D.- La investigación ha sido presentada en otros eventos (ferias o muestras) científicos?

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1 C. Dónde han investigado? Mencione si se ha desarrollado parte, o toda la investigación en otras instituciones distintas a su Establecimiento Educacional. La fase práctica del proyecto fue desarrollada en los Laboratorios de Docencia del Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andrés Bello de Viña del Mar. D.- La investigación ha sido presentada en otros eventos (ferias o muestras) científicos? Sí No X Nómbralos (si la respuesta es sí): Han ganado premios? Sí No Nombre (s) de el/los premio(s): E. Resumen de la Investigación En no más de 150 palabras expliquen de qué se trata la investigación, cuál es su hipótesis, cómo se realizó y cuáles fueron sus resultados y conclusión. Usen oraciones concretas y concisas. Se ha demostrado que el cobre es un elemento eficientemente bactericida y por ello se le ha integrado gradualmente en distintas iniciativas industriales, sin embargo, su elevado costo y reactividad con agentes ácidos y oxidantes han limitado su uso masivo. Por ello, y en virtud que existen estudios que especulan una actividad bactericida en las aleaciones de cobre, nos propusimos investigar la capacidad bactericida de diferentes aleaciones de cobre de uso cotidiano como son las monedas de circulación nacional y extranjera con diferentes porcentajes de cobre (92, 89, 75, y 70 %) y la reactividad de las mismas en contacto con mayonesa casera. Inicialmente trabajamos con mayonesa envasada Hellmans, sin embargo, el ph ácido y probablemente aditivos presentes destruyeron las bacterias que colocamos en contacto con ese alimento. La bacteria utilizada fue Escherichia Coli cepa ATCC Colocamos caldo de cultivo con E. Coli en contacto con las distintas aleaciones de cobre durante 24 horas y mayonesa casera contaminada con E.Coli en contacto con cada moneda, luego contamos colonias y comparamos con los controles respectivos. La hipótesis a comprobar era que las aleaciones de cobre son igualmente bactericidas y que la efectividad de esta propiedad está ligada con el porcentaje de cobre presente, y a la vez, son menos reactivas frente a la oxidación al contacto con alimentos. Los resultados obtenidos avalan parcialmente la hipótesis, ya que todas las aleaciones mostraron una capacidad bactericida proporcional al porcentaje de cobre presente en ellas independientemente del metal con el que esté ligado. En cuanto a la reactividad frente a la oxidación en contacto con mayonesa, mayoritariamente reaccionaron observándose oxidación, a excepción de la aleación B (89% Cobre), probablemente debido a la acción de los otros elementos participantes de la aleación. 3

2 F. Qué les motivó a investigar? Señalen la situación o problemática sobre la cual se desarrolla esta investigación, considerando los antecedentes y el problema en su entorno. Es recomendable que hagan mención a información obtenida de diferentes fuentes bibliográficas consultadas Informados sobre la capacidad antimicrobiana del cobre y de que su uso como bactericida es limitado para la industria de alimentos por su reactividad con agentes ácidos y oxidantes, no es tan durable como el acero inoxidable y forma una pátina que podría percibirse como indeseable (http://www.cobrebactericida.org), nos propusimos investigar estas propiedades en las monedas de uso cotidiano confeccionadas con aleaciones de cobre, con diferentes porcentajes de este metal, comparar cuál de ellas es más efectiva como bactericida y determinar de qué manera reaccionan frente a la oxidación en contacto con alimentos de uso masivo. La capacidad antimicrobiana de las aleaciones de cobre fue reconocida en 2008 por U.S Environmental Protection Agency (EPA) que aprobó el registro de 275 aleaciones. (http://www.epa.gov/pesticides/factsheets/copper-alloy-products.htm). Probablemente, dependiendo de los resultados, se abrirían nuevas oportunidades para el uso de las aleaciones de cobre en el mercado de la industria alimentaria al mejorar o no presentar las características reactivas del cobre y tener análogamente propiedades antimicrobianas. Además podríamos derribar, en alguna medida, el mito de que las monedas son una fuente de propagación y contagio bacteriano. G.- Pregunta, Hipótesis y Objetivos: Delimiten en forma clara y precisa la pregunta de investigación, hipótesis (o respuesta tentativa a la pregunta de investigación, con claridad respecto a sus variables independiente y dependiente) y establezcan a partir de ella los objetivos del trabajo. Pregunta: Qué aleación de cobre utilizada cotidianamente como moneda es más efectiva en su acción bactericida y reacciona menos frente a la oxidación en contacto con alimentos? Hipótesis: Las aleaciones de cobre son bactericidas y su efectividad es proporcional al porcentaje de cobre presente, reaccionando menos a la oxidación en contacto con alimentos que el cobre puro. Objetivos: Objetivo General: - Determinar la capacidad bactericida y reactividad en contacto con los alimentos de diferentes aleaciones de cobre de uso cotidiano para proponer su aprovechamiento en soluciones tecnológicas en el área de la salud. Objetivos específicos: - Comprobar la capacidad bactericida de diferentes aleaciones de cobre. - Comparar la capacidad bactericida de diferentes aleaciones de cobre entre ellas. - Determinar la reactividad de las diferentes aleaciones de cobre frente a alimentos. - Comparar la reactividad de las aleaciones de cobre frente a la oxidación entre ellas y con el cobre puro al contacto con alimentos. - Proponer soluciones tecnológicas en el área de la industria alimentaria en base a la capacidad bactericida y reactividad de las aleaciones de cobre. 4

