PAPEL DE LAS CAVEOLAS/CAVEOLINA-1 EN LA FISIOLOGÍA DEL ADIPOCITO

Transcripción

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Biología Universidad de Barcelona PAPEL DE LAS CAVEOLAS/CAVEOLINA-1 EN LA FISIOLOGÍA DEL ADIPOCITO Elena González Muñoz Tesis Doctoral Barcelona, 2007

2 INTRODUCCIÓN

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4 1 Definición y características de los rafts lipídicos El modelo de organización de la membrana plasmática de Singer-Nicholson llamado mosaico fluido propone que la bicapa lipídica funciona como un solvente bidimensional neutral, que tiene poca influencia sobre la función de las proteínas de membrana. Sin embargo, hoy sabemos que las membranas celulares contienen gran variedad de lípidos que difieren en sus propiedades físico-químicas y que las interacciones entre lípidos dan lugar a organizaciones laterales heterogéneas en el plano de la membrana plasmática. Un tipo de estas organizaciones es lo que se denominan rafts lipídicos (lipid rafts) (Sankaram and Thompson, 1990; Simons and Ikonen, 1997a). Simons e Ikonen (Simons et al., 1997a), propusieron un modelo de membrana plasmática donde la organización lateral de colesterol y esfingolípidos (esfingomielina y glicoesfingolípidos) en la cara exoplasmática de la bicapa crea plataformas flotantes denominadas rafts (balsas) en un entorno rico en glicerofosfolípidos (Figura 1). Cara exoplasmática Fase líquida desordenada Fase líquida ordenada Fase líquida desordenada Cara citoplasmática Figura 1 Modelo de organización lipídica en los microdominios rafts según Simons e Ikonen. La cara exoplasmática está enriquecida en glicoesfingolípidos y esfingomielina. (Adaptado de (Simons and Toomre, 2000b). 1

5 La formación de los microdominios rafts depende principalmente de las propiedades biofísicas de los glicerofosfolípidos y esfingolípidos (Harder and Simons, 1997). En la bicapa lipídica, las diferentes especies de lípidos están distribuidas de forma asimétrica entre la cara exoplasmática y la citoplasmática (figura 1). En la cara exoplasmática, los esfingolípidos se asocian lateralmente, mediante interacciones débiles, a través de las cabezas de carbohidratos de los glicoesfingolípidos. Las agrupaciones de estos carbohidratos de los esfingolípidos ocupan áreas más grandes que sus cadenas de hidrocarbonadas lipídicas predominantemente saturadas. Los espacios vacíos entre los esfingolípidos asociados lateralmente son ocupados por moléculas de colesterol que funcionan como espaciadores (Simons et al., 1997a; Simons and Vaz, 2004). La cara citoplasmática de los rafts está probablemente enriquecida en fosfolípidos con ácidos grasos saturados y colesterol, aunque su caracterización todavía es incompleta (Parton and Richards, 2003). Consideraciones teóricas predicen que un empaquetamiento en forma de fase líquida ordenada en la cara exoplasmática lleva a un empaquetamiento más ordenado también en la cara citoplasmática (Israelachvili, 1973). No está del todo claro cómo interaccionan la cara exoplasmática y la citoplasmática. Una posibilidad es que los ácidos grasos largos de los esfingolípidos (generalmente una amida unida a la base de la esfingosina) penetren en la otra cara y acoplen la cara citoplasmática y la exoplasmática mediante interdigitaciones. Las proteínas transmembrana podrían estabilizar este acoplamiento (Simons et al., 2000b). La membrana que rodea a los rafts lipídicos es más fluida, porque contiene fosfolípidos con ácidos grasos insaturados; es decir, los rafts lipídicos forman una fase líquida ordenada en la bicapa lipídica, dispersos en una matriz líquida desordenada de glicerolípidos insaturados (Schroeder et al., 1994; Brown and London, 1998a; Simons et al., 2000b). El colesterol se distribuye preferentemente en la fase líquida ordenada, en comparación con la matriz de fase líquida desordenada de la membrana, y es esencial para el mantenimiento de las dos fases. (Simons and Ikonen, 2000a). Los métodos usados para determinar la medida, la forma y la localización de los rafts lipídicos han dado resultados diferentes. Así, por ejemplo, el estudio de los rafts mediante la técnica convencional del FRET (fluorescence resonante energy transfer) no permite establecer la medida del raft lipídico, probablemente porque la densidad de la proteína marcada es tan baja que no puede soportar el FRET intermolecular (Kenworthy et al., 2000). Mediante la técnica del laser trap la medida de los rafts lipídicos es de unos 50nm y mediante el entrecruzamiento molecular (molecular cross-linking) la medida es de unos 70nm (Pralle et al., 2000) (resumen tabla 1). Tampoco se han podido aislar rafts lipídicos en estado nativo. Para aislar y caracterizar los rafts se ha utilizado la característica de que son insolubles en Tritón-X-100 al 1% a 4ºC y en otros detergentes no iónicos, como CHAPS ( 3-[(3-cholamido propyl)-dimethylammonio]-lpropane sulfonate) también a 4ºC (Brown and Rose, 1992; Parton and Simons, 1995). 2

