BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR

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1 CAPÍTULO BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR RESUMEN La bronquitis infecciosa aviar (BIA) está causada por el virus coronavirus de la bronquitis infecciosa (IBV). El virus causa la infección principalmente en los pollos y es un patógeno importante de las aves de abasto y de las ponedoras. La BIA es una enfermedad aguda y contagiosa que se caracteriza fundamentalmente por síntomas respiratorios en pollos de cebo. En las gallinas se observa a menudo una disminución de la puesta y de su calidad. Algunas cepas del virus son nefropatógenas y producen nefritis intersticial y mortalidad. La gravedad de la enfermedad respiratoria inducida por el IBV se ve incrementada por la presencia de patógenos bacterianos, desembocando en aerosaculitis crónica y complicada. El diagnóstico de la BIA requiere el aislamiento del virus o la demostración del ácido nucleico vírico de las bandadas enfermas. Puede ser útil la demostración de un aumento de la respuesta de los anticuerpos séricos. El uso extendido de vacunas vivas e inactivadas puede complicar tanto la interpretación del aislamiento del virus como los hallazgos serológicos. La presencia de cepas antigénicas variables puede anular la inmunidad inducida por la vacunación. El diagnóstico requiere pruebas de laboratorio. Se prefiere el aislamiento y la identificación del virus. Generalmente se utilizan las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR para identificar el genotipo del IBV. Para el diagnóstico serológico, generalmente se utilizan las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación (IH) para determinar el serotipo y los inmunoensayos (ELISA) para un análisis general. Las pruebas complementarias incluyen la microscopía electrónica, el uso de anticuerpos monoclonales, la neutralización vírica (NV), las pruebas histoquímicas o de fluorescencia y los ensayos de desafío para la inmunización en pollos. Identificación del agente: Para la forma respiratoria más común, el aislamiento más eficaz del IBV es el que se hace a partir de la mucosa traqueal y de los pulmones entre varios días y una semana después de la infección. Para otras formas de la BI, las mejores fuentes de virus son el riñón, el oviducto, las amígdalas cecales del tracto intestinal, o los tejidos del proventrículo, dependiendo de la patogénesis de la enfermedad. Para el aislamiento del virus, pueden utilizarse embriones de pollo libres de patógenos específicos o cultivos de órganos traqueales (COT) de embriones. Después de la inoculación de la cavidad alantoidea, el IBV produce embriones enanos o deformados, distrofia del plumón, o depósitos de ureato en el mesonefros del riñón, generalmente dentro de los tres pases seriados. El aislamiento en COT tiene la ventaja de que el IBV produce en la inoculación inicial una paresia de los cilios traqueales. La RT-PCR se está utilizando cada vez más para identificar el genotipo de la glicoproteína de la espícula (S) de las cepas de campo del IBV. La genotipificación en la que se utilizan cebadores específicos para la subunidad S1 del gen S o la secuencia del mismo gen, generalmente proporciona hallazgos similares, pero no siempre idénticos, mediante la IH o la serotipificación por NV. Alternativamente, se pueden utilizar pruebas de NV o de IH en las que se usan antisueros específicos para identificar el serotipo. Pruebas serológicas: Pueden utilizarse kits comerciales ELISA para controlar la respuesta de los anticuerpos séricos. Los antígenos utilizados en los kits son en general de reacción cruzada entre los serotipos y permiten el control serológico general de las respuestas vacunales y de los desafíos de campo. La prueba de la IH se utiliza para identificar las respuestas de los serotipos específicos a la vacunación y a los desafíos de campo, especialmente en pollos jóvenes de engorde. Debido a las múltiples infecciones y a las vacunaciones, los sueros de las reproductoras y de las ponedoras Manual de la OIE sobre animales terrestres

2 contienen anticuerpos de reacción cruzada y los resultados de la prueba de la IH no pueden utilizarse con un alto grado de confianza. Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Se dispone de vacunas vivas atenuadas y de vacunas inactivadas en emulsiones con aceite. Las vacunas vivas atenuadas por pasos seriados en embriones de pollo o por tratamiento térmico confieren mejor inmunidad local del tracto respiratorio que las vacunas inactivadas. El uso de vacunas vivas conlleva un riesgo de patogenicidad residual asociada con el pase de la vacuna en aves. Sin embargo, por lo general, una aplicación masiva adecuada da por resultado una aplicación segura de las vacunas vivas. Las vacunas inactivadas se inyectan en una única dosis, y a menos que se hayan administrado previamente una o más vacunas vivas primarias del IBV, no confieren protección. Ambos tipos de vacunas están disponibles conjuntamente con la vacuna contra la enfermedad de Newcastle; en algunos países se dispone de vacunas inactivadas multivalentes que incluyen los antígenos de la enfermedad de Newcastle, de la bursitis infecciosa, del reovirus y del síndrome 76, que provoca un descenso en la producción de huevos. A. INTRODUCCIÓN La bronquitis infecciosa aviar (BIA) se describió inicialmente en los años treinta en los EE.UU. como una enfermedad respiratoria aguda presente sobre todo en pollos jóvenes. Se estableció su etiología vírica y al agente se le denominó virus de la bronquitis infecciosa