3 H.- Diseño y metodología de investigación. Realicen una descripción detallada (paso a paso) de cómo fue realizada la investigación. Dentro de esta descripción consideren: Qué se está midiendo, cómo se está midiendo, número de muestras, uso de grupo control, cada cuánto tiempo se realizan las mediciones, entre otras. Recuerden que Sólo se acepta el nuevo conocimiento, cuando el investigador indica claramente el camino recorrido para obtener su descubrimiento, de modo que otros puedan reproducir y verificar las observaciones y evidencias obtenidas. Experiencia 1: Eficiencia bactericida de aleaciones de cobre. Se seleccionaron monedas de diferente porcentaje de cobre y se le asignaron la siguiente simbología: - Aleación A: 92% de cobre; 6% de Níquel; 2% de Aluminio - Aleación B: 89% de Cobre; 5% de Aluminio; 5% de Cinc; 1% de Estaño. - Aleación C: 75% de cobre; 25% de Níquel. - Aleación D: 70% de Cobre; 24% de Cinc; 6% de Níquel. Las monedas se esterilizaron con radiación UV, 15 minutos por lado, en una campana de bioseguridad. Se trabajó con bacterias Escherichia coli, cepa no patógena, ATCC Determinación de la concentración inicial del cultivo de Escherichia coli : Del cultivo líquido de Escherichia coli en medio LB, se extrajeron 0,5 ml. con micropipeta para realizar un set de 8 diluciones seriadas 1:10 en tubos con 4,5 ml de caldo nutritivo en tubos de ensayo de 10 ml. Las diluciones se efectuaron tomando 0,5 ml de una dilución y colocándolo sobre 4,5 ml de caldo nutritivo en el tubo siguiente, agitando entre cada paso hasta la dilución -8. Para el conteo de las unidades formadoras de colonias (ufc) se extrajeron 0,1 ml de los tubos -4,-5,-6,-7,-8 de la dilución seriada y se sembraron en placas de petri con agar nutritivo, utilizando un asa de Drigaski que se pasa sobre el gar hasta que se siente áspero. Las placas fueron incubadas en estufa a 37 o C por 24 horas. Al día siguiente se realizó el conteo de las colonias bacterianas (ufc). Se registra y se tabula. De este cultivo se agregaron 0,005 ml a 20 ml de caldo nutritivo LB en frascos Schott como cultivo inicial para los experimentos posteriores. Todos los materiales usados fueron autoclavados. Determinación de la capacidad bactericida de las monedas con diferente porcentaje de cobre: Se agregaron dos de cada una de las monedas de aleaciones A, B, C y D en frascos Schott con el cultivo inicial y un control sin moneda. Todos los experimentos se realizaron en duplicado. Los frascos fueron incubados por 24 hrs a 37 C. Para la determinación de la concentración bacteriana luego de la incubación con las monedas, se extrajeron 0,5 ml. con micropipeta de cada frasco Shott para realizar un set de 8 diluciones seriadas 1:10 en tubos con 4,5 ml de caldo nutritivo en tubos de ensayo de 10 ml. Las diluciones se efectuaron tomando 0,5 ml de una dilución y colocándolo sobre 4,5 ml de caldo nutritivo en el tubo siguiente, agitando entre cada paso hasta la dilución -8. Para el conteo de las unidades formadoras de colonias (ufc) se extrajeron 0,1 ml de los tubos -4,-5,-6,-7,-8 de la dilución seriada y se sembraron en placas de petri con agar nutritivo, utilizando un asa de Drigalski que se pasa sobre el gar hasta que se siente áspero. Las placas fueron incubadas en estufa a 37 o C por 24 horas. Al día siguiente se realizó el conteo de las colonias bacterianas (ufc). 5