6 TÉCNICA INFORMACIÓN COMENTARIOS Densidad de flotación de las membranas resistentes a detergentes (DRMs) Antibody patching y microscopía de inmunofluorescencia Microscopía electrónica Crosslinking químico Single fluorophore tracking microscopy Identifica posibles elementos (proteínas, lípidos )asociados a rafts Identifica posibles asociaciones a rafts. Determina la localización de componentes de los rafts. Identifica complejos proteicos en raft nativos Monitoriza la difusión y el movimiento de proteínas o lípidos individuales de los rafts Microscopía de fuerza fotónica Determina la constante de difusión, tamaño y movimiento de rafts individuales FRET (fluorescence resonante energy transfer) Detecta si dos componentes del raft están espacialmente juntos (por ejemplo, < 10nm) Laser trap Determina el tamaño y movimiento de los rafts Fácil de hacer La técnica más común usada para identificar posibles proteínas involucradas en señalización Posibles resultados artefactuales Asociaciones débiles con los rafts son difícilmente detectables Fácil de hacer Uso habitual Mejor que la densidad de flotación para detectar interacciones débiles La variabilidad entre células hace que sea difícil la cuantificación Resultados prometedores Requiere experiencia en la técnica Comienza su uso La elección de las condiciones y reactivos adecuados es semiempírica Requiere un equipamiento y personal altamente especializado Técnica muy informativa Requiere un equipamiento y personal altamente especializado Adquisición y análisis muy lento Técnica informativa La elección de las sondas donante y aceptora es muy importante Requiere un equipamiento y personal altamente especializado Tabla 1. Resumen de algunas técnicas para identificar rafts lipídicos. Adaptada de (Simons et al., 2000b). La alteración de los rafts mediante la eliminación o secuestro del colesterol ha sido muy útil como control para cada una de estas técnicas (tabla2) En función de la metodología utilizada en el proceso de extracción y del tipo celular usado, la composición de los rafts lipídicos es muy variable y este hecho ha llevado a una variada y confusa nomenclatura a la hora de designar a estos microdominios: DRMs (detergent resistant membranes), DIGs (detergent insoluble glycolipid rich domain), DIC (detergent insoluble complex), TIFF (Tritón-X-100 insoluble floating fraction), LDM (low density membranas). Actualmente, la definición más aceptada para designar a los rafts es la propuesta por Toomre et al. (2000). Según estos autores, los rafts lipídicos se caracterizan por: Su composición: glicoesfingolípidos, colesterol, proteínas con grupos acil, proteínas transmembrana Sus propiedades: nm de diámetro, movilidad (-10-8 cm -2 seg -1 ), es una fase líquida ordenada Los rafts nativos sólo se observan en células vivas Son membranas resistentes a detergentes no iónicos (DRMs) Así, en el reciente congreso Keystone Symposium on Lipid Rafts and Cell Function (March 23-28, 2006 in Steamboat Springs, CO) se definió a los rafts lipídicos como dominios de membrana pequeños (10-200nm), heterogéneos, altamente dinámicos, y altamente enriquecidos en esterol y esfingolípidos. Estos dominios especializados de la membrana 3

7 plasmática compartimentalizan procesos celulares. Pequeños rafts en ocasiones pueden estabilizarse y formar plataformas mayores mediante interacciones proteína-proteína y proteína-lípido (Pike, 2006). Una aproximación muy usada para la investigación de los rafts ha sido la manipulación de sus constituyentes lipídicos (tabla2). Estos tratamientos llevan a la disociación de proteínas de los rafts, lo cual puede ser detectado mediante las técnicas usadas para analizar la asociación a rafts (tabla1). Secuestro del colesterol Eliminación del colesterol Inhibición de la síntesis de colesterol Perturbación de la estabilidad de los rafts Antibióticos: Filipina, Nistatina, Amphotericina Agentes formadores de poros: Saponina, Digitonina, Streptolisina O -ciclodextrina, metil- -ciclodextrina Lovastina Colesterol exógeno Gangliósidos exógenos Ácidos grasos poliinsaturados exógenos Tabla 2. al., 2000b). Herramientas comunes usadas para alterar los rafts lipídicos. Adaptada de (Simons et 1.1 Proteínas asociadas a los rafts lipídicos Una de las propiedades más importantes de los rafts lipídicos es que pueden incluir o excluir diferentes clases de proteínas (Brown et al., 1998a). Dentro de las proteínas con afinidad por los rafts encontramos: Proteínas unidas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) de la cara externa de la membrana. Se localizan en los rafts a través de las interacciones con la cadena acil (Brown et al., 1992; Rodgers et al., 1994; Brown et al., 1998a; Hooper, 1999; Chatterjee and Mayor, 2001). Proteínas de membrana doblemente aciladas como las quinasas de la familia Src y las subunidades de las proteínas G heterotriméricas. Estas proteínas presentan el motivo Met-Gly-Cys en el dominio N-terminal donde el residuo Gly esta miristoilado y el residuo Cys está palmitoilado, y mediante estas modificaciones lipídicas se anclan a la membrana (Resh, 1999). Proteínas asociadas a colesterol, como las caveolinas (Kurzchalia and Parton, 1999). Proteínas palmitoiladas y/o miristoiladas como las flotilinas (Rajendran et al., 2003). Proteínas transmembrana que a menudo están palmitoiladas (Brown and London, 1998c). Proteínas unidas a fosfolípidos, como las anexinas (Babiychuk et al., 2002). Las proteínas unidas a GPI o que presentan alguna modificación hidrofóbica (como palmitoilaciones), se anclan a los rafts de la membrana mediante estas moléculas o modificaciones. Todavía no está claro como se asocian a los rafts las proteínas transmembrana, aunque parece ser que los aminoácidos de estos dominios transmembrana próximos a la cara exoplasmática tienen un papel clave (Scheiffele et al., 1997), en cualquier caso, los dominios transmembrana de las proteínas tienen que estar intercalados de tal manera que se mantenga la estructura rígida de la fase líquida ordenada (Simons et al., 2000a). 4