aviar. El virus (IBV) es un miembro del género Coronavirus, de la familia Coronaviridae, del orden Nidovirales. El IBV y otros coronavirus aviares de los patos y los faisanes se clasifican como coronavirus del grupo 3, con coronavirus de mamíferos incluidos en los grupos 1, 2 y 4 (perteneciendo al grupo 4 el coronavirus del síndrome respiratorio agudo y severo (SARS), de identificación más reciente (6). Los coronavirus tienen un genoma de ARN de cadena única, no segmentado, y con polaridad de mensajero. La BI afecta a pollos de todas las edades, los cuales, con la excepción de los faisanes (10) y las gallinas de guinea, son la única especie descrita como receptora de infecciones naturales. Esta enfermedad se transmite vía aerógena, por contacto directo entre los pollos e indirectamente por la propagación mecánica (mediante los utensilios para las aves de corral contaminados o el material de embalaje de huevos, abono utilizado como fertilizante, visitas a las granjas, etc.) La BIA se encuentra extendida por todo el mundo y presenta varias formas clínicas, siendo la forma principal una enfermedad que se desarrolla después de la infección de los tejidos del tracto respiratorio, seguido de la inhalación o la ingestión. La infección del oviducto puede originar lesiones permanentes en las aves inmaduras y en las gallinas, y puede dar lugar al cese de la puesta de huevos o la producción de huevos con cáscaras de paredes finas y pérdida de pigmentación. La BI puede ser nefropatógena, causando entonces nefritis aguda, urolitiasis y mortalidad (11). Después de una recuperación aparente, la nefritis crónica puede producir la muerte en una fase posterior. Se ha informado de que el IBV produce la enfermedad en el proventrículo (49). Las cepas vacunales y de campo del IBV pueden persistir en las amígdalas cecales del tracto intestinal y excretarse en las heces durante semanas o durante un período más largo en pollos clínicamente normales (2). Para una revisión en profundidad de la BI, véase Cavanagh & Naqi (11). También está disponible una discusión detallada sobre los ensayos para la detección del antígeno del IBV, del genoma y de anticuerpos preparados por De Wit (24). No ha habido descripciones de infección humana por el IBV. B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO La confirmación del diagnóstico se basa en la demostración del virus, algunas veces en el aislamiento apoyado en ocasiones por datos serológicos. Se hace un uso muy amplio de vacunas vivas y de vacunas inactivadas, lo cual puede complicar el diagnóstico por métodos serológicos, porque los anticuerpos debidos a la vacunación y a la infección natural no siempre pueden distinguirse. La persistencia del virus de vacunas vivas también puede equivocar los ensayos de recogida de la cepa de campo del agente causal. 1. Identificación del agente a) Muestreo Se deben obtener muestras apropiadas para la forma de BI observada tan pronto como sean evidentes los síntomas de la enfermedad clínica. Las muestras deben colocarse en medio de transporte frío y deben 2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

3 congelarse lo antes posible. Debe mantenerse la cadena de frío desde las aves hasta el laboratorio. Para enfermedades respiratorias agudas, los frotis del tracto respiratorio superior en el caso de aves vivas, o los tejidos traqueales o pulmonares en el caso de aves muertas, se deben recoger y colocar en medio de transporte que contenga penicilina ( Unidades Internacionales [UI]/ml) y estreptomicina (10 mg/ml), guardarlos en hielo y luego congelarlos. Para aves con nefritis o problemas en la producción de huevos, deben recogerse las muestras de los riñones o del oviducto respectivamente, además de las muestras respiratorias. En algunos casos puede ser deseable la identificación del IBV por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) sin el aislamiento del virus. En este caso, los frotis del tracto respiratorio o de la cloaca, pueden entregarse solos sin colocarlos en medio de transporte líquido (8). En situaciones en las que se sospeche una nefritis causada por la BI, las muestras de riñón también deben seleccionarse de las canales para el examen histopatológico, así como para el aislamiento del virus. También deben someterse a examen serológico las muestras de sangre de las aves gravemente afectadas así como de pollos convalecientes. Se ha descrito una tasa alta de aislamiento del virus del ganglio cecal y de las heces (2). Sin embargo, los aislamientos del tracto intestinal pueden no tener relevancia en la infección final o en la enfermedad clínica. Puede facilitarse el aislamiento de IBV utilizando pollos libres de patógenos específicos testigo (SPF), puestos en contacto una o más veces con aves de corral comerciales (25). b) Cultivo Las suspensiones de tejidos (10 20% p/v) se preparan en solución salina tamponada con fosfato (PBS), o en caldo nutritivo para inoculación de huevos, o en medio de cultivo para inoculación de cultivos de órganos traqueales (TOC) (17). Las suspensiones se clarifican mediante centrifugación a baja velocidad, y filtración en filtros bacteriológicos (0,2 µ), antes de inocular en huevos o en los TOC. Los huevos embrionados de pollo y los TOC se utilizan para el aislamiento primario del IBV. No se recomiendan los cultivos celulares para el aislamiento primario dado que a menudo es necesario adaptar los aislamientos del IBV al crecimiento en embriones de pollo antes de que se produzca el efecto citopático (ECP) en las células de riñón de los embriones de pollo. Los huevos embrionados que se