4 Experiencia 2: Eficiencia bactericida y reactividad de aleaciones de cobre en contacto con mayonesa contaminada. Contaminación de mayonesa. La mayonesa fue contaminada con un cultivo líquido de Echerichia coli, de concentración ufc/ml. De esta preparación se tomaron 2,5 ml. y se agregaron a 20 ml aproximadamente de mayonesa casera homogenizando con espátula. Reactividad de aleaciones de cobre en contacto con mayonesa contaminada. Se colocaron 1 moneda de cada aleación, más una moneda de cobre puro, sobre una placa de petri, en duplicado y sobre cada una de ellas 0,5 m. de la mayonesa contaminada con E. coli. Se utilizaron como control 0,5 ml. de mayonesa contaminada sobre una placa de Petri incubada a temperatura ambiente (control negativo 1) y otra placa de Petri con 0,5 ml mayonesa contaminada incubada a 37 o C (control negativo 2). Todas las placas se dejan incubando por 24 horas a temperatura ambiente, a excepción del control negativo 2. Al día siguiente, se observó el color de las monedas y se registraron las observaciones. Eficiencia bactericida de aleaciones de cobre en contacto con mayonesa contaminada. Para comprobar la efectividad bactericida también en este experimento, se arrastró la mayonesa de cada placa control, aleaciones y cobre puro con ayuda de espátulas y usando guantes de látex. La mayonesa arrastrada fue suspendida en un tubo con 2ml. de PBS (Buffer Fosfato Salino) cuidando que la mayonesa arrastrada quede en la solución y no arriba del tubo. El objetivo del PBS es desprender a las bacterias de la mayonesa. Se agitaron los tubos mediante Vortex. Para el conteo de las unidades formadoras de colonias (ufc) se extrajeron 0,1 ml de las diluciones -4,-5,-6,-7,-8 de cada experimento y se sembraron en placas de Petri con agar nutritivo, utilizando un asa de Drigaski que se pasa sobre el gar hasta que se siente áspero. Las placas fueron incubadas en estufa a 37 o C por 24 horas. Al día siguiente se realizó el conteo de las colonias bacterianas (ufc). Se registra y se tabula. I.- Materiales Mencionen los materiales relevantes utilizados en la investigación. Tubos de ensayo de 10 ml, placas de Petri, asa Loop, asa Drigalski, medio de cultivo líquido LB, medio de cultivo sólido LB, estufa de incubación, mechero, gradillas, guantes de látex, pipetas, micropipetas, puntas para micropipetas, espátulas, PBS, alcohol 70%, pinzas, vasos de precipitado, plumones, autoclave, CuSO 4. Monedas de aleaciones de cobre, moneda de cobre puro. Todos estos materiales deben ser debidamente esterilizados antes de su utilización. Cepa Echerichia coli ATCC Mayonesa casera. 6

5 J. -Resultados Presente los resultados (valores) obtenidos y procesados de su investigación. Usen tablas, gráficos u otra representación (2 como máximo, por el espacio disponible) que muestren de manera resumida sus resultados para una mejor comprensión. Experiencia 1: Tabla 1: Comparación del crecimiento bacteriano del cultivo control de E.coli con cultivos incubados en contacto con aleaciones de cobre (monedas). Cultivos Concentraciones x10 ⁵ [ufc/ml] Cultivo Inicial Control Observaciones: el cultivo se realizó durante 24 horas a 37 C. Experiencia 2: Tabla 2a: Comparación del crecimiento bacteriano en mayonesa contaminada con E. coli control y en contacto con monedas. Cultivos de mayonesa casera Concentración 10 4 [ufc/ml.] contaminada con E.coli Cultivo inicial Control 1 a 3140 Control 2 a 37 o C 4352 Aleación A 1710 Aleación B 3088 Aleación C 2508 Aleación D 2852 Moneda de Cobre

