFICO 12 DIFERENCIAS NIR VS MUFLA GRÁFICO 13 DIFERENCIAS NIR VS KJELDAHL...105

17 LISTA DE ANEXOS ANEXO1 ANEXO 2 ANEXO3. ANEXO4. ANEXO5. Tablas de datos originales consolidadas Esquema ejemplo de procedimientos de rutina implementados Fichas técnicas de los insumos para proteína Protocolos de verificación y calibración de los equipos Figuras

18 GLOSARIO Analito: Cantidad particular sometida a medición. Blanco de Reactivos: Es el que se prepara simultáneamente con la muestra; está constituido por el solvente en que se disolvió la muestra y se procede con él en las mismas condiciones que la muestra pero no la contiene a ella. Blancos de Solvente: Es el que se utiliza cuando el método se aplica directamente sobre una solución de la muestra y no se adicionan reactivos de fijación o cromógenos. Se establece si el solvente origina alguna respuesta al aplicar el método y esta será tenida en cuenta. Si no hay respuesta, cualquier resultado será generado por parte de los analitos de la muestra. Calibración: Conjunto de operaciones que permite establecer, en condiciones experimentales definidas, la relación que existe entre los valores indicados por el instrumento de medición ó los valores representados por una medida materializada, con respecto a los valores obtenidos en la medida de un valor conocido. Duplicados: Determinaciones independientes de la misma muestra de ensayo, por parte del mismo analista, en el mismo tiempo y las mismas condiciones aplicando el análisis completo. Desviación Estándar Relativa: Corresponde a la relación entre el promedio y la desviación estándar de los datos, se expresa en porcentaje como el coeficiente de variación (CV % = 100 * desviación estándar / promedio). Ensayo Conjunto: Ensayo de desempeño de un método o laboratorio en el que se unen varios laboratorios en un experimento planeado y coordinado por un

19 laboratorio líder. Los ensayos de desempeño de métodos producen cálculos de precisión (repetibilidad, reproducibilidad) de los datos acumulados cuando varios laboratorios participantes estudian muestras idénticas con un método estrictamente normalizado. Estudio Colaborativo o Comparación de Métodos: Estudio sobre el funcionamiento de un método alternativo contra el método de referencia organizado por un laboratorio líder. Estudio Colaborativo Interlaboratorio: Estudio sobre el funcionamiento de un método alternativo contra el método de referencia con varios laboratorios utilizando muestras comunes organizado por un laboratorio líder. Especificidad: Habilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estén presentes. Típicamente éstos pueden incluir impurezas, productos de degradación, la matriz, etc. Estandarización del Método: Hace referencia a la tipificación o ajuste de las variabilidad esperada a un procedimiento de referencia o una normativa para aumentar la eficiencia del método. Evaluación Tipo A: Método de evaluación de incertidumbre mediante el análisis estadístico de una serie de observaciones. Con frecuencia se calculan la repetibilidad y la reproducibilidad realizando ensayos de desempeño del método conjunto cuando varios laboratorios estudian muestras idénticas provistas por un organizador central. Evaluación Tipo B: Método de evaluación de incertidumbre por medios diferentes al análisis estadístico de series de observaciones, por ejemplo a partir de supuestas distribuciones de probabilidad con base en la experiencia u otra información.

20 Exactitud de la Medición: Grado de proximidad entre una medida y el valor verdadero o esperado. Exactitud Relativa: Grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el método de referencia y la respuesta obtenida por el método alternativo en muestras idénticas. Gráfico de Control: Diagrama de dispersión bi-dimensional para monitorear el desempeño del método con valores de control obtenidos mediante un estudio Tipo A. Incertidumbre: Parámetro que caracteriza el intervalo de valores dentro del cual se espera que esté el valor de la cantidad que se mide. Incertidumbre Estándar: Incertidumbre del resultado de una medición expresada como desviación estándar. Incertidumbre de Medición: Parámetro asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podía atribuirse razonablemente al elemento medido. Intervalo de Aplicación: Intervalo de concentraciones de partícula que rutinariamente se someten a medición mediante un método. Intervalo de Validación: Intervalo del número promedio de partículas por porción analítica para el cual se ha demostrado en forma aceptable el cumplimiento de las especificaciones de validación (en especial la linealidad).