8 Como hemos visto, muchas de las proteínas ancladas a los rafts lipídicos, lo hacen mediante modificaciones lipídicas (palmitoilaciones y/o miristoilaciones) que comparten el hecho de tener dos cadenas acil muy próximas espacialmente. Este hecho sugiere que la acilación, y especialmente la acilación múltiple, podría ser un mecanismo general que permite la localización de las proteínas en los rafts lipídicos. Aunque hay que destacar que no todas las modificaciones lipídicas permiten la localización en caveolas, el grupo prenil por ejemplo es demasiado voluminoso para permitir el anclaje en los rafts aunque presenta la misma hidrofobicidad que los grupos acil (Melkonian et al., 1999). De la misma manera, aunque las modificaciones post-traduccionales como la palmitoilación, incrementa la afinidad de las proteínas por los rafts, no es suficiente para una asociación estable, y hay proteínas palmitoiladas que no se localizan en los rafts lipídicos. La afinidad por los rafts de membrana también se incrementa con la oligomerización o entrecruzamiento (crosslinking) de algunas proteínas como caveolina-1 o src-like Tyrosine Kinase fyn (Harder et al., 1998). 1.2 Formación y distribución de los rafts lipídicos El colesterol se sintetiza en el retículo endoplasmático, mientras que la síntesis de esfingolípidos y las posteriores modificaciones de sus cabezas polares ocurren en el complejo de Golgi (van Meer, 1989). La asociación del colesterol con los esfingolípidos para formar los rafts lipídicos también ocurre en el complejo de Golgi (Brown and London, 1998b). Desde el complejo de Golgi, los rafts se distribuyen en la superficie celular donde se enriquecen con colesterol y esfingolípidos (van Meer, 1989). Los rafts no son estructuras estáticas en la membrana plasmática, sino que continuamente se internalizan hacia endosomas tempranos. Desde estos endosomas regresan otra vez a la membrana plasmática o bien, pueden dirigirse al complejo de Golgi (Mukherjee and Maxfield, 2000). Los rafts son abundantes en la membrana plasmática, pero también se encuentran en la vía biosintética y endocítica (Simons and Gruenberg, 2000). La distribución de los rafts en la membrana plasmática depende del tipo celular. En las células polarizadas como las células epiteliales o las neuronas los rafts lipídicos se acumulan en la membrana apical y axonal respectivamente. La membrana basolateral y somatodendrítica también contiene rafts pero en menor proporción (Fridriksson et al., 1999). En cambio, en las células no polarizadas como los fibroblastos o los adipocitos, los rafts están distribuidos por toda la superficie celular. 1.3 Función de los rafts lipídicos Los rafts no sólo sirven para la distribución de los lípidos y proteínas en la superficie celular y en otros orgánulos celulares, sino que también actúan como plataformas para el transporte a través de membrana o como estaciones en la señalización intracelular (Simons and Ikonen, 1997b). Los rafts lipídicos se han involucrado en el mecanismo de transducción de señales hormonales ya que aseguran la especificidad y la fidelidad de la interacción de los ligandos con sus receptores durante la transducción de la señal (Toomre et al., 2000). La localización de ciertos receptores en los rafts permite generar un microambiente donde el estado de fosforilación del receptor se puede modificar mediante quinasas y fosfatasas locales, sin afectar otras cascadas de señalización. Los rafts también permiten el reclutamiento de receptores activados de manera que se amplifica la señal generada, como es el caso del receptor de IgE 5

9 (Fc RI) y el receptor activado por antígeno en las células T (TCR)(Simons et al., 2000b; Li et al., 2006). Los rafts también se han implicado en la activación de respuestas inmunes (Langlet et al., 2000; Pavon et al., 2006), en segregar y concentrar proteínas (Brown et al., 1998a; Michel and Bakovic, 2007) y en generar y mantener la polaridad celular (Simons et al., 2000b). Finalmente, los rafts también se han involucrado en la entrada de virus sin cápsula, como el SV40 (Parton et al., 2003) y en el ensamblaje y salida de nuevos viriones (Takeda et al., 2003). 1.4 Rafts lipídicos y caveolas Las caveolas son un subtipo de raft lipídico identificado por Palade y Yamada (Yamada E, 1955) en los años 50 en base a su morfología. Son invaginaciones uniformes de la membrana plasmática en forma de flascón o de letra omega ( con un diámetro de nm que se caracterizan por la presencia de caveolina, una proteína integral de membrana palmitoilada que está unida a colesterol y glicoesfingolípidos, cuya oligomerización da lugar a la formación de estas estructuras, las caveolas (Kurzchalia et al., 1999) (Figura 2). A B Proteínas Proteïnes ancladas ancorades a rafts a rafts lipídicos lipídics Caveolina Figura 2 Modelo de organización de los rafts lipídicos y las caveolas en la membrana plasmática. A. Proteínas ancladas a los rafts, mediante la unión a GPI, mediante las colas acil (proteína YES), o mediante el dominio transmembrana (HA). B. Caveola originada por la oligomerización de la caveolina que se ancla a los rafts mediante la unión a colesterol y por la acilación de cisternas C- terminales. Adaptada de (Simons et al., 1997a). 6

10 La sobreexpresión de caveolina-1 en células que carecen de caveolina/caveolas, como los linfocitos o las neuronas, induce la formación de caveolas (Fra et al., 1995b) en varios sistemas celulares diferentes como las células Caco-2, las células FRT (Fischer rat thyroid cells) o los MEFs de ratones cav1-/- (Lipardi et al., 1998; Vogel et al., 1998; Breuza et al., 2002; Kirkham and Parton, 2005b). En cambio, la eliminación de caveolina-1 en los ratones KO de caveolina-1 lleva a la desaparición de estas estructuras morfológicamente reconocibles en la membrana plasmática (Drab et al., 2001; Razani et al., 2002a). 2 Caveolas y caveolina Como acabamos de definir, las caveolas son un subtipo de raft lipídico, que se identifican morfológicamente en la membrana plasmática como invaginaciones de nm de diámetro con un cubierta estriada característica observada mediante la técnica de freeze drying, que le confieren los oligómeros de caveolina que la constituyen (Rothberg et al., 1992). Por microscopía electrónica se ha observado que las caveolas se pueden presentar como estructuras individuales o bien formando racimos. En algunas células, como en los adipocitos, es frecuente observar caveolas rodeando vacuolas conectadas con la superficie plasmática (Figura 3). Se ha estimado que aproximadamente 144 moléculas de caveolina-1 están presentes en una caveola individual, mediante la cuantificación de la intensidad de fluorescencia de una construcción caveolina-1-gfp (green fluorescence protein) sobreexpresada en fibroblastos (Pelkmans and Zerial, 2005b). La cantidad relativa de colesterol que se ha descrito en caveolas inmunoaisladas es de unas moléculas (Ortegren et al., 2004). Las caveolas están normalmente estabilizadas en la membrana plasmática mediante el citoesqueleto de actina. A partir de estudios fundamentados en la técnica del doble híbrido en levaduras, se detectó que la filamina era un ligando de la caveolina-1 (Stahlhut and van Deurs, 2000; van Deurs et al., 2003) Las caveolas son especialmente abundantes en ciertos tipos celulares diferenciados como son los adipocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y estriado, pneumocitos y fibroblastos (Scherer et al., 1994; Scherer et al., 1996; Tang et al., 1996; Scherer et al., 1997). También se han descrito, aunque en menor cantidad, en células del sistema inmunitario y del sistema nervioso (Gargalovic and Dory, 2001; Gargalovic and Dory, 2003; Bu et al., 2003) El número de caveolas es muy reducido o están completamente ausentes en muchas líneas celulares transformadas oncogénica o víricamente (Koleske et al., 1995) y en muchas células cancerosas humanas (Lee et al., 1998). En los adipocitos, las caveolas representan el 30% de la superficie de la membrana plasmática (Fan et al., 1983). Además, en la línea 3T3L1, un modelo ampliamente empleado para estudiar la adipogénesis, el número de caveolas y los niveles de caveolina-1 aumentan 10 y 20 veces, respectivamente, durante el proceso de diferenciación adipocitaria (Fan et al., 1983; Scherer et al., 1994). 7