6 Tabla 2b: Reactividad de las aleaciones de cobre en contacto con mayonesa contaminada con E.coli Monedas en contacto con mayonesa contaminada con E. coli Color después de la incubación Reactividad oxidativa Fotos Control s/ moneda 24 hrs Amarillo de mayonesa No Control s/ moneda a 37 o C 24 hrs Amarillo de mayonesa No Aleación A Aleación B Aleación C Aleación D Cobre Verde amarillento en moneda en contacto c/ mayonesa Amarillo de Mayonesa Verde oscuro en moneda en contacto c/ mayonesa Verde muy oscuro en moneda en contacto c/ mayonesa Verde muy oscuro Si No Si Si Si K.- Análisis y discusión de los resultados A partir de los gráficos y tablas, interprete los resultados. Dentro de este análisis considere: qué dicen los resultados, logro de objetivos, validación o refutación de la hipótesis, limitaciones o problemas durante el desarrollo de la investigación. Considere también la comparación de sus resultados con la bibliografía consultada ( se contradicen, se refuerzan, hay nuevos hallazgos?). En la Experiencia 1, que intentaba comprobar y comparar la eficiencia bactericida de las aleaciones de cobre de uso cotidiano representadas por monedas, se observa una tendencia a la disminución de bacterias E.coli en todos los cultivos en contacto con monedas de aleación de cobre, respecto del control sin monedas. Cabe destacar que incluso las aleaciones A y B, evidenciaron menos colonias bacterianas que el cultivo inicial, lo que evidencia su poder bactericida. Comparando la efectividad bactericida de las aleaciones de cobre, se puede observar que aquellas con mayor porcentaje de cobre (A; 92% y B; 89%) fueron las aleaciones de mayor eficiencia, destacándose la aleación A por sobre la B y ambas por sobre las aleaciones C (75% de cobre) y D (70% de cobre). Esto demostraría que las aleaciones de cobre tienen 8