21 Límite de Detección: Mínima concentración detectable, pero que no puede cuantificarse (LOD). Número de partículas, por porción analítica, donde la probabilidad p 0 de un resultado negativo es igual al 5%. Límite de Determinación o Cuantificación: Valor de la concentración a partir de la cual los resultados tienen significado cuantitativo (LOQ). Concentración de partículas mínima promedio por porción analítica donde la incertidumbre estándar relativa esperada es igual a un valor especificado (RSD). Límite de Linealidad: Valor de la concentración a partir de la cual los resultados no tienen significado cuantitativo (LOL). Linealidad: Dependencia lineal de la señal en la concentración del analito. Ver proporcionalidad. Manejo De Muestras: Hace referencia fundamentalmente al recorrido de la muestra desde el momento mismo en que se obtuvo durante el muestreo, incluyendo su empaque, embalaje, condiciones de transporte hasta ingresar al laboratorio. Mantenimiento Correctivo: Operaciones programadas cuando el monitoreo permanente permite evidenciar que la respuesta dada por el equipo empieza a salirse de los intervalos establecidos mediante cartas de control. Este proceso deberá llevarse a cabo antes que se puedan generar resultados no sustentables. Mantenimiento Preventivo: Conjunto de operaciones que de forma periódica se realizan a los instrumentos analíticos para garantizar una larga vida en perfecto estado de funcionamiento.

22 Material de Referencia (RM): Material o sustancia en la cual se ha establecido que una o más propiedades pueden ser usadas para calibrar un aparato, valorar un método de medida o para asignar valores a los materiales. Material de Referencia Certificado (CRM): Material, tal como lo describe la ISO Guía 30, cuyo valor de una o más de sus propiedades ha sido certificado por procedimiento técnicamente valido, acompañado por un certificado trazable o cualquier otro documento emitido por el organismo certificador. Material Patrón o estándar de Referencia (SRM): Material emitido por la NIST al cual le certifican propiedades físicas y químicas específicas y con un certificado que reporta los resultados de la caracterización, la incertidumbre de la medida e indica el uso del material. Matriz: Muestra analítica sobre la cual se van a realizar los ensayos y la determinación de analitos. Las medidas químicas y microbiológicas dependen decisivamente de las muestras de análisis mientras que las medidas físicas son independientes de ellas. Método Alternativo: Método analítico que demuestra o estima la medida del mismo analito, para una categoría dada de producto, frente al método de referencia. Es la demostración que el resultado obtenido por el método alternativo es comparable a los obtenidos por el método de referencia usando un criterio estadístico durante el protocolo de validación. Método Cualitativo: Método de análisis cuya respuesta es la presencia o ausencia directa o indirectamente del analito en una cierta cantidad de muestra. Método Cuantitativo: Método de análisis cuya respuesta es la cantidad directa o indirectamente del analito en una cierta cantidad de muestra.

23 Patrones Primarios: Cada lote es analizado y su pureza especificada. La fuente se puede identificar y trazar. Siempre que sea posible la fuente debe ser trazable a patrones nacionales o internacionales. Rango de Linealidad: Intervalo de concentración del analito dentro del cual es confiable cualquier resultado obtenido y sobre el cual se puede aplicar las herramientas estadísticas, gráficas y matemáticas que permitan emitir un resultado final. Esto aplica en los métodos en los que se ha demostrado que la respuesta es lineal. Réplicas: Repeticiones de algunas etapas críticas del proceso analítico. Trazabilidad o Rastreabilidad: Propiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que pueda relacionarse con referencias establecidas, generalmente patrones nacionales o internacionales mediante una cadena ininterrumpida de comparaciones, cada una de ellas con incertidumbres determinadas. Validación: Confirmación por experimentación y la provisión de evidencia objetiva, que se cumplen completamente los requerimientos particulares para los cuales está diseñado y se aplica adecuadamente. Validación de Datos: Aplicación de un conjunto de criterios debidamente sustentados que permiten establecer la aceptación o rechazo de datos generados durante el proceso analítico que parecen ser anómalos. Validación de Métodos: Demostración formal del comportamiento de un método fundamentado en una serie de indicadores básicos como: exactitud, precisión, sensibilidad, intervalo lineal, selectividad, robustez.