11 C D Figura 3 Morfología de las caveolas en fibroblastos mediante técnicas de microscopía electrónica. A. Micrografía electrónica de un corte ultrafino de un fibroblasto. Las flechas señalan las caveolas individuales. La punta de flecha señala un racimo de caveolas. B. Cara citoplasmática de la membrana de fibroblastos sometida a la técnica de freeze-drying. Se puede comprobar la cubierta estriada característica de las caveolas. C sección de la superficie de un fibroblasto donde se observa la abundancia de caveolas rodeando vacuolas en conexión con la membrana plasmática. (D) Disposición de caveolina-1 en las caveolas y topología de caveolina-1. Imágenes adaptadas de (Anderson, 1998) y esquemas adaptados de (Parton and Simons, 2007). 2.1 La familia de las caveolinas Las caveolinas son proteínas pequeñas (20-23 kda) con una secuencia altamente conservada en la evolución. Existen, hasta el momento, tres miembros de esta familia descritos y reconocidos en mamíferos: caveolina-1, caveolina-2 y caveolina-3 codificadas por genes diferentes. Caveolina-1 tiene dos isoformas ( y ) resultado de la presencia de dos inicios de transcripción en el gen. La isoforma carece de los primeros 30 aminoácidos (Scherer et al., 1995). Caveolina-2 tiene tres isoformas ( y ). Las isoformas y proceden de un mismo MRNA que posee dos inicios de traducción, aunque existen evidencias de que existen como en el caso de caveolina-1, dos mrna para caveolina-2 (Scherer et al., 1996). La isoforma es más corta y no se conoce su formación (Galbiati et al., 1998b). La expresión, estabilidad y localización en las caveolas de caveolina-2 depende de la presencia de caveolina-1 (Parton, 1996; Okamoto et al., 1998) (figura4). 8

12 Figura 4 Esquema de las distintas isoformas de caveolina. Adaptado de (Couet et al., 2001). Los genes de caveolina-1 y 2 están localizados en el cromosoma 7 humano, en una zona que frecuentemente se encuentra deleccionada en los tumores malignos. El gen de caveolina-3 se encuentra en el cromosoma 3 humano (Couet et al., 2001). Tanto caveolina-1 como caveolina-2 tienen una distribución amplia y similar en los tejidos. En cambio, caveolina-3 tiene una distribución más restringida, siendo muy abundante en células del músculo esquelético y cardíaco (Parton, 1996; Tang et al., 1996) aunque también se ha descrito su expresión en astrocitos y condrocitos (Ikezu et al., 1998; Schwab et al., 1999). En los tejidos donde se expresa, caveolina-3 es responsable de la formación de caveolas en la membrana plasmática (Parton et al., 1997; Hagiwara et al., 2000; Galbiati et al., 2001). 2.2 Estructura de las caveolinas Las caveolinas tienen alta homología entre ellas y en consecuencia comparten propiedades estructurales, funcionales y de topología de membrana. Las caveolinas son proteínas integrales de membrana de unos 20kDa, que presentan los dominios amino y carboxi terminales hidrofílicos dirigidos hacia el citosol (ver figura 5). El dominio hidrofóbico de 33 aminoácidos (residuos de caveolina-1) es el que se introduce en la membrana plasmática (dominio transmembrana hidrofóbico). Tanto caveolina-1 como caveolina-3, presentan palmitoilaciones en tres residuos de cisteína en la región carboxi Terminal (residuos en caveolina-1)(residuos de cisteína palmitoilados). Estas modificaciones lipídicas son necesarias para la unión al colesterol y el transporte de la caveolina a la membrana pero no para su localización en caveolas (Uittenbogaard and Smart, 2000). En la región N-terminal existen dos dominios que son los responsables de la mayoría de las funciones estructurales y reguladoras de la caveolina: Dominio de oligomerización (residuos de caveolina-1) se localiza muy cerca del dominio transmembrana y es esencial para las interacciones homotípicas de los monómeros de caveolina-1 (Sargiacomo et al., 1995). 9

13 Dentro del dominio de oligomerización, existe otro dominio funcional llamado dominio scaffolding de la caveolina (CSD, residuos de caveolina-1) que está implicado en la interacción de la caveolina con otras proteínas, como por ejemplo proteínas implicadas en mecanismos de transducción de señales o la propia caveolina (Couet et al., 1997b; Engelman et al., 1998a; Li et al., 1996a; Galbiati et al., 2000). Este dominio reconoce los motivos X XXXXY, XXXX XX o X XXXX XX (caveolin binding domain, CBD) entre otros, de las proteínas con las que interacciona, donde es un residuo aromático (Trp, Phe o Tyr), y la interacción es muy específica (Couet et al., 1997a). Se ha propuesto que la unión de este dominio CSD de la caveolina a proteínas de señalización, regula negativamente su acción, como en el caso de H-Ras (Song et al., 1996), c-src (quinasa de la familia Src) (Li et al., 1996a), varias subunidades G de las proteínas G heterotriméricas) (Li et al., 1995b), enos (endothelial nitric oxide synthase) (Feron et al., 1998). En otros casos, el efecto de la interacción es activador, como en la actividad quinasa de receptor de la insulina (Yamamoto et al., 1998) o el receptor 2 -adrenérgico (Czarny et al., 1999). También se ha localizado en la región amino terminal el dominio signature (residuos de caveolina-1) que está implicado en la salida de la caveolina de retículo endoplasmático hacia el complejo de Golgi (Machleidt et al., 2000). Se sabe que caveolina-1 puede ser fosforilada en el residuo tirosina 14 por las quinasas Src y por el receptor de insulina (Kimura et al., 2002), aunque parece que tiene más residuos fosforilables (Aoki et al., 1999; Nomura and Fujimoto, 1999). Las regiones entre los residuos y de caveolina-1 contienen dominios ricos en residuos cargados que podrían generar regiones antipáticas que podrían interaccionar con la cara citoplasmática de la membrana (Fielding and Fielding, 2000). Figura 5 Dominios funcionales de la caveolina. Adaptado de (Fielding et al., 2000). 10