utilizan en el aislamiento del virus deben proceder de pollos SPF o de reproductoras que no hayan sido infectados ni vacunados con el IBV. Por lo general, la muestra de sobrenadante de 0,1-0,2 ml se inocula en la cavidad alantoidea de los embriones de 9 11días. Los huevos se miran al trasluz diariamente durante 7 días y la mortalidad dentro de las primeras 24 horas se considera inespecífica. Generalmente, la inoculación inicial tiene efectos macroscópicos limitados en los embriones, a menos que la cepa derive de una vacuna que ya esté adaptada al huevo. Normalmente, los líquidos alantoideos de todos los huevos se juntan 3 días después de la infección; este depósito se diluye 1/5 o 1/10 con caldo con antibióticos y se pasa a otro grupo de huevos, hasta un total de 3 o 4 pases. Normalmente, una cepa de campo inducirá cambios observables en el embrión, que consisten en la aparición de embriones enanos o deformados, con distrofia en las plumas y depósitos de ureato en el mesonefros embrionario en los pases segundo al cuarto. Puede ocurrir la muerte de embriones en pases posteriores cuando la cepa empieza a estar más adaptada al huevo. Otros virus, sobre todo los adenovirus, que son comunes en el tracto respiratorio, pueden producir también lesiones embrionarias indistinguibles de las del IBV. El líquido alantoideo repleto de IBV no debería aglutinar eritrocitos, y el aislamiento de IBV debe confirmarse por serotipificación o genotipificación. Los líquidos alantoideos infecciosos se guardan a 20 C o a una temperatura inferior para un período corto de almacenamiento y a -60 C para un almacenamiento a largo plazo, o a 4 C después de su liofilización. Para aislar el IBV directamente del material de campo (17) se pueden utilizar los TOC a partir de embriones de 20 días. Es aconsejable un cortador automático de tejidos para la producción a gran escala de secciones de corte o de anillos de la tráquea por esta técnica (21). Los anillos son de un grosor comprendido entre 0,5 y 1,0 mm y se mantienen en medio de Eagle con ácido N-2-hidroxietilpiperazina N -2-etanosulfónico (HEPES) en frascos rotatorios (15 rev/hora) a 37 C. La infección de cultivos traqueales produce paresia de los cilios en horas. La cilioparesia puede producirse por otros virus, y los casos sopechosos de IBV se deben confirmar mediante la serotipificación o la genotipificación. c) Métodos de identificación Las pruebas iniciales realizadas sobre los aislamientos del IBV están dirigidas a descartar otros virus de consideración diagnóstica. Se recogen las membranas corioalantoideas de los huevos infectados, se homogeneizan y se prueban para el grupo 1 de adenovirus aviar por inmunodifusión o por la PCR. Son comunes las infecciones por adenovirus aviar del Grupo 1 de los pollos comerciales, y el virus generalmente produce embriones enanos que no se pueden distinguir de los embriones infectados por el IBV. Es más, el líquido alantoideo recogido no hemoaglutina (HA) los eritrocitos de los polluelos. Para la identificación de un aislamiento de IBV como tal, normalmente se utilizan pruebas basadas en la genética (RT-PCR o RT-PCR-RFLP [polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción]. Pueden utilizarse otras técnicas, por ejemplo, se pueden probar para antígeno del IBV las células presentes en el líquido Manual de la OIE sobre animales terrestres

4 alantoideo de huevos infectados mediante pruebas de la inmunofluorescencia directa (12), y la microscopía electrónica directa con tinción negativa para revelar la presencia de partículas con la morfología típica de los coronavirus en concentrados del líquido alantoideo o de los TOC. La presencia del IBV en el líquido alantoideo infeccioso se puede detectar por amplificación con RT-PCR y mediante una prueba de hibridación puntual utilizando una sonda de ADN (32). Se ha descrito la tinción directa por inmunofluorescencia de los TOC infectados para la detección rápida de la presencia del IBV (3). En las membranas corioalantoideas infectadas se puede utilizar la inmunohistoquímica, con un anticuerpo monoclonal específico (MAb) de grupo, para identificar el IBV (43). d) Identificación del serotipo Es común la variación antigénica entre las cepas de IBV (11, 16, 23, 28, 31), pero en la actualidad no hay acuerdo sobre un sistema de clasificación definitivo. Sin embargo, las relaciones y diferencias antigénicas entre las cepas son importantes, pues las vacunas basadas en un serotipo particular pueden mostrar una escasa o nula protección frente a los virus de un grupo antigénico distinto. Como consecuencia de la aparición regular de las variantes antigénicas, los virus, y por lo tanto, la enfermedad y las vacunas, pueden ser muy diferentes en sitios geográficos distintos. Es necesaria una valoración continua de los virus presentes en el ambiente natural para producir vacunas que sean eficaces de cara a las variantes antigénicas que surjan. La serotipificación de aislamientos y de cepas de IBV se ha realizado utilizando pruebas de inhibición de la hemoaglutinación (IH) (1, 36) y la neutralización del virus (NV) en embriones de polluelos (23), en los TOC (22) y en cultivos celulares (29). También se ha empleado la neutralización de focos fluorescentes para diferenciar cepas (19). Los MAb, que normalmente se utilizan en enzimoinmunoensayos (ELISA), han resultado útiles para agrupar y diferenciar las cepas del IBV (30, 38). Las limitaciones de la definición del serotipo de Ia BIA mediante análisis por MAb derivan de la falta de disponibilidad de MAb o de hibridomas y de la necesidad de producir nuevos MAb