Enquistamiento in vitro de entamoeba histolytica en cultivos axénicos

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1 Enquistamiento in vitro de entamoeba histolytica en cultivos axénicos María Porfiria Barrón González Licet Villarreal Treviño Jorge Armando Verduzco Martínez Mario Rodolfo Morales Vallarta Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Nuevo León Benito David Mata Cárdenas Centro de Investigación Biomédica del Noreste del Instituto Mexicano del Seguro Social E mail:mv_mario2000@yahoo.com.mx Introducción La amibiasis es una enfermedad parasitaria infecciosa del tracto gastrointestinal, ocasionada por el protozoario parásito Entamoeba histolytica, el comité de expertos en amibiasis de la Organización Mundial de la Salud definió a la amibiasis como la condición de albergar el parásito E. histolytica con o sin manifestaciones clínicas 1. La amibiasis representa un problema de salud mundial y afecta principalmente a los países en vías de desarrollo, con mayor frecuencia en las regiones tropicales, con climas cálidos y templados, en donde de forma habitual predomina la desnutrición, el hacinamiento y en general un manejo inadecuado de las aguas residuales y de las excretas, haciendo frecuente tanto la infección como la enfermedad, existiendo por lo tanto una fuerte correlación entre estas condiciones y el estrato socioeconómico de la población. La amibiasis afecta aproximadamente del 10 al 20% de la población mundial, siendo catalogada como la tercer causa de muerte por parásitos en el mundo 2 ; lo cual constituye un problema frecuente y prioritario de salud por el impacto socioeconómico que ésta tiene. En México constituye un problema muy importante de salud pública por su frecuencia y mortalidad 3. Entamoeba histolytica presenta en su ciclo de vida dos estadios: el trofozoíto y el quiste, el trofozoíto representa el estadio invasivo, en tanto que el quiste representa la fase de resistencia e infestación. La amibiasis se transmite a través del quiste por la vía ano-mano-boca o vía fecal-oral 4. Para el tratamiento de la amibiasis la droga de elección es el metronidazol; sin embargo esta droga presenta una serie de efectos secundarios indeseables en el humano, además de 1

2 reportes que indican resistencia de Entamoeba histolytica a esta droga 5. Actualmente la mayor parte de las investigaciones concernientes a E. histolytica se realizan sobre el estadio de trofozoíto, dada la incapacidad de llevar a efecto estudios relacionados con el quiste y el proceso de enquistamiento de E. histolytica, el principal obstáculo para llevar a cabo estudios relacionados con el quiste y el enquistamiento se debe a la falta de un medio o método que permita la producción de quistes de E. histolytica bajo condiciones axénicas in vitro. Ante la dificultad de obtener quistes de E. histolytica en cultivos axénicos, la mayoría de los investigadores han empleado a E. invadens para el estudio del proceso de enquistamiento. Sin embargo dentro de la familia Amoebidae, E. invadens y E. histolytica son grupos filogenéticamente distintos, como lo demuestran estudios basados en secuencias de genes del RNA 6 ; por lo tanto los datos obtenidos al respecto no son totalmente extrapolables a E. histolytica. Por otra parte, se ha reportado un método de enquistamiento in vitro para Entamoeba invadens 7, este método cuando se aplica a E. histolytica produce formas semejantes a quistes, pero presenta paredes imperfectas, sin embargo su estructura interna presenta características semejantes a quistes. En este método de enquistamiento se involucran factores tales como: alta tensión de CO 2, suero de bovino y ayuno de glucosa, pero hay otras sustancias que son sugestivas de inducir el enquistamiento en combinación con variantes, ya sea de la concentración de CO 2, suero y concentración de iones activadores de la quitin sintetasa. Palabras claves: Enquistamiento, amibiasis, Entamoeba histolytica. Objetivo El objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda de un medio o método de enquistamiento axénico in vitro que permita obtener altos rendimientos de quistes o formas semejantes a quistes de Entamoeba histolytica. 2