14 Caveolina-1 se puede encontrar en forma de monómeros o de oligómeros. En la membrana plasmática se encuentra en forma de oligómeros altamente estables de monómeros de caveolina-1 con un peso molecular aproximado de kda (Sargiacomo et al., 1995; Monier et al., 1995; Li et al., 1996b). Además, análisis de pulso y caza mostraron que estos complejos se forman relativamente rápido tras la síntesis de caveolina-1 en el retículo endoplasmático y antes de completar su tránsito por el complejo de Golgi (Monier et al., 1995). También aparece en la membrana plasmática formando heterooligómeros de caveolina-2 y caveolina-1 (Sargiacomo et al., 1995; Song et al., 1997; Couet et al., 1997a). Caveolina-3 también forma homooligómeros en la membrana plasmática gracias al dominio de oligomerización. Caveolina-2 no puede formar homooligómeros de alto peso molecular y no puede migrar sola a la membrana plasmática desde el complejo de Golgi. Por tanto, caveolina-2 no puede formar caveolas por sí misma. Sin embargo, en presencia de caveolina-1, caveolina-2 puede formar complejos heterooligoméricos y entonces sí puede localizarse en la membrana plasmática (Scheiffele et al., 1998; Mora et al., 1999; Schlegel et al., 1999; Schlegel and Lisanti, 2000). La interacción de caveolina-2 con caveolina-1 es específica ya que no forma heterooligómeros con caveolina-3, y ocurre a nivel del dominio transmembrana, aunque el dominio de oligomerización también participa (Scheiffele et al., 1998). 2.3 Formación de las caveolas La caveolina se sintetiza como una proteína integral de membrana en el retículo endoplasmático (RE) de manera dependiente de SRP (signal recognition particle) (aunque también se ha descrito caveolina citosólica y secretada al espacio extracelular (Liu et al., 1999; Uittenbogaard et al., 1998).La proteína sintetizada sufre un primer paso de oligomerización, que al menos in vitro, puede ocurrir en el RE (Monier et al., 1995). La caveolina es entonces transportada al complejo de Golgi. El paso a través del complejo de Golgi es relativamente lento comparado con otras proteínas de membrana (Ren et al., 2004; Pol et al., 2005), así en la mayoría de células puede visualizarse el nuevo pool de caveolina en el complejo de Golgi, que no está asociado con membranas resistentes a detergentes (DRM) (Pol et al., 2005). Sin embargo, durante la vía biosintética en el complejo de Golgi, las caveolinas se asocian con los raft lipídicos, se hacen resistentes a detergentes y se organizan en oligómeros de gran tamaño característicos de la caveolina de membrana (figura 6). Existen diversas pruebas que apoyan que es necesaria la incorporación de la caveolina a dominios de rafts lipídicos en el complejo de Golgi (antes de llegar a la membrana) para la formación de las caveolas. Así, la salida de caveolina-1 del complejo de Golgi se acelera al añadir colesterol (Pol et al., 2005) y se inhibe al eliminar los glicoesfingolípidos (Cheng et al., 2006). Mutantes de caveolina que interrumpen su llegada a membrana provocan una acumulación de caveolina soluble en detergente en el complejo de Golgi (Machleidt et al., 2000; Ren et al., 2004). Además, en un estudio de Ren et al. (2004) se comprobó que el transporte de distintos mutantes de caveolina a la membrana correlacionaba con su capacidad para asociarse a membranas resistentes a detergentes. El modelo más aceptado de la formación de las caveolas postula que el ensamblaje y formación de las caveolas ocurre en el complejo de Golgi. Desde allí son transportadas a la membrana plasmática mediante un proceso de exocitosis (Tagawa et al., 2005; Parton et al., 2006; Parton et al., 2007). Así los autores Tagawa et al. (2005) mostraron mediante microscopía a tiempo real usando caveolina-1-gfp y cuantificando la intensidad de emisión 11

15 fluoerescente, que en el complejo de Golgi se sintetiza un determinado número de moléculas caveolina-1 que denominan quantum y que estos quantums de caveolina-1 son transportados directamente a la membrana plasmática. De tal forma que las caveolas de la membrana plasmática están formados por quantums de caveolina-1. Estos autores afirman que la salida de la caveolina del complejo de Golgi está asociada con el ensamblaje de la caveolina (oligomerización y asociación con dominios de raft lipídicos ricos en colesterol y glicoesfingolípidos) para formar una estructura semejante a una caveola de exocitosis o transportador de caveolas (exocytic caveolar carrier) que se dirige directamente a la membrana plasmática y se fusiona con ella en un proceso en el que participan la proteína SNARE Syntaxin-6. Además, Parton et al. (2007) proponen que la caveolina puede alcanzar la membrana plasmática por otras vías de transporte no caveolares en la que no participan transportadores de caveolas (figura 6). Figura 6 Biosíntesis de caveolina y tráfico a la membrana plasmática. La caveolina se sintetiza en el RE y se transporta al complejo de Golgi como oligómeros solubles en detergente. Cuando la caveolina sale del Complejo de Golgi, los oligómeros se asocian con los dominios rafts lipídicos enriquecidos en colesterol y glicoesfingolípidos, pasando a ser estructuras resistentes a detergentes (DRMs). Los portadores de caveolina (exocytic caveolar carrier r) que contienen una cantidad concreta de caveolina se escinden y se funden directamente con la membrana plasmática en un proceso que requiere a la proteína SNARE syntaxin-6. Además, la caveolina puede transportarse a la membrana por otras vesículas, pero no formarán caveolas. En el esquema se indica en rojo, un mutante de caveolina que no es capaz de salir del complejo de Golgi. Adaptado de (Parton et al., 2007) Muchas formas mutantes de caveolina que se han asociado con enfermedades se acumulan en el complejo de Golgi y no llegan a la membrana eficientemente (Galbiati et al., 1999). La expresión de estos mutantes parece que bloquea completamente la salida de la caveolina del complejo de Golgi, y son más dañinos que la carencia de caveolina (Ohsawa et 12