con especificidad apropiada al mismo ritmo con el que emergen los nuevos serotipos variantes de BIA (34). e) Identificación genotípica Los métodos de genotipificación de la RC-PCR han sustituido mayoritariamente a la IH y la NV para determinar la identificación de una cepa de campo. Se han investigado las bases moleculares de la variación antigénica, generalmente mediante secuenciación de los nucleótidos del gen que codifica la proteína de las proyecciones o espículas (S) o, más específicamente, por secuenciación de los nucleótidos del gen que codifica la subunidad S1 de la proteína S (5, 40), que es donde se encuentra la mayoría de los epitopos a los que se unen los anticuerpos neutralizantes (39). No se ha detectado una correlación exacta con los resultados de la IH o la NV, pues, mientras los distintos serotipos suelen tener grandes diferencias (20 50%) en la secuencia deducida de aminoácidos de la subunidad S1 (40), otros virus que son claramente distintos en las pruebas de neutralización solo muestran un 2 3% de diferencia en la secuencia de aminoácidos (5). No obstante, en general hay una buena correlación entre los datos representados por la secuencia de S1 y el serotipo por NV, y eventualmente será posible seleccionar cepas vacunales teniendo en cuenta los datos de las secuencias. Laa principales ventajas de los métodos de genotipificación son: un tiempo rápido de respuesta y la habilidad para detectar una variedad de genotipos dependiendo de las pruebas utilizadas. La RFLP RT- PCR diferencia los serotipos del IBV basados en patrones únicos de las bandas por la electroforesis que forman los fragmentos de S1 digeridos por los enzimas de restricción tras la amplificación del gen por la RT- PCR (33, 41). El procedimiento RFLP RT-PCR puede utilizarse en conjunción con una sonda de ADN marcado con biotina para primero detectar el IBV en fluidos de huevo recogidos después de la inoculación de huevos con muestras clínicas (32). Mediante la prueba de la RFLP RT-PCR se pueden identificar todos los serotipos conocidos del IBV así como las variantes víricas. Puede utilizarse el genotipo específico S1 de RT PCR para identificar serotipos específicos del IBV (35). Los cebadores específicos del gen S1 para serotipos de Massachussets (Mass), Connecticut, Arkansas y JMK se utilizan en conjunción con un juego de cebadores universal que amplifica todos los serotipos del IBV. También se han elaborado los cebadores para los serotipos DE/072/92 y California. Puede que otras variantes de serotipos resulten ser del IBV si se utilizan cebadores universales, pero no puede identificarse el serotipo específico. Se pueden identificar las infecciones causadas por múltiples serotipos de IBV. La secuenciación de los nucleótidos de un fragmento del gen S1 relevante para diagnóstico es la técnica más utilizada para la diferenciación de las cepas del IBV y se ha convertido en el método de genotipificación preferido en muchos laboratorios. La secuenciación de los nucleótidos también prueba que la recombinación entre las cepas de BI ocurre con frecuencia (7, 50). La secuenciación de los ciclos del producto de la RT-PCR correspondiente a la región amino-terminal hipervariable del S1 puede utilizarse en 4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

5 diagnóstico para identificar los asilamientos de campo previamente reconocidos, así como sus variantes (37). La comparación y el análisis de secuencias de aislamientos de campo desconocidos y de sus variantes, también desconocidas, con cepas de referencia para establecer su posible relación constituyen ventajas significativas de la secuenciación. Recientemente, se ha comprobado que los coronavirus aislados en pavos y faisanes son genéticamente similares al IBV, mostrando una identidad nucleotídica de aproximadamente el 90% en la región II muy conservada del extremo 3 no traducible (UTR) del genoma del IBV (9, 10). No se ha establecido el posible papel de estos coronavirus en las infecciones por IBV. Las pruebas de la RT-PCR se utilizan principalmente para la identificación del virus y su aplicación para el avance del conocimiento en las investigaciones epidemiológicas durante los brotes del IBV. Sin embargo, las pruebas de la RT-PCR, tal como existen ahora, no proporcionan información sobre la patogenicidad vírica. Procedimiento de la prueba RT-PCR i) Extracción de ARN vírico Puede utilizarse cualquier método de extracción de ARN. Están disponibles muchos protocolos en revistas, libros y en la Red. Sin embargo, para extraer ARN de alta calidad del líquido alantoideo se recomienda el Mini kit Qiagen Viral RNA ( Este Mini kit está recomendado para extraer el ARN del IBV de tejidos o frotis. Todos los ARN extraídos deben almacenarse entre 20 C y 80 C, hasta que sean probados. Para un almacenamiento largo, se aconseja guardar el ARN a 80 C. ii) Oligos comerciales Los óligos comerciales pueden comprarse a través de cualquier proveedor comercial. Operon ( ha estado fabricando óligos comerciales de calidad durante varios años. El gen diana para la caracterización del IBV es la subunidad S1 del gen de la glicoproteína de las espículas. Un par de cebadores comúnmente utilizado para la amplificación de cepas del IBV de diferentes genotipos es el óligo S15 mod (directo): 5 -TGA-AAA-CTG-AAC-AAA-AGA-3 y CK2 (inverso): 5 - CNG-TRT-TRT-AYT-GRC-A-3 (26). El amplicón S15 mod/ck2 del óligo tiene una longitud de aproximadamente 700 pb empezando desde el comienzo del gen S1 y extendiéndose por las dos regiones hipervariables utilizadas para la genotipificación. iii) Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa Están disponibles en el mercado muchos kits de la RT-PCR de uno y dos pasos de fabricantes de los que se afirma que poseen una gran sensibilidad y fidelidad de los enzimas. El kit de RT-PCR más recomendado es el kit básico, de dos pasos, para ARN de Applied Biosystems ( La transcripción inversa se realiza de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La preparación de la RT se lleva a cabo utilizando hexámeros aleatorios (suministrados con el kit) o con el cebador inverso de PCR, en este caso CK2 (35). Un ciclo de RT se realiza con los siguientes parámetros: 25 C durante 10 minutos, 42 C durante 25 minutos, 95 C durante 5 minutos y se mantiene a 4 C. El volumen de reacción total de la RT se añade a la muestra base de reacción para la PCR. La PCR se realiza utilizando los siguientes parámetros: 95 C durante 2 minutos, 45 ciclos de 95 C durante 30 segundos, 52 C durante 30 segundos, 68 C durante 30 segundos, extensión final de 68 C durante 12 minutos, y se mantiene a 4 C. Las muestras se concentran en un evaporador durante toda la noche o mediante el uso de centrifugado al vacío. Las muestras secas se resuspenden en 12 µl de agua tratada con DEPC y 6 µl de tampón de carga antes de la electroforesis en un gel de agarosa al 1,8% que contenga bromuro de etidio. Los geles se visualizan con una caja con luz UV. Las bandas se comparan con una escalera de 100 pares de bases disponible en el mercado y con un control positivo de IBV. iv) Secuenciación del gen S1 Se suprimen del gel de agarosa las bandas visualizadas que sean de tamaño similar al control positivo. El producto de la PCR se separa del gel de agarosa utilizando el kit Qiagen Gel Extraction ( u otro kit de extracción de gel comercializado. Los productos de la PCR purificados se corren en un segundo gel de agarosa al 1,8% con bromuro de etidio para determinar la cantidad de producto presente. Se necesitan aproximadamente 20 µl (10 ng/µl) del producto de la PCR para la secuenciación. La secuenciación se puede realizar en el Sequencing & Genotyping Center de la Universidad de Delaware, Newark, DE ( o en otra universidad o instalación de secuenciación comercial. Los cromatogramas de secuencia se editan utilizando el software de análisis ADNStar o el programa 4peaks de uso libre en la Red ( o chromas lite ( Las secuencias de aislamientos del IBV editadas se caracterizan mediante el uso de BLASTn para nucleótidos o BLASTp para el análisis de proteinas ( Manual de la OIE sobre animales terrestres

6 2. Pruebas serológicas Se han descrito varias pruebas. Las que se consideran aquí comprenden la NV (23), la inmunodifusión en gel de agar (IGDA) (48), la IH (1) y los ELISA (42). Cada prueba tiene sus ventajas e inconvenientes respecto a la realización, la especificidad, la sensibilidad y el coste. En general, para pruebas serológicas rutinarias, las pruebas de la NV son demasiado costosas y poco prácticas y las de tipo IGDA carecen de sensibilidad. Las pruebas ELISA e IH son muy adecuadas para la serología de rutina. Los ELISA son útiles para el control general de la exposición al IBV y pueden detectar las respuestas de anticuerpos a todos los serotipos. Cuando la IH se utiliza en sueros de pollos jóvenes en crecimiento tales como pollas y pollos para carne (broilers), puede proporcionar información sobre el estado de los anticuerpos específicos de serotipo en la bandada. El control regular de los sueros de las poblaciones aviares respecto a los títulos de anticuerpo contra BIA puede servir de ayuda para indicar el nivel de respuesta a la vacuna o al desafío natural. Debido a que los sueros de pollo de más edad, contienen anticuerpos que presentan fuerte reacción cruzada contra cepas antigénicamente no relacionadas, no se puede utilizar el serodiagnóstico de brotes sospechosos de la enfermedad con un grado alto de seguridad. a) Neutralización del virus En las pruebas de NV, todos los sueros se deben calentar primero a 56 C durante 30 minutos. El virus se mezcla con suero y se incuba durante minutos a 37 C o a temperatura ambiente. El sistema más empleado son los embriones de pollo, pero los anticuerpos también pueden medirse utilizando los TOC o cultivos celulares. Se han empleado dos métodos para estimar los anticuerpos neutralizantes. Uno emplea una concentración constante de suero que reacciona con varias diluciones de virus (el método alfa) y otro emplea una cantidad constante de virus y varias diluciones de suero (el método beta). En el método alfa, se enfrentan diluciones decimales de virus adaptado al huevo con una dilución fija de antisuero (normalmente 1/5) y las mezclas se inoculan en grupos de cinco a diez huevos. En paralelo, se titula el virus solo. Se calculan los puntos finales por el método de Kärber o por el de Reed y Muench. Los resultados se expresan como un índice de neutralización (NI) que representa la diferencia en log 10 de los títulos del virus solo y de los de las mezclas virus/antisuero. Los valores de NI pueden alcanzar 4,5 7,0 en el caso de mezclas homólogas de virus/suero; valores < 1,5 son inespecíficos, y un virus heterólogo puede dar valores tan bajos como 1,5. El método beta es la prueba de neutralización utilizada con más frecuencia para el ensayo de anticuerpos con embriones de pollo. Se enfrentan diluciones dobles o cuádruples de antisuero con un volumen igual de una dilución de virus, que normalmente se fija en 100 o 200 EID 50 (dosis infecciosas medias para embriones) por 0,05 ml, y se inoculan 0,1 ml de cada mezcla en la cavidad alantoidea de cinco a diez huevos