24 Validación de Muestras: Aplicación de criterios y reglas claras que permitan garantizar que las muestras objeto de análisis son representativas y se pueden adecuar correctamente al proceso analítico de validación primaria, que es la comprobación experimental de que un método cumple criterios de calidad derivados teóricamente. Verificación: Demostración, mediante experimentos, de que un método establecido funciona de acuerdo con sus especificaciones cuando se emplea en la práctica. Verificación de calibración de equipo: Conjunto de operaciones periódicas que se realizan a un equipo de medida para asegurar que conserva su calibración y especificaciones de funcionamiento.

25 INTRODUCCIÓN El análisis fisicoquímico implementado a nivel de laboratorios de ensayo comprende la aplicación de una o varias técnicas elaboradas bajo la influencia del método científico; en el contexto de la evolución de las pruebas de ensayo y error ; en donde se busca establecer en forma objetiva la mejor aproximación de uno o varios parámetros de un material a un valor real, ya sea cualitativa o cuantitativamente, para ampliar el conocimiento y la visión que se tiene de los criterios que enmarcan la solución de algún problema relacionado con la naturaleza y el uso final que se pretende dar a dicho material. Esta aproximación se realiza con base en métodos establecidos en consensos internacionales en donde se cuenta con la participación de grupos representativos de la academia, la industria y el gobierno para la definición de los requerimientos en el uso de las técnicas, las metodologías, los instrumentos, los insumos, los equipos, los materiales de referencia y de los analistas; entre muchas otras variables involucradas en la obtención de la información a partir de los laboratorios destinados para las determinaciones analíticas y para los sistemas de aseguramiento de la calidad. La inclusión de dichas variables en la estimación de la información requerida inevitablemente hace que los datos obtenidos de los diferentes tipos de materiales estén sujetos a una incertidumbre propia en todas las mediciones de los ensayos, hecho que puede representar pérdidas económicas notables en el contexto industrial si no se conoce un nivel de confianza significativo de los datos emitidos por el sistema de control de calidad, en cuanto no se hayan asegurado y verificado las técnicas puesto que existen parámetros enunciados por las entidades normativas; a nivel nacional e internacional; que rigen las características de

26 calidad del producto terminado para garantizar la seguridad y el bienestar de los consumidores. Así mismo la incertidumbre, asociada a las mediciones realizadas en los laboratorios de ensayo, debe estar definida para los diferentes tipos de determinaciones con el objeto de poder estimar en forma más exacta la proximidad del valor obtenido con el valor esperado y con el valor teórico o real del analito. Es por ello que antes de empezar a determinar la incertidumbre de una técnica, de un equipo o de un instrumento se requiere contar con un método del ensayo que se encuentre validado y verificado, o sea, que se debe conocer cuál es el comportamiento de los datos obtenidos en términos de: exactitud, precisión, sensibilidad, selectividad, rango de linealidad, varianza, coeficiente de variación, repetibilidad, reproducibilidad y robustez, para poder garantizar que los resultados obtenidos por el método aplicado son absolutamente confiables. Entonces se tiene que, por lo general, las técnicas aplicadas en la determinación de analitos o de parámetros en la industria nacional agroalimentaria están basadas en los procedimientos emitidos por entidades internacionales generadoras de los métodos de ensayo normalizados, tales como: STANDARD METODOS, ASTM, AOAC, APHA ISO, ICMSF, USDA, FDA, Bacteriological Analytical Manual, American Public Health Association, National Food Processors, American Association of Cereal Chemists, Comité Europeo de Normalización CEN etc y estas directrices son acogidas por los estamentos nacionales que adoptan dicha legislación para divulgar las normas técnicas pertinentes a las condiciones propias de cada país. Por lo tanto cada industria acoge y adapta éstos métodos; previamente establecidos, aceptados y validados; para el montaje y mantenimiento de la plataforma que caracteriza el sistema de control de calidad analítica en el laboratorio. De esta forma es posible garantizar que los métodos de