16 al., 2004; Nixon et al., 2005; Hernandez-Deviez et al., 2006). La explicación que proponen Parton et al. (2007) es que en ausencia de caveolina-1 no se modifica la ruta de síntesis no caveolar, sin embargo los mutantes que quedan retenidos en el complejo de Golgi, alteran ambas rutas de transporte a la membrana plasmática ya que retienen los componentes de ambas vías. 2.4 Función de las caveolas y caveolinas La función de las caveolas ha sido un gran punto de debate. Se les ha implicado en numerosos procesos celulares como el tráfico de membranas, la transducción de señales, el transporte de sustratos y la homeostasis lipídica. A partir de estudios realizados con ratones KO de caveolina-1, se ha observado que estos ratones tienen afectados el sistema cardiovascular y pulmonar, y presentan algunas alteraciones metabólicas (Razani et al., 2001a; Razani and Lisanti, 2001b; Razani et al., 2002a; Razani et al., 2002c), aunque son totalmente viables. Así, algunos autores afirman que las caveolas no son esenciales, y más que tener una función específica, podrían ser consideradas como orgánulos multifuncionales con un papel fisiológico que varía según el tipo celular y de los requerimientos celulares (van Deurs et al., 2003) Papel de las caveolas en el tráfico de membranas Endocitosis mediada por caveolas Las caveolas de la superficie celular forman unidades funcionales altamente estables generadas por la oligomerización de caveolina y su asociación con proteínas y lípidos. Estudios de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) muestran que caveolina y las caveolas son relativamente inmóviles (Tagawa et al., 2005), aunque esta movilidad aumenta considerablemente tras la oxidación o la reducción de colesterol de las membranas (Smart et al., 1994; Carozzi et al., 2000; Thomsen et al., 2002; Pelkmans et al., 2004). Sin embargo, a las caveolas se les ha asignado un papel en la endocitosis (Parton et al., 2003). Así, se ha visto que proteínas unidas a GPI cuando son tratadas con anticuerpos multivalentes (crosslinking) se translocan a caveolas y desde allí son endocitadas (Mayor et al., 1994; Fujimoto, 1996; Sabharanjak et al., 2002; Sharma et al., 2004b). Además, algunos virus sin envoltura como el SV40, usan las caveolas para entrar en las células, utilizando como receptor los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHCI)(Anderson et al., 1996; Stang et al., 1997). Vía caveola también se internalizan esfingolípidos, toxinas unidas a esfingolípidos o glucolípidos (toxina colérica o la enterotoxina tipo I (LTI)), el ácido fólico, el factor de movilidad autocrino (AMF), la albúmina, la hormona del crecimiento y el receptor de interleuquina-2 (IL2R) entre otros (Pelkmans and Helenius, 2002a; Pietiainen et al., 2004). La dinamina, una GTPasa reguladora implicada en la endocitosis, es reclutada transitoriamente en las caveolas cargadas con el virus SV40 y participan en la internalización de estas estructuras (Henley et al., 1998; Oh et al., 1998; Pelkmans et al., 2002a). Este proceso de internalización requiere el reclutamiento de citoesqueleto de actina en la región que se va a internalizar, así como de la activación de tirosina quinasas Src, y la activación de PKC (Minshall et al., 2000; Pelkmans et al., 2002a; Pelkmans et al., 2002b; Sharma et al., 2004a). Una vez internalizadas, las vesículas caveolares, que mantienen su estructura tras la endocitosis (Pietiainen et al., 2004), pueden dirigirse a unos orgánulos llamados caveosomas (Pelkmans et al., 2002a) y fusionarse a ellos de una manera Rab5 independiente o bien dirigirse a los endosomas tempranos de manera dependiente de Rab5. Los caveosomas son 13

17 unas estructuras citoplasmáticas preexistentes que tienen ph neutro a diferencia de los endosomas tempranos, tardíos y los lisosomas que tienen ph ácido, están enriquecidos en caveolina-1, y carecen de marcadores de otros orgánulos endocíticos (EEA1 o el receptor de transferrina, característicos de la endocitosis mediada por clatrinas) o biosintéticos. Desde los caveosomas las partículas endocitadas se dirigen al retículo endoplasmático (SV40) o al complejo de Golgi (toxina colérica), o bien pueden pasar a los endosomas y seguir la ruta de degradación de los lisosomas, mientras que las vesículas caveolares portadoras se reciclan y vuelven a la membrana plasmática. Estas vesículas caveolares también pueden reciclarse y fusionarse de nuevo con la membrana plasmática sin pasar por ningún orgánulo intermediario en un proceso altamente regulado (Pelkmans et al., 2005b) (figura7). Además, se han descrito otras rutas de endocitosis independientes de clatrina y de caveolina que se han asociado a rafts lipídicos y que difieren de la ruta caveolar en sus características, ya que: no existe relación entre las vesículas endocíticas y la caveolina-1, en algunos casos no participa dinaminaii en el proceso (GPI-proteínas, dextrano, CTB), dependen de las GTPasas RhoA (Receptor de la interleukina-2, IL-2R) o cdc42 (GPI-proteínas) y no existen evidencias de que dependan de la actividad de PKC. (Sabharanjak et al., 2002;vDamm et al., 2005;vKirkham et al., 2005a;vKirkham et al., 2005b;vCheng et al., 2006). Esto complica la interpretación de los estudios de endocitosis no mediada por clatrina. En ocasiones, una misma molécula, se ha descrito que se internaliza bien vía caveola, o bien vía raft lipídicos no caveolares, en función del tipo celular empleado y de su expresión de caveolina-1 (Orlandi and Fishman, 1998;vTorgersen et al., 2001;vSharma et al., 2004a;vCheng et al., 2006). Aunque, como hemos visto, hay muchos agentes que pueden causar la internalización de las caveolas, hay mecanismos comunes implicados en este proceso donde participan la dinamina (Yao et al., 2005), Src quinasas, la proteína quinasa C (PKC) y el reclutamiento de actina (Minshall et al., 2000; Pelkmans et al., 2001; Pelkmans et al., 2002b; Sharma et al., 2004a). Así, la internalización de las caveolas está facilitada por la desestructuración del citoesqueleto de actina, inhibida por inhibidores de PKC y tirosina quinasas como la estaurosporina y genisteína, y activada por inhibidores de fosfatasas como el ácido ocadaico y el vanadato (Parton et al., 1994; Pelkmans et al., 2001; Mundy et al., 2002; Thomsen et al., 2002; Pelkmans et al., 2002b). Como hemos mencionado anteriormente las caveolas son altamente inmóviles y aunque se puede inducir su endocitosis, no están implicadas en la endocitosis constitutiva de la célula (Thomsen et al., 2002). Algunos estudios proponen que la caveolina-1 podría estabilizar las caveolas en la membrana plasmática mediante su interacción con la filamina, y funcionaria así como regulador negativo de la internalización de caveolas (Le et al., 2002; Le and Nabi, 2003; Sharma et al., 2004a). 14