embrionados. Simultáneamente, se realiza un control de titulación de virus para confirmar que la dilución fijada de virus en las mezclas virus/suero está entre y EID 50. Como antes, se determinan los títulos de los sueros a punto final por el método de Kärber o por el de Reed y Muench, pero aquí se expresan como recíprocos de los log 2 de las diluciones. Este método de virus fijo/suero variable también se puede emplear para pruebas de neutralización en cultivos de órganos traqueales utilizando cinco tubos por dilución de suero, como suele ser convencional con otros virus (22). Los resultados se calculan según Reed y Muench y los títulos víricos se expresan como dosis cilioestáticas medias por unidad de volumen (log 10 CD 50 ). Los títulos del suero se expresan de nuevo como recíprocos de los log 2 de las diluciones. Esta prueba es más sensible que otras, pero los aspectos técnicos limitan una adopción más extendida. b) Inhibición de la hemoaglutinación Se ha descrito un protocolo estandarizado para la prueba IH con IBV (1), y el procedimiento que se detalla a continuación está basado en dicho estándar. Cepas y aislamientos de IBV aglutinarán eritrocitos de pollo (RBC) después de un tratamiento con neuraminidasa (44, 45). La cepa seleccionada para la producción de antígeno puede variar, en función de las necesidades del diagnóstico. El antígeno para la prueba IH se prepara a partir de los líquidos alantoideos repletos de IBV. Los procedimientos para las pruebas HA e IH se realizan a 4 C. Para las pruebas de HA e IH, los procedimientos se llevarán a cabo a 4 C. Prueba de la inhibición de la hemoaglutinación i) Se coloca 0,025 ml de PBS, ph 7,0 7,4, en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico con fondo en U o en V. 6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

7 ii) Se coloca 0,025 ml del antígeno vírico en el primer pocillo. Para una determinación ajustada del contenido HA, esto se debe hacer a partir de una serie inicial de diluciones de pequeño rango, es decir 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, etc. iii) Se hacen diluciones dobles de volúmenes de 0,025 ml del antígeno vírico a los largo de la placa. iv) Se coloca 0,025 ml adicionales de PBS a cada pocillo. v) Se deposita en cada pocillo 0,025 ml de una solución al 1% (v/v) de RBCs de pollo. vi) Se mezcla, golpeando la placa muy suavemente, y se deja que los RBC sedimenten durante 40 minutos a 4 C, cuando los RBC control formen un botón definido por sedimentación. vii) La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de desplazamiento de los RBC sedimentados en forma de lágrima. La titulación debe leerse como la dilución mayor que da una HA completa sin ese tipo de desplazamiento; esto representa el 100% de HA y 1 unidad de HA (HAU) y se puede calcular de modo ajustado el valor de las diluciones iniciales. Prueba de la inhibición de la hemoaglutinación La prueba IH se utiliza en el diagnóstico y en el control rutinario de las respuestas a la vacuna de poblaciones aviares. i) Se coloca 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico con fondo en U o en V. ii) Se coloca 0,025 ml del suero (5) en el primer pocillo. iii) Se hacen diluciones dobles de volúmenes de 0,025 ml suero a los largo de la placa. iv) Se añade a cada pocillo 0,025 ml con 4 HAU de antígeno vírico y se deja durante 30 minutos. v) Se añade a cada pocillo 0,025 ml de una solución al 1% (v/v) de RBC de pollo y, después de mezclar cuidadosamente, se deja durante aproximadamente 40 minutos que sedimenten los RBC, a cuyo tiempo los RBC control forman por sedimentación un botón definido. vi) El título por IH es la dilución más alta de suero que origina la inhibición completa de 4 HAU de antígeno. La aglutinación se determina de modo más exacto inclinando la placa. Solamente se considera que muestran inhibición los pocillos donde los RBC se desplazan del mismo modo que en los pocillos control (que contienen sólo 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS). vii) La validez de los resultados se contrasta contra un suero control negativo, que no debería de dar un título >2 2, y con un suero control positivo, cuyo título debería estar dentro de una dilución del título conocido. viii) Por lo general, los sueros se consideran positivos si tienen un título de 2 4 o superior. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, incluso en poblaciones SPF, una pequeña proporción de pájaros puede mostrar un título inespecífico de 2 4, aunque normalmente se trata de aves con más de 1 año de edad. c) Enzimoinmunoensayo La técnica ELISA es un método serológico sensible y que suministra las reacciones más rápidas y los títulos de anticuerpos más altos que otras pruebas (42). Carece de especificidad de cepa o de tipo, pero es valioso para analizar respuestas a la vacunación en condiciones de campo. Existen preparaciones comercializadas de ELISA -que se basan en estrategias diferentes para la detección de anticuerpos contra IBV. Normalmente dichas pruebas se han evaluado y validado por el fabricante, y, por lo tanto, es importante para su uso seguir cuidadosamente las instrucciones que se especifican. Los enzimoinmunoensayos se utilizan ampliamente para identificar poblaciones infectadas por IBV en pollos para carne mediante el reconocimiento de títulos elevados de anticuerpos. Si en la granja se vuelve a presentar la IB en la siguiente población de aves, se realizan intentos para aislar el virus y se establece su genotipo por secuenciación de RFLP o S1. d) Inmunodifusión en gel de agar La prueba de la IGDA se puede utilizar en el diagnóstico (48). El antígeno se prepara a partir de un homogeneizado de las membranas corioalantoideas de embriones de pollo infectados. Para producir antígeno, a menudo se utiliza la cepa Beaudette, que es letal para los embriones. La prueba carece de sensibilidad y proporciona resultados poco fiables, ya que la presencia y la duración de los anticuerpos precipitantes puede variar en las aves individualmente. Manual de la OIE sobre animales terrestres