27 ensayo implementados cuentan con los atributos de validación necesarios asegurando que los datos emitidos son confiables en el tiempo y bajo la variabilidad característica de los resultados para lo cual fueron diseñados. Por otra parte es evidente que cuando los laboratorios adoptan la metodología de la normativa internacional debe demostrar que las técnicas implementadas presentan las mismas características o atributos de validación (anteriormente mencionados) que los métodos que han sido validados en los ensayos colaborativos - interlaboratorios a nivel internacional, puesto que las condiciones varían debido a las diferentes características de los equipos utilizados, de los instrumentos empleados, de las condiciones ambientales, de la competencia técnica de los analistas, de las necesidades de los clientes, de las características inherentes de las materias primas, etc ; dicho procedimiento hace referencia a una validación secundaria puesto que se estiman los parámetros de validación propios de cada laboratorio en forma comparativa con los métodos de referencia. De acuerdo a lo anterior, es de notar que para poder sustentar métodos de ensayo basados en los métodos de referencia validados existe una etapa previa que contempla la verificación de las técnicas empleadas en el laboratorio mediante el desarrollo de series de datos sucesivos a partir de matrices que pueden ser reales, es decir con muestras de los materiales que normalmente serán sometidos a análisis de rutina, ó con matrices certificadas, o sea materiales que poseen las mismas características que las matrices a analizar y de los cuales se cuenta con una comprobación sustentable de la proporción de cada analito presente, con lo cual, es posible evidenciar la eficiencia de los equipos utilizados para cada método. Entonces teniendo series de datos obtenidas bajo condiciones similares es posible asumir una distribución normal e implementar los criterios básicos de la estadística descriptiva para definir las características de validación e implementar cartas o gráficos de control que permitan evaluar la variabilidad de los resultados dentro de los límites de control establecidos de acuerdo al promedio, la desviación

28 estándar, la varianza, etc y de esta forma esbozar a partir de las tendencias de los datos el comportamiento del método como tal, la confiabilidad de los datos emitidos por los equipos, la confiabilidad de los datos obtenidos mediante el trabajo de un analista, la confiabilidad de los datos obtenidos durante el tiempo, la calidad de los reactivos involucrados y los atributos de validación necesarios. Entonces cuando ya se tienen normalizadas o verificadas las técnicas, los laboratorios deben evidenciar que cuentan con patrones certificados e instrumentos calibrados que se interconectan entre sí hasta llegar al patrón físico fundamental 1, para asegurar que se parte de mediciones confiables y trazables de equipos e instrumentos debidamente verificados y calibrados. Considerando lo anteriormente descrito con referencia a la verificación de los métodos de ensayo en laboratorios de control de calidad, la estandarización y aseguramiento de las técnicas y el establecimiento del programa de calidad analítica se tiene que mediante el proyecto ESTANDARIZACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS ALTERNATIVOS USADOS EN CALIDAD EN LA COMPAÑÍA PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A. realizado en las instalaciones de la empresa ubicada en el Km. 5.6 troncal Occidente Vía Mosquera (Cundinamarca), se ha establecido el montaje de un programa modelo de mejoramiento continuo para el laboratorio de control de calidad con el objeto de brindar información confiable y valedera al resto de la compañía, que soporta la toma de las decisiones en la información emitida por las personas encargadas del control y el aseguramiento de la calidad en las diferentes líneas del proceso productivo, para finalmente brindar a los consumidores un producto de excelencia. Este modelo de mejoramiento continuo tiene como finalidad primordial verificar y estandarizar los métodos alternativos de ensayo implementados en el laboratorio de control de calidad, con base en los programas oficiales de validación de

29 métodos para confirmar la equivalencia de los resultados, los cuales, son indicadores primordiales en la toma de las decisiones internas de procesamiento a nivel del pastificio y el molino y también son indicadores de los requisitos legales con los cuales deben cumplir las diferentes presentaciones de pasta para garantizar un producto de óptima calidad a los consumidores. Para tal efecto, se ha realizado una verificación del estado operativo de las técnicas evaluando el mantenimiento y la calibración de los equipos e instrumentos involucrados en las determinaciones en conjunto con el profesional metrólogo de la compañía; también se evaluó el contexto normativo haciendo acopio de aquellas normas nacionales y aquellas internacionales que enuncian los parámetros legales dentro de los cuales se evaluó el estado de cumplimiento y mejoramiento de las técnicas aplicadas. Así mismo se realizaron series de datos por duplicado para cada técnica utilizando como matrices reales dos semolatos de trigo y una matriz de producto terminado en el caso de la humedad para estimar la repetibilidad, la reproducibilidad y las diferencias significativas en la obtención de los resultados entre los métodos de referencia y los métodos alternativos para la determinación de analitos como indicadores de calidad en las materias primas, los productos y subproductos de la molienda, los productos en proceso y los productos terminados. Por otra parte se tiene que para evidenciar la existencia de diferencias significativas en los resultados obtenidos en los diferentes métodos alternativos con respecto a los métodos de referencia se realizaron pruebas estadísticas, considerando una distribución normal de los datos a partir de un análisis de varianza, para la comparación de los métodos implementados por parejas mediante la prueba de t student; también se realizaron análisis estadísticos por comparaciones múltiples de todos los métodos, para cada analito en particular, 1 general/tesis_alicia_maroto.pdf. página 9