18 Figura 7 Modelo de tráfico intracelular. Endocitosis dependiente de vesículas de clatrina y endocitosis dependiente de caveolas. Adaptado de (Rajendran and Simons, 2005) y (Parton et al., 2007) Papel de las caveolas en la salida (budding) de los virus Cuando los virus salen de las células huésped adquieren su membrana. Hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son dos proteínas spike fundamentales de la envuelta de los virus influenza A que están asociadas a caveolas (Scheiffele et al., 1997). Además, el análisis lipídico de los virus ha mostrado un enriquecimiento en rafts lipídicos, indicando que estos virus podrían salir de las células desde los dominios rafts. Otra proteína vírica, la proteína-m, es necesaria para dirigir la salida del virus, esta proteína se une a las proteínas spike, se oligomeriza, provoca un cambio en la curvatura de la membrana y además agrupa los rafts lipídicos a través de las proteínas spike permitiendo la salida de las partículas víricas (Zhang et al., 2000). La envoltura de otros virus como el HIV está también enriquecida en raft lipídicos, y tanto la entrada como la salida de este virus depende de ellos (Aloia et al., 1988; Aloia et al., 1993). 15

19 Caveolas y adhesión celular Existen estudios que vinculan la endocitosis vía caveolas y la adhesión celular. Así, los glicoesfingolípidos que estimulan la endocitosis vía caveola (como lactosilceramida o globoside), provocan la agrupación e internalización de integrinas mediante una ruta que involucra a las caveolas; esta ruta es inhibida por la eliminación de colesterol, de caveolina-1 y por dominantes negativos de la dinamina y es dependiente de las quinasas Src y PKC (Sharma et al., 2005). La internalización de fibronectina y su degradación también se inhiben cuando se elimina caveolina-1 (KO de caveolina-1) (Sottile and Chandler, 2005). La endocitosis vía caveola también parece ser importante en condiciones en que las células pierden la adhesión al sustrato (del Pozo et al., 2005). La separación del sustrato de los fibroblastos dispara la internalización del gangliósido GM1 (característico de caveolas) de la membrana plasmática de manera dependiente de caveolina. Su internalización provoca la pérdida de Rac1 de la membrana. Durante este proceso de separación del sustrato, caveolina- 1 se fosforila en el residuo tirosina-14, condición necesaria para que ocurra la endocitosis (del Pozo et al., 2005; Parton et al., 2007). Se ha propuesto que caveolina-1 es necesaria para coordinar el estímulo de separación del sustrato, que induce un proceso de agrupamiento de los rafts lipídicos masivo, y lleva a la internalización de proteínas y componentes de los rafts. Sin embargo, la importancia de la relación entre la endocitosis a través de caveolas y la adhesión celular es aún objeto de estudio ya que los ratones KO de caveolina-1 no parecen mostrar ningún defecto en este sentido (Parton et al., 2007) Otros procesos de tráfico de membranas: transcitosis y potocitosis La endocitosis a través de caveolas ha sido ampliamente estudiada en células endoteliales. Se conoce como transcitosis el transporte de solutos a través de las células endoteliales. Se ha implicado en este proceso a las caveolas, en concreto, en el transporte transcelular de la albúmina (Simionescu et al., 2002). Para que ocurra este transporte es necesaria la interacción de caveolina-1 con el receptor de la albúmina (pg60). Fibroblastos embrionarios (MEFs) de ratones KO de caveolina-1 fracasan en la internalización de albúmina unida a un fluoróforo, y este efecto se revierte mediante la transfección del cdna de caveolina- 1 (Razani et al., 2001a). Sin embargo, estudios realizados en ratones deficientes en caveolina- 1 muestran un transporte de albúmina transendotelial normal (Drab et al., 2001). Este hecho sugiere que las caveolas no deben ser esenciales en el proceso de transcitosis in vivo (Parton et al., 2007). La potocitosis es un mecanismo de captación de pequeñas moléculas (<1kDa) o solutos independiente de un proceso endocítico. Durante este proceso, una molécula se une a un receptor localizado en una caveola, la cual entonces se ocluye y forma transitoriamente un compartimento sellado aislado del espacio extracelular pero aún contiguo a la membrana plasmática. Seguidamente la caveola se abre, y el ciclo se repite. La potocitosis vía caveola se ha descrito en la captación de vitaminas, concretamente en el caso del ácido fólico (Anderson et al., 1992), y ésteres de colesterol a partir de lipoproteínas de alta densidad (HDL) (Babitt et al., 1997). 16