8 C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIALE DE DIAGNÓSTICO Todas las vacunas comerciales vivas e inactivas deben estar autorizadas. Las cepas utilizadas en vacunas de virus vivos, generalmente requieren atenuación. Actualmente, muchos países sólo permiten vacunas vivas del tipo Massachussets, tales como la H 120. Algunos países también pueden tener vacunas autorizadas contra otras cepas vivas tales como la Connecticut, la Arkansas, o la Delaware 072 (USA) o la 4/91 (Reino Unido). Las vacunas vivas pueden presentarse en aerosoles, en agua potable, o por vía intraocular. La eficacia de las vacunas inactivadas depende en gran medida de la preparación y administración adecuada de una vacuna viva. Las vacunas inactivadas deben administrase a las aves de forma individual, por medio de una inyección intramuscular o subcutánea. Pueden utilizarse cepas variantes en la preparación de vacunas autógenas inactivadas para controlar la BI en las ponedoras y en las reproductoras. Las vacunas vivas producen una mejor inmunidad local en el tracto respiratorio y también pueden proteger frente a un espectro más amplio de antígenos de cepas naturales (18). Sin embargo, las vacunas vivas no pueden proteger a las bandadas de ponedoras frente al desafío con cepas de serotipos variantes, especialmente común en granjas con aves de edades distintas, donde los descensos de la producción no son corrientes a una edad tan temprana como las 40 semanas de vida (27). Las vacunas vivas conllevan el riesgo de una patogenicidad residual asociada con el pase de la vacuna en bandadas. Sin embargo, el empleo de técnicas apropiadas de distribución masiva (por ejemplo, aerosoles o agua potable) para asegurar una cobertura y una distribución uniforme de la vacuna en la población, y evitar el pase de la vacuna en aves. Sin embargo, con la aplicación masiva adecuada de las técnicas (p. ej., aerosol y agua potable) se puede conseguir una distribución uniforme de las vacuna en la bandada y evitar el pase de la vacuna. Además, el uso de las vacunas a las dosis recomendadas por los fabricantes ayudará a evitar su reversión durante los pases que puede provocarse por la aplicación de dosis fraccionadas. Hay perspectivas para la obtención de vacunas diseñadas por ingeniería genética (4), y se están desarrollando sistemas de vacunación in ovo (47). En el capítulo Principios de producción de vacunas veterinarias, se presentan las directrices para la producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el capítulo son de carácter general. En los países en que se producen las vacunas contra la BIA, hay que cumplir estándares nacionales e internacionales. La autoridad que concede el permiso de producción debe suministrar información y apoyo sobre los requisitos particulares. A menudo, estos se presentan en términos generales de aplicación a todas las vacunas -para aves y mamíferos, vivas o inactivadas, víricas y bacterianas. Puede haber también requisitos específicos que se aplican a las vacunas contra la BIA, vivas y atenuadas. Como ejemplos, se indican las referencias de la normativa aplicable en Europa y en EE.UU. (13 15, 46). Continúa aumentando la lista de agentes exógenos que deben estar ausentes. Los fabricantes deben conocer los que sean de aplicación actual en su país. Las adiciones más recientes a la lista son el virus de la nefritis aviar y el neumovirus aviar. En las vacunas contra la BIA, existen diferencias importantes entre los diversos países en lo que respecta al virus de desafío que se emplea en las pruebas de potencia y en su validación. Tradicionalmente, se ha utilizado para las pruebas de desafío la cepa virulenta M-41 (Mass 41) del tipo Massachusetts, tanto para vacunas vivas como inactivadas. Aunque este tipo es todavía común, en muchos países no es a menudo el tipo único o el dominante, y puede ser aconsejable preparar vacunas de otros tipos. Es lógico que los desafíos se realicen con el mismo tipo que está presente en la vacuna. Establecer criterios para validar el virus de desafío puede ser más difícil para otros tipos que no sean el Massachusetts debido, en general, a su menor virulencia. Normalmente, se piensa que las vacunas inactivadas protegen contra el descenso de la producción de huevos. El virus de desafío tradicional M-41, como se describe en este capítulo, causa un descenso de al menos el 67% en controles no vacunados, pero cuando se usan otros tipos, se pueden considerar satisfactorios unos descensos mucho menores, dependiendo de la evidencia publicada sobre los efectos de estas cepas en condiciones de campo. Hay también una tendencia a relajar los criterios para desafíos con el tipo Massachusetts, y la Farmacopea Europea define ahora que un descenso satisfactorio con los tipos Massachusetts es de al menos el 35%, y, para tipos no Massachussets, de al menos el 15%, con tal de que el descenso sea proporcionado a la evidencia documentada (15). 1. Control de inóculo a) Características del inóculo Para cualquier tipo de vacuna que se produzca se debe emplear un sistema de lotes de inóculo (inóculo original). Cada virus debe designarse según la cepa y el origen, y debe estar libre de contaminación con 8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