30 mediante las pruebas de Tukey y Fisher. Así mismo se establecieron las directrices más importantes de los aspectos técnicos enunciados en las Buenas Prácticas de Laboratorio con el objeto de brindar un soporte al cliente externo y/o interno de la veracidad de los resultados analizados asegurando la calidad en los procedimientos del laboratorio de control de calidad de la compañía. Finalmente se han establecido criterios básicos para la implementación del proceso de estandarización de los métodos alternativos existentes para la determinación de analitos contemplado la permanencia, seguimiento, modificación y evolución del modelo de mejoramiento continuo, que ha sido implementando bajo el sistema de gestión de calidad actual sin interferir o alterar los parámetros previamente definidos, lo cual demanda un lapso de tiempo relativamente prolongado para lograr el máximo nivel de aseguramiento en la calidad analítica del laboratorio de la compañía.

31 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Confirmar mediante un proceso de verificación y estandarización que los datos obtenidos a partir de los métodos alternativos usados para la determinación de analitos, son equivalentes a los datos obtenidos mediante los métodos de referencia implementadas en la compañía PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A. para la liberación de producto conforme de las diferentes referencias de pasta, cumpliendo con las normas legales vigentes y garantizando la confiabilidad de los resultados obtenidos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Verificar las condiciones operativas de las técnicas implementadas en la determinación de: % Humedad, % cenizas, % proteína y % acidez; según la NTC Establecer los indicadores propios de cada técnica para determinar el grado de cumplimiento del método, utilizando como trazadores materiales de referencia y matrices reales que garanticen la trazabilidad o rastreabilidad de cada método. Asegurar la calidad de los resultados analíticos mediante la implementación de cartas de control y el uso regular de materiales de referencia en la aplicación de los métodos. 2 Productos Alimenticios. Harinas, Féculas, Almidones y sus productos. Pastas Alimenticias, AOAC (1996, Virginia. 16 th Edition, Volume II, Chapter 34)

32 Estandarizar las técnicas rápidas (NIR, METTLER y SATORIUS) para la determinación de analitos contra las técnicas de referencia implementadas en el laboratorio según la NTC 1055.

33 1 MARCO DE REFERENCIA La validación de los diversos métodos analíticos, en concordancia con lo expresado en la ISO N.T.C (Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración, ) consiste en confirmar, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto. Tal confirmación requiere el empleo de la estadísticas como una herramienta que aporta evidencia concreta de las tendencias en los resultados que se obtienen para que así el analista esté en capacidad de conseguir datos confiables con técnicas de análisis validadas afrontando preguntas cómo: el método es exacto?, el método es preciso?, el método es robusto?, el método es reproducible?, existen datos anómalos? entre otras. Con base en los anteriores interrogantes es posible que el analista emita juicios reales, dejando a un lado el sesgo personal, y tome decisiones de las modificaciones o mejoras que requiera el método en particular según las exigencias establecidas por la normativa y por los clientes externos y/o internos del laboratorio. Por consiguiente es preciso contemplar en forma teórica y generalizada los aspectos más relevantes considerados en la validación de los métodos analíticos en armonía con las exigencias estipuladas para el cumplimiento y garantía de los resultados emitidos como parámetros de calidad, planteando la temática dentro de los siguientes componentes: 1