20 2.4.2 Papel de las caveolas/caveolinas en la transducción de señales La función más estudiada de las caveolas es su implicación en la transducción de señales. Las caveolas, como subtipo de raft lipídico, se han descrito como centros organizadores de membrana, juegan un papel importante a la hora de concentrar moléculas de señalización y por tanto, de iniciar respuestas celulares frente a diferentes estímulos, ya que generan un ambiente determinado en la membrana plasmática que, en ocasiones, es crítico para las moléculas de señalización y los receptores de membrana. Como ya hemos mencionado anteriormente, existen numerosos trabajos que aportan evidencias de que caveolina-1 puede interaccionar, mediante su dominio conservado SCD (scaffolding) (revisión Liu et al., 2002), directamente con muchas moléculas de transducción de señales descritas en caveolas, como las quinasas de la familia Src, las proteínas G heterotriméricas o la proteína H-Ras (Li et al., 1996a; Couet et al., 1997b). Sin embargo, muchas de estas interacciones se han demostrado mediante una sola técnica (en la mayoría de los casos por inmunoprecipitación o mediante la técnica del doble híbrido en levaduras) o usando sólo el dominio SCD de la caveolina para comprobar dicha interacción. Al carecer de otros estudios funcionales, se han de tomar con precaución las listas de proteínas que podrían interaccionar con caveolina-1 (Liu et al., 2002). Se ha descrito que la interacción de caveolina-1 con moléculas de transducción de señales puede causar una inhibición de la ruta de señalización o una activación según la proteína y el tipo celular. Un ejemplo bien caracterizado de caveolina como inhibidor de la transducción de señales es la interacción de caveolina-1 con enos (endothelial nitric oxide synthase) (Feron et al., 1998). enos controla importantes procesos como la angiogénesis, la vasodilatación y la permeabilidad. Existen estudios que demuestran que el péptido sintético derivado del dominio SCD de caveolina-1 inhibe la actividad de enos después de introducirlo en células vivas (Bucci et al., 2000). El resultado de esta interacción es la regulación negativa en la producción de óxido nítrico, que actúa inhibiendo la adenilato ciclasa productora de AMPc. En los ratones KO de caveolina-1, existe una activación constitutiva del enzima enos y aumentando los niveles de óxido nítrico. Estos ratones presentan problemas para inducir la vasoconstricción en respuesta a un estímulo adrenérgico así como una relajación vascular potenciada ante estimulación por acetilcolina (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001a). En cambio, la interacción de caveolina-1 con el receptor de insulina provoca su activación. La primera evidencia de esta interacción positiva surgió de la sobreexpresión de caveolina-3 en células Hek293, que presentaban entonces una estimulación de la actividad del receptor de insulina, y un aumento de la fosforilación de uno de sus sustratos en la cascada de señalización, IRS-1(Yamamoto et al., 1998). Estos autores comprobaron que era el dominio SCD de caveolina-1 o caveolina-3 (no el de caveolina-2) el que provocaba esta estimulación de la actividad tirosina quinasa del receptor de insulina. También demostraron la unión del receptor de insulina purificado a péptidos del dominio SCD de caveolina-1 y 3 inmovilizados. Una interacción similar fue descrita por Nystrom et al. (1999) mediante inmunoprecipitación, cuando sobreexpresaban el receptor de insulina en células COS. Se han descrito muchas moléculas de transducción de señales que se localizan en las caveolas, bien mediante una interacción directa con la caveolina, o bien porque contienen modificaciones que permiten su localización en estos dominios. Entre estas moléculas aparecen, las proteínas G heterotriméricas, PKC, los receptores de EGF y de PDGF, quinasas IP 3, FAT/CD36, receptor de insulina, receptores asociados a proteínas G o enos (Liu et al., 2002). Sin embargo, la localización de ciertas proteínas en las caveolas ha sido motivo de controversia, ya que según el método usado para el aislamiento (eliminación de colesterol y 17

21 observación de efectos funcionales, fraccionamiento usando métodos con detergentes o con carbonato a ph11 y separación en gradientes de sacarosa, inmunofluorescencia, inmunolocalización) pueden localizarse o no en caveolas. La tendencia hoy en día es a tomar los resultados de localización de las proteínas en caveolas con escepticismo, hasta que no se confirmen los resultados por varias técnicas y se complementen con inmunolocalización y microscopía electrónica o con inmunoaislamiento de caveolas usando un anticuerpo anticaveolina Papel de las caveolas/caveolina en la homeostasis y el transporte de colesterol Como ya hemos descrito, las caveolas tienen una composición diferente al resto de la membrana, estando especialmente enriquecidas en colesterol. Además, su estructura y función es muy sensible a los niveles de colesterol (Rothberg et al., 1990; Rothberg et al., 1992). Caveolina-1 interacciona directamente con el colesterol libre (free cholesterol, FC), en una estequiometría 1:1 o 1:2, y esta interacción resiste el tratamiento con el detergente SDS (Murata et al., 1995; Thiele et al., 2000). Se ha sugerido que aunque la palmitoilación de caveolina-1 no es necesaria para su localización en caveolas, sí lo es, en la posición 143 y 156, para que una colesterol (Dietzen et al., 1995; Uittenbogaard et al., 2000). Además se ha visto que la expresión de caveolina-1 está regulada a nivel transcripcional por el FC en el retículo endoplasmático a través de elementos de respuesta a colesterol en los promotores (SRPE, sterol-responsive promoter elements) (Fielding and Fielding, 1997b; Hailstones et al., 1998; Ikonen and Parton, 2000), de tal forma que, una disminución en los niveles de FC provocan una disminución de la transcripción de caveolina-1 (Hailstones et al., 1998), mientras que un incremento de FC (incubando las células con lipoproteínas de baja densidad) lleva al aumento de los niveles de mrna de caveolina-1 (Fielding et al., 1997a). Los niveles de la proteína caveolina-1 (Fielding et al., 1999) y el tráfico de caveolina-1 a través del complejo de Golgi también responden a cambios en los niveles de FC (Smart et al., 1994; Conrad et al., 1995; Pol et al., 2005). El colesterol es necesario para la correcta síntesis y salida de la caveolina-1 del complejo de Golgi y su llegada a membrana en forma de caveolas. Las caveolas y las caveolinas se han involucrado en el tráfico de colesterol intracelular. Por un lado se les implicó en la llegada a membrana del colesterol y/o su posterior salida de la célula. Así, la transfección de caveolina-1 en fibroblastos humanos lleva a la acumulación del colesterol en caveolas (Smart et al., 1996), y al aumento de los niveles de FC (Fielding and Fielding, 2001) y de la salida de colesterol al exterior celular en fibroblastos (Fielding et al., 1999) y en hepatocitos (Fu et al., 2004), este transporte requiere la formación de un complejo chaperona-cholesterol, donde la caveolina-1 citosólica es un miembro importante (Uittenbogaard et al., 1998; Uittenbogaard et al., 2000). De la misma manera, cuando se incuban los fibroblastos con las lipoproteínas de baja densidad (LDL) donantes de colesterol, el exceso de colesterol se localiza mayoritariamente en las caveolas (Fielding and Fielding, 1995; Fielding et al., 1997b). En el mismo sentido, se ha localizado en caveolas uno de los componentes mas importantes para la transferencia del colesterol mediada por HDL (lipoproteína de alta densidad), el receptor SR-BI (the class B, type I scavenger receptor) (Babitt et al., 1997; raf et al., 1999). En sentido contrario, el colesterol libre y los ésteres de colesterol que constituyen las HDL pueden ser también internalizados después de la interacción de la proteína apoa-1 de las HDL con el receptor SR-BI, localizado en caveolas. Se ha descrito que los ésteres de colesterol internalizados a través de las caveolas se asocian con la caveolina-1 citosólica (Uittenbogaard et al., 2000), que forman parte de unas partículas 18