7 un poder bactericida en E.coli con una tendencia proporcional al porcentaje de cobre presente. Si se tiene en cuenta el costo del cobre superior al de sus aleaciones, estos resultados avalarían el uso de aleaciones de cobre de manera más masiva y económica en el área alimentaria. Además, considerando que las monedas de circulación en nuestro país contienen en su mayoría 92% de cobre ($10, $50, $100 antiguas y nuevas), se podrían considerar como una fuente bactericida que pasa de mano en mano, derribando parcialmente el mito que las monedas son una fuente de contagio y propagación de bacterias, por lo menos para la Escherichia coli. El incremento observado en la cantidad de colonias bacterianas desde el cultivo inicial ( ) al control ( ) después de 24 horas de incubación a 37 C, indica un crecimiento normal esperado dada las condiciones de temperatura, nutrientes, salinidad y ph del caldo de cultivo. En relación al experimento 2, se observa un significativo descenso en el número de bacterias (medido en ufc) presentes en la mayonesa incubada en contacto con la aleación A ( ), en comparación con los controles sin aleación a temperatura ambiente ( ) y a 37 o C ( ), lo que avala los resultados anteriores sobre la eficiencia bactericida de las aleaciones de cobre. En ambas experiencias, la aleación A resultó ser la más eficiente. Esto concuerda con los antecedentes bibliográficos que presumen una eficiencia proporcional al porcentaje de cobre presente en la aleación. Sin embargo, lo revelador es que esta eficiencia observada para el contacto con mayonesa casera, no es así al realizar el mismo experimento con mayonesa envasada contaminada, donde no fue posible la detección de E.coli luego de la incubación (resultados no mostrados). Esta diferencia la atribuimos a la acidez que obliga la norma sanitaria para la conservación de este alimento, ph < 4,0. En cambio, la mayonesa casera usada registró un valor de ph 5,5, más cercano al ph neutro óptimo para el crecimiento de E.coli. También es importante destacar que la concentración de E.coli en la mayonesa en contacto con la aleación A fue inferior a la encontrada en contacto con cobre puro, lo que resulta ser un dato relevante y digno de ser considerado en posteriores estudios. En cuanto a las otras aleaciones (B,C,D) en contacto con mayonesa casera contaminada todas mostraron una reducción de la concentración de E.coli en comparación a los controles sin aleación, tanto a temperatura ambiente como a 37 o C, no observándose diferencias significativas entre ellas, tampoco en relación a la eficiencia antimicrobiana del cobre puro. Respecto a la reactividad oxidativa de las aleaciones frente al contacto con mayonesa, se observaron diferentes reactividades, dependiendo de la aleación (Tabla 2b). La aleación B (89% de cobre), resultó ser la menos reactiva al no presentar oxidación, evidenciado al no variar el color después de 24 horas de incubación. Este resultado es importante ya que si consideramos las dos propiedades estudiadas: eficiencia bactericida y reactividad frente a alimentos, la aleación B es la aleación que podría sustituir al cobre puro al presentar acción antimicrobiana elevada y un comportamiento mejor frente a la oxidación en contacto con mayonesa, lo que podría ser muy útil, por ejemplo, en almacenamiento de alimentos en el área alimentaria. En relación a la reactividad con mayonesa del resto de las aleaciones, la aleación A presentó un efecto menor que las aleaciones C y D y que el cobre puro. Los resultados obtenidos, responden claramente la pregunta de investigación planteada en el proyecto y avalan parcialmente la hipótesis propuesta, ya que existe una tendencia bactericida proporcional al porcentaje de cobre presente en la aleación, y algunas aleaciones resisten de mejor medida la acción oxidativa que el cobre puro, coincidentemente estas dos propiedades se encuentran en las aleaciones A y B. 9

8 L. Conclusiones. Describan en 3 o 4 oraciones lo más relevante de su investigación. Consideren si se comprueba o rechaza la hipótesis, cómo responden nuestros resultados a los objetivos planteados, qué otra experiencia y hallazgos obtenidos de esta investigación pude servir a otros investigadores. Al finalizar la investigación, concluimos: 1.- Se comprueba la capacidad bactericida de las aleaciones de cobre, existiendo una tendencia positiva proporcional al porcentaje de cobre presente. 2.- La aleación de composición 89% de Cobre; 5% de Aluminio; 5% de Cinc; 1% de Estaño es la más resistente a la oxidación en contacto con alimentos, seguida por la aleación de composición 92% de cobre; 6% de Níquel; 2% de Aluminio. Entre estas aleaciones existe una relación inversamente proporcional entre la reactividad oxidativa en contacto con mayonesa y el porcentaje de cobre de las diferentes aleaciones. 3.- Las aleaciones de menor porcentaje de cobre 75 y 70 % son las más reactivas frente a la oxidación en contacto con mayonesa, igualando a la reactividad del cobre puro en estas condiciones. 4.- Las monedas de divulgación nacional con 92% de cobre son altamente efectivas como bactericidas en la Escherichia coli. M. Proyecciones. En máximo 4 oraciones las proyecciones qué pueda tener su investigación - Seguir experimentando con la aleación B de composición 89% de Cobre; 5% de Aluminio; 5% de Cinc; 1% de Estaño, en relación a su reactividad en contacto con otros alimentos y relacionar este comportamiento con la composición o presencia de los otros componentes de la aleación. - Proponer la aleación B como una nueva alternativa de almacenamiento de alimentos en la industria alimentaria, considerando su alta capacidad antimicrobiana demostrada en E.coli y la nula o baja reactividad ante la oxidación en contacto con alimentos como la mayonesa. N.- Bibliografía 1.- Valenzuela, Catalina, Caracterización reológica de mayonesa formulada con fibra de trigo, 03 de Septiembre Cobre Bactericida, aleaciones, 10 de Agosto Banco Central de Chile, monedas, 17 Mayo NOTA: Los espacios destinados a cada ítem dentro del formulario pueden ser adaptados según las necesidades de cada trabajo, respetando el límite máximo de 10 carillas. 10

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