34 1.1 METODOS ANALÍTICOS Los métodos analíticos pueden ser comprendidos como los recursos elementales usados en un laboratorio con los cuales se busca determinar la presencia o la cantidad esperada de un analito de interés particular sobre una matriz específica en condiciones establecidas previamente. Además, para que la identificación y/o cuantificación del analito de interés sea válida es imprescindible que dicho método se encuentre reconocido antes de su implementación, ya sea por que sigue los lineamientos de la normativa internacional o por que se ha desarrollado todo un proceso de validación primaria o secundaria, por lo cual es prioritario que el laboratorio defina los estándares de calidad de la metodología analítica para poder garantizar la fiabilidad o confiabilidad de las medidas y de los resultados obtenidos. De acuerdo a lo anterior, es importante contar con una clara comprensión de los parámetros o indicadores de calidad así como de su relación con el sistema de aseguramiento de la calidad y buenas prácticas de laboratorio, debidamente documentado con el cual se respalda la confiabilidad de los resultados. Por otra parte se tiene que, en términos generales, el analito que se busca identificar o cuantificar es la cantidad particular sometida a medición, que para el caso particular y dependiendo del método, corresponde a los componentes o las macromoléculas presentes en la composición de las diferentes muestras de materias primas, materias en proceso o producto terminado, las cuales son sometidas a un análisis diferente para cada caso que debe tener un nivel de confiabilidad garantizado. En efecto, la determinación confiable de dichos analitos; estimados como indicadores de calidad en los procesos productivos; representa una medida de notable importancia para la comprensión del comportamiento de las variables 2

35 inherentes a los procesos puesto que es posible hacer estimaciones y/o tomar determinaciones a nivel macro con base en la cuantificación del analito, es decir se pueden estimar rendimientos, comparar materiales contra especificaciones o límites establecidos, o estimar valores monetarios. 1.2 CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALITICOS De acuerdo a la variedad de ensayos analíticos existentes, se hace necesario establecer categorías que faciliten el estudio y reconozcan el tipo de información que se requiere para la validación de un método analítico, para efecto de validación de metodología analítica tanto para el área de fisicoquímica como de microbiología, se tienen los siguientes métodos analíticos: Según alcance Tamaño de muestra Concentración de analito Precisión y exactitud, Trazabilidad Jerarquía Según el Alcance Métodos Racionales: son aquellos que son específicos para un analito o grupo de analitos. Métodos Empíricos o Aproximados: cuando el valor está definido por el procedimiento y la exactitud está determinada por definición. 3

36 Métodos Determinativos: cuando a través de ellos se cuantifica el contenido de un analito. Métodos Confirmativos: aquellos que son capaces de verificar la identidad del analito. Métodos Cuantitativos: aquellos cuya respuesta es la cantidad de un analito medido directamente como masa, volumen, recuento de organismos, o indirectamente por medida de absorbancia de un cromógeno, en una cierta cantidad de muestra. Métodos Cualitativos: aquellos cuya respuesta es solamente la presencia o ausencia de un analito cuya detección puede ser directa o indirecta en una cierta cantidad de muestra. Métodos Semicuantitativos: aquellos cuya respuesta es presencia o ausencia del analito pero tiene establecidos intervalos de respuesta, en algunos casos diferencial según el rango de concentración del analito. Permite posteriormente aplicar un método cuantitativo con un tamaño de muestra que contenga el analito en concentración adecuada según las características del método. Métodos Absolutos: los que se desarrollan y aplican exclusivamente con el uso de estándares primarios de referencia y estándares certificados. Métodos Relativos: se basan en el uso de estándares químicos, patrones y sustancias patrón. 4

37 1.2.2 Según el Tamaño de la Muestra Microanálisis: en el cual el tamaño de muestras utilizadas ha sido reducido en proporciones significativas. Semi microanálisis: en el que se ha escalado desde un método tradicional de macro análisis a fracciones cercanas (1/2, 1/4 ) Macroanálisis: métodos tradicionales en que se utilizan cantidades grandes de muestra y reactivos involucrados en el proceso Según Concentración del Analito Análisis de Macronutrientes: métodos en los cuales independiente del tamaño de la muestra el analito se encuentra en cantidades suficientemente altas como para ser detectado con exactitud y precisión adecuadas aplicando diferentes fundamentos analíticos. Análisis de Micronutrientes: métodos en los cuales se hace necesario aplicar fundamentos analíticos de mayor sensibilidad y el tamaño de la muestra hace parte de las limitantes de la determinación. Análisis de Trazas: métodos en los cuales la preparación de la muestra es un aspecto crítico ya que se busca recuperar altas concentraciones de un analito en volúmenes bajos de solución, adicionalmente se requiere el uso de equipos cuya sensibilidad de respuesta sea alta. 5