3 Metodología Material biológico. Se utilizó la cepa HM1-IMSS de Entamoeba histolytica, así como suero bovino. Mantenimiento de Entamoeba histolytica. Trofozoítos de E. histolytica cepa HM1-IMSS se mantuvieron en tubos de borosilicato de 16x125 mm con tapón de rosca, estos tubos contenían 10 ml del medio de cultivo TYI-S-33 (en este bioensayo el TYI-S-33 8 fue modificado, al cual le fue sustituido el extracto de levadura por el extracto de hígado-páncreas (EHP) (25 ml por 100 ml de medio), y adicionado con 0.1 ml de la mezcla de antibióticos (penicilina 4,000 UI + estreptomicina 4mg) y 1.0 ml de suero bovino, posteriormente se inocularon con 2x10 4 cel/ml e incubados a 37 C por 3 días. Cinética de crecimiento de E. histolytica en el medio TYI-S-33 modificado. Se enfrió el tubo fuente de inóculo a 0-4 C durante 20 min. para despegar las células adheridas al tubo y posteriormente se determinó el número de células por mililitro (cel/ml). Se dispuso de una serie de 12 tubos de 16 x 125mm con 10 ml de medio TYI-S-33 modificado, adicionado con 0.1 ml de la mezcla de antibióticos y 1.0 ml de suero bovino, se inoculó cada tubo con 2x10 4 cel/ml, se incubaron a 37 C y cada 24 h se dispuso de tres tubos los cuales fueron enfriados de 0-4 C por 20 min, se realizaron cuentas por triplicado cada 24 h para determinar el incremento de células y el tiempo en el que se alcanzó el máximo rendimiento. Inducción de quistes de Entamoeba histolytica. Para la inducción de formas semejantes a quistes de E. histolytica tomamos como base el método de alta tensión de CO 29. En la primera fase del método de alta tensión de CO 2 (fase de crecimiento) se inocularon 2x10 4 cel/ml en 8 tubos de 18x150 mm conteniendo 10 ml del medio TYI-S-33 modificado, adicionado con 1.0 ml de suero bovino y 0.1 ml de la mezcla de antibiótico (400 IU de penicilina y 4 mg de estreptomicina), se gasearon con CO 2 (99.9 de pureza) por 2 min. con un flujo de 0.2 Lb/min empleando una pipeta Pasteur con filtro de algodón, los tubos fueron cerrados herméticamente y 3

4 se incubaron a 37 C por 3 días. Transcurrido este tiempo los tubos fueron enfriados en agua-hielo a 0-4 C por 20 min, las células fueron contadas empleando una cámara de Neubauer. Posteriormente los tubos fueron centrifugados a 900 rmp por 5 min y el paquete celular fue lavado tres veces empleando buffer salino de fosfatos. En la segunda fase del método (fase de enquistamiento) se dispuso de tres matraces de 250 ml marca pirex; cada matraz conteniendo 30 ml del medio TYI-S-33 modificado y libre de glucosa a ph=9, suplementado con 1.8 ml de histamina (0.6 mm), 15 ml del sobrenadante estéril (121 C/15min) de las enterobacterias Escherichia coli y Enterococcus faecalis, 3.0 ml de suero bovino, 0.3 ml de la mezcla de antibiótico. Cada matraz fue inoculado con el paquete celular obtenido en la primera fase de este método (aproximadamente 19.7 x 10 6 cel/ml) enseguida cada matraz fue gaseado con CO 2 (99.9 de pureza) por 6 min con un flujo de 0.2 Lb/min empleando una pipeta Pasteur con filtro de algodón, cada matraz fue cerrado herméticamente y se incubaron a 37 C por 4 días. Rendimiento de formas semejantes a quistes (%). Cada matraz fue enfriado de 0-4 C por 20 min, las células fueron contadas empleando una cámara de Neubauer; posteriormente el paquete celular fue obtenido por centrifugación a 900 rpm por 10 min, el sobrenadante fue eliminado y las células fueron tratadas con sarkosil 0.15% por 10 min y posteriormente fueron lavadas con agua desionizada. Las formas semejantes a quistes de E. histolytica fueron contadas y la eficiencia fue calculada de acuerdo a la siguiente fórmula: (formas semejantes a quistes x 100/ formas semejantes a quistes + trofozoítos). Microscopía. Una vez que se determinó el rendimiento de formas semejantes a quistes resistentes al detergente sarkosil 0.15%, las células se fijaron con glutaraldehído al 2.5% con 0.2% en buffer de fosfatos a ph=7.2, los especimenes fueron postfijados en tetróxido de osmio al 1% en 0.2M en buffer de fosfatos a ph=7.2; los especimenes fueron deshidratados en alcohol etílico, y posteriormente embebidas en resina epoxy (Medcast). Se realizaron cortes finos los cuales fueron teñidos con acetato de uranilo, citrato de plomo y observados con un microscopio electrónico Zeiss EM-109. Para observación a microscopía de fluorescencia las 4