38 1.2.4 Según su Precisión y Exactitud Métodos Clase A: aquellos cuya relación Precisión / Exactitud es menor de 0.01% y se clasifican como P/E Muy Alta. Métodos Clase B: aquellos cuya relación Precisión / Exactitud se encuentra entre 0.01 y 0.1% y se clasifican como P/E Alta. Métodos Clase C: aquellos cuya relación Precisión / Exactitud se encuentra entre 0.1 y 1% y se clasifican como P/E Intermedia. Métodos Clase D: aquellos cuya relación Precisión / Exactitud se encuentra 1 y 10% y se clasifican como P/E Baja. Métodos Clase E: aquellos cuya relación Precisión / Exactitud se encuentra entra 10 y 35% y se clasifican como P/E Semicuantitativo. Métodos Clase F: aquellos cuya relación Precisión / Exactitud es superior a 35% y se clasifican como P/E Cualitativo Según su Trazabilidad Métodos Absolutos: son los que se encuentran relacionados directamente con patrones fundamentales (gravimétricos), son contrastados con la magnitud fundamental. 6

39 Métodos Estequiométricos: son aquellos que se encuentran relacionados directamente con estándares químicos primarios (elementos, compuestos).la instrumentación requiere calibración frente a patrones químicos (mol, isótopos) Métodos Relativos: son métodos fundamentalmente comparativos, requieren estandarización de la respuesta instrumental frente a patrones conocidos. La respuesta de las muestras se compara con la de estándares utilizados en diferentes concentraciones. Se requiere de curvas de calibración Según la Jerarquía y Calidad Propia del Método Métodos Estándar de Referencia (Official Methods, Gold Standard): son aquellos requeridos por ley o por regulación de agencias gubernamentales, o industrias reguladas por una agencia gubernamental. Son métodos cuya exactitud y precisión son conocidas y demostradas. Han sido designados como métodos aprobados para ser utilizados en análisis regulatorios. Métodos Estándar (Standard Methods) : estos tienen una precisión conocida y contrastada. Han sido desarrollados por organismos de prestigio internacional como la American Society for Testing and Materials ASTM, Association of Official Analytical Chemist AOAC, Bacteriological Analytical Manual BAM, Estos métodos involucran los estudios colaborativos o procedimientos similares de validación de métodos. Tanto estos como los oficiales son validados antes de ser publicados. Métodos Rápidos o de Barrido (Screening): son métodos cualitativos o semicuantitativos que se usan frecuentemente para determinar la presencia o ausencia de un analito especifico en una forma práctica, rápida y oportuna para determinarlo en un gran número de muestras, sin embargo en algunos casos es 7

40 necesario recurrir a un método de confirmación. Deberán ser validados y contrastados con método tradicionales más exactos y en matrices para poder emitir resultados confiables. Métodos de Revistas Analíticas. (Literature methods): son aquellos que se publican en revistas de prestigio generales y específicas, los cuales para ser aplicados deben ser sometidos a un cuidadoso proceso de validación. Métodos Desarrollados por el Laboratorio (In house Developed methods): los cuales deberán tener un soporte técnico y científico adecuado y deberán ser validados en las condiciones del laboratorio y posteriormente verificados mediante ensayos de eficiencia interlaboratorios. Normalmente se desarrollan para trabajos muy específicos de aplicación rutinaria dentro de un laboratorio para atender una necesidad analítica particular. Métodos Modificados: son generalmente métodos estándar u oficiales que ten han modificado en el laboratorio para usarlo en matrices diferentes de aquellas para las que fueron validados originalmente o para eliminar interferencias de algunas matrices complejas. Métodos de rutina: se trata generalmente de métodos oficiales o estándar que se han adaptado para el uso permanente en el laboratorio en un trabajo habitual y repetitivo sobre muestras prácticamente iguales. Métodos internos: se pueden desarrollar en un laboratorio para requerimientos particulares, reconociendo que se requiere de una validación, que incluya un estudio colaborativo. Muchos de los anteriores pueden ser métodos automatizados. 8