5 formas semejantes a quistes de E. histolytica fueron teñidas con calcoflúor M2R al 0.1% e inmediatamente observadas en un microscopio de fluorescencia marca Zeiss. Otra muestra fue teñida con la técnica tricrómica de Gomori y observada a microscopía de luz. Resultados Cinética de crecimiento de E. histolytica. En la cinética de crecimiento de E. histolytica, empleando el medio de cultivo TYI-S-33 modificado (Fig.1), se observa que durante las primeras 24 h presenta una ligera fase de adaptación, posteriormente se observa la fase logarítmica, alcanzando su rendimiento máximo a las 72 h, con un rendimiento de aproximadamente 138,000 cél/ml y posteriormente se observa un decaimiento paulatino en el número de células. Obtención de estructuras semejantes a quistes de E. histolytica en el medio TYI-S-33 modificado. Empleando la metodología aquí reportada obtuvimos un rendimiento de 91.4% de estructuras semejantes a quistes de E. histolytica resistentes al detergente sarkosil 0.15% por 10min. Las estructuras quísticas de E. histolytica fueron observadas a través de microscopio de campo claro, de contraste de fase, microscopía electrónica de transmisión y microscopía de fluorescencia. En la figura 2a se muestra un agregado de estructuras quísticas resistentes al sarkosil 0.15% observadas a través de microscopía de contraste de fase, en donde se observan las células redondeadas en forma de agregados. Cuando las estructuras quísticas se tiñeron con la técnica tricrómica de Gomori se observó que estas células presentan varios núcleos (n) y con la cromatina condensada en la periferia de la membrana nuclear interna (figura 2b). Los cortes finos observados a través de microscopía electrónica de transmisión, mostraron la presencia de hélices de ribonucleoproteínas, los cuales son precursores de los cuerpos cromatoides característicos de quistes maduros de E. histolytica. En la figura 2c también se observa una cubierta que indica la presencia de una delgada pared celular. Para demostrar la presencia de una pared celular, las células se trataron con calcoflúor M2R que es un colorante fluorescente que tiene afinidad por polímeros de N-acetilglucosamina, la figura 2d muestra que el colorante calcofluor M2R produce 5

6 una fuerte fluorescencia. Este, y las evidencias arriba mencionadas muestran las características típicas de los quistes maduros de Entamoeba histolytica 10. Células/mL Tiempo a c d b n Fig. 1. Cinética de crecimiento axénico in vitro de E. histolytica. Estos resultados representan el promedio del rendimiento obtenido a partir de tres eventos independientes por triplicado, graficados como medias + DS. Fig 2. Diferentes aspectos de los quistes de E. histolytica. a)agregado de quistes resistentes al sarkosil 0.15% (400X), b) Tinción tricrómica de un quiste en el cual se observan tres núcleos(n), 1000X; c) Micrografía al microcopio electrónico del corte fino de un quiste en el cual se observan hélices de ribonucleoproteínas (círculo) y la presencia de una delgada pared celular (flecha) (12,000 X) y d) Quiste resistente al sarkosil 0.15%, tratado con calcofluor M2R y observado con microscopía de fluorescencia (600 X). Discusión En la metodología aquí reportada, realizamos una modificación al medio TYI-S al cual le sustituimos el Extracto de Levaduras por el Extracto de Hígado-Páncreas (EHP), en el TYI-S-33 modificado obtuvimos mayor rendimiento celular por mililitro, este resultado se puede asumir como consecuencia del mayor aporte de nutrientes por parte del EHP, debido a que el rendimiento que proporciona esta modificación en el medio permite obtener más del doble de rendimiento celular al que se obtiene en el medio TYI-S-33 tradicional. Por otra parte, en este trabajo se demuestra que para inducir la formación de estructuras quísticas, el CO 2 es un factor importante; el gaseo del medio TYI-S-33 con CO 2 produce una acidificación de aproximadamente una unidad de ph, por lo cual el medio empleado para inducir las formas quísticas se 6

7 preparó originalmente a ph 9.0 para que finalmente presentara aproximadamente un ph de 7.0. Los medios condicionados con las enterobacterias Escherichia coli y Enterococcus faecalis fueron empleadas por la posibilidad de la liberación por parte de estos microorganismos de factores inductores del enquistamiento de E. histolytica 12. De igual forma la presencia de la histamina 0.6 mm proporciona al medio las características de oxidorreducción necesarias para inducir el enquistamiento 13. Hasta ahora una serie de investigadores han sugerido que las cepas de E. histolytica han perdido su capacidad de enquistar al permanecer por largo tiempo en cultivos in vitro 14 y 15, esta idea nació por el hecho de que no había podido encontrarse un medio o método que indujera al menos, algunas características del quiste maduro de E. histolytica. Sin embargo, los resultados aquí encontrados muestran la posibilidad de la inducción in vitro de estructuras quísticas de E. histolytica las cuales presentaron las siguientes características: son resistentes al detergente sarkosil 0.15% por 10min, fluorescen en presencia del colorante calcoflúor M2R, son multinucleadas y presentan en su interior hélices de ribonucleoproteínas, así como una delgada pared celular, siendo todas éstas características típicas de quistes maduros de E. histolytica. Los presentes resultados representan un avance en la investigación de la amibiasis los cuales en un futuro permitirán descifrar los procesos implícitos en la dispersión, infestación e invasión de E. histolytica a nivel del ambiente y del hospedero respectivamente. El hecho de que pueda ser inducida la formación de estructuras semejantes a quistes de E. histolytica modificando y combinando algunos factores del medio en un cultivo axénico, indica que es posible encontrar condiciones de cultivo para inducir el enquistamiento de E. histolytica bajo condiciones axénicas in vitro. Conclusión El método aquí descrito permite la inducción de estructuras semejantes a quistes de Entamoeba histolytica las cuales presentan algunas características de quistes maduros de E. histolytica. 7

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