41 Métodos Automatizados: son aquellos que buscan disminuir al máximo los riesgos de errores aleatorios del operador y además incrementar notablemente la velocidad de respuesta. Estos métodos deberán ser validados y verificados contra los métodos estándar o de referencia para garantizar que la automatización no vaya en detrimento de la calidad del resultado analítico. 1.3 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS La validación de un método analítico es la demostración formal del comportamiento de un método fundamentado en una serie de indicadores básicos, tales como: exactitud, precisión, sensibilidad, intervalo lineal, selectividad y robustez con el objeto de resolver una incertidumbre analítica en particular. La Tabla 1 muestra que estos criterios de calidad pueden ser de tipo estadístico o bien de tipo operativo / económico. Tabla 1 Clasificación de los criterios de calidad analíticos TIPO ESTADISTICO Veracidad, Trazabilidad Precisión, Incertidumbre Representatividad Sensibilidad Selectividad Robustez Limite de detección Limite de cuantificación TIPO OPERATIVO / ECONOMICO Inversión Mantenimiento Rapidez Facilidades de Uso Simplicidad Fuente: Sánchez Maroto, Alicia. Incertidumbre en métodos analíticos de rutina. Tesis doctoral. Tarragona

42 La validación de las metodologías, junto a otras actividades englobadas en el control del aseguramiento de la calidad, permite demostrar a los laboratorios que sus métodos analíticos proporcionan resultados fiables. Por lo tanto el proceso de validación debe evidenciar que las condiciones propias del método cumplen con las exigencias para las cuales fue diseñado, entonces los parámetros a considerar varían según las exigencias legales de diferentes organizaciones y fundamentalmente del método analítico seleccionado y el uso para el cual está previsto. Por tanto en dependencia de la categoría del ensayo, los requisitos de validación necesarios son: Categoría I: Precisión, exactitud, especificidad, rango, linealidad y tolerancia. Categoría II: Precisión, exactitud, especificidad, rango, linealidad, tolerancia y límite de cuantificación. Categoría III: Precisión y tolerancia. También resulta pertinente considerar que en algunos sectores productivos, y en particular en el sector de los alimentos, es notable la necesidad de utilizar métodos de análisis cuantitativos totalmente validados para la determinación de los diversos parámetros o indicadores de calidad, puesto que se requiere contar con la capacidad de obtener datos oportunos y confiables que representen a la sociedad la garantía de que los productos ofrecidos corresponden a los estándares de excelencia normalizados para el sector agroalimentario. Por lo anterior es importante considerar que la validación de un método analítico; en aras de garantizar la calidad del producto terminado; es de considerable importancia en diferentes circunstancias ya que se requieren métodos fiables para cumplir con las normativas nacionales e internacionales en todas las áreas de análisis. Tales medidas incluyen el empleo de procedimientos de control de calidad interno y la participación en ejercicios interlaboratorios de aptitud bajo un estándar internacional. Fundamentalmente en este tipo de normativas se hace 10

43 especial hincapié, entre otras cosas, al establecimiento de la trazabilidad en las mediciones, quizás el eje central en la tarea de validar un método de análisis. Por lo tanto, está admitido internacionalmente que un laboratorio deba tomar las medidas pertinentes para asegurarse de que es capaz de producir, y de que produce efectivamente, datos con el nivel necesario de calidad en donde dichas medidas comprenden el empleo de métodos de análisis validados, además en el ámbito de aplicación de la normativa nacional se establecen los requisitos generales para la competencia en la realización de ensayos o de calibraciones, incluido el muestreo contemplando los ensayos y las calibraciones que se realizan con métodos normalizados, métodos no normalizados y métodos desarrollados por el propio laboratorio. Por su parte, el grado de validación requerido dependerá básicamente de la historia de uso del método y del ámbito donde éste se aplique, puede ir desde una simple comprobación hasta una validación completa. Entones se evidencia la necesidad de utilizar métodos validados para el desarrollo de las técnicas en concordancia con una serie de factores definitivos en el momento de garantizar la confiabilidad de los resultados analíticos, tales factores son: los planes de muestreo y manejo de las muestras, calibración y mantenimiento de los equipos, las condiciones ambientales, los procedimientos operativos, la conservación y el uso de los reactivos, la capacitación del personal e instalaciones apropiadas Incertidumbre y Garantía de Calidad Analítica La validación de métodos emplea un conjunto de pruebas que demuestran todas las hipótesis en las que se basa el método analítico, y establecen y documentan las características de rendimiento de un método, demostrando así si dicho método es adecuado para un propósito analítico particular. Las características de rendimiento de los métodos analíticos son, entre otras: la aplicabilidad, la 11