9 otras cepas de IBV y de agentes extraños. Se debe disponer de servicios de conservación separados para las cepas de virus utilizadas como vacuna y las utilizadas para el desafío. En vacunas con virus vivos, muchos países sólo permiten cepas del tipo Massachusetts. Algunos países permiten otras cepas, normalmente teniendo en cuenta que tales cepas ya están presentes en sus poblaciones nacionales. El tipo antigénico incorporado, tanto en las vacunas vivas como en las inactivadas, requiere justificación, si existe duda respecto a su existencia en un país. b) Método de cultivo Todos lo virus de inóculo se crecen en el saco alantoideo de embriones de pollo en desarrollo o en cultivos celulares adecuados. Los huevos deben proceder de una población SPF. c) Validación como vacuna Pureza Cada lote de siembra debe estar libre de contaminación por bacterias, hongos, micoplasmas y virus. Para la detección de virus extraños, el inóculo se trata primero con un antisuero monoespecífico de título elevado, preparado contra la cepa examinada o contra una de idéntico tipo. Esta mezcla se cultiva de varios modos, designados para confirmar la ausencia de virus que por experiencia previa puedan se contaminantes potenciales. El antisuero no debe contener anticuerpos contra adenovirus, virus de la encefalitis aviar, rotavirus aviares, virus de la anemia de los pollos, viruela aviar (poxvirus aviar), virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la influenza A, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad bursal infecciosa, virus de la leucosis, reovirus, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus del pavo, virus asociados a los adenovirus, virus del síndrome 76 de descenso de la postura (producción de huevos) (EDS76), virus de la nefritis aviar, neumovirus aviar o virus de la retículo-endoteliosis. El inóculo suministrado a cada unidad del sistema de cultivo debe contener una cantidad de IBV neutralizado que tenga una infectividad inicial de al menos diez veces la dosis mínima de campo. Estos sistemas incluyen: 1. Embriones de pollo SPF, incubados durante 9 11 días, inoculados en el saco alantoideo y en la membrana corioalantoidea (dos pases). 2. Cultivos de fibroblastos de embrión de pollo, para los subgrupos A y B del virus de la leucosis. La prueba COFAL (prueba para la leucosis aviar utilizando la fijación de complemento) o el ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo, para el antígeno de la leucosis específico de grupo, se llevan a cabo en extractos celulares recogidos a los 14 días. Para el virus de la retículo-endoteliosis, se realiza una prueba de inmunofluorescencia sobre cubres en cultivos después de dos pases. 3. Cultivos de riñón de pollo SPF que se examinan para ECP, inclusiones celulares y agentes hemoadsorbentes, y que se cultivan hasta durante 20 días de incubación total, con pases realizados al menos cada 5 días. 4. Pollos SPF de edad mínima de vacunación que se inoculan intramuscularmente con 100 dosis de campo y en la conjuntiva con 10 dosis de campo; esto se repite 3 semanas más tarde, cuando los pollos se inoculan también en la base de la pata e intranasalmente con diez dosis de campo. Las observaciones se hacen en conjunto durante 6 semanas, y se recoge el suero para pruebas de encefalomielitis aviar, bursitis infecciosa, enfermedad de Marek, enfermedad de Newcastle e infección por Salmonella pullorum. Potencia Las vacunas dirigidas a proteger contra la pérdida de producción de huevos deben probarse en cuanto a duración de la respuesta del anticuerpo. Los títulos medios de IH deben ser >6 log 2 hasta por lo menos las 60 semanas de edad. Las pruebas serológicas deben hacerse a intervalos frecuentes para comprobar que los títulos no han aumentado debido a una respuesta secundaria por infección con un IBV extraño. Las vacunas dirigidas a proteger contra la forma respiratoria de la enfermedad en pollos para carne (broilers) o en pollos de cría, deben probarse también en cuanto a la duración de la respuesta del anticuerpo; en el caso de pollos para carne (broilers), esto debe hacerse hasta la edad normal del sacrificio, y en casos de pollas de cría hasta la edad en que se debería administrar una vacunación de refuerzo (a menudo a las semanas). Inocuidad Las pruebas sobre el inóculo de virus deben incluir una prueba de la capacidad potencial para revertir la virulencia. Las vacunas vivas y las inactivadas deben ensayarse para inocuidad como se indica en la sección C.4.b. Manual de la OIE sobre animales terrestres

10 Eficacia Para demostrar la eficacia, se debe hacer un ensayo de la vacuna con el inóculo primario y con el inóculo de trabajo después de cinco pases del inóculo primario, y realizar pruebas para demostrar su efecto protector. Para las vacunas vivas, se vacuna un mínimo de diez pollos SPF de 3 4 semanas con la dosis recomendada, vía intranasal o intraocular. Se mantienen por separado diez pollos control no vacunados de la misma edad y origen. Después de 3-4 semanas, todas las aves de ambos grupos se inoculan en desafío, vía intranasal o intraocular, con EID 50 de la cepa virulenta Massachusetts M-41. Después de 4 5 días del desafío, se toma un frotis traqueal de cada ave y se coloca en 3 ml de caldo con antibióticos. Cada líquido se prueba para IBV inoculando (0,2 ml) cinco huevos embrionados de 9 11 días de incubación. Una prueba alternativa a la de tomar frotis consiste en sacrificar las aves a los 4 6 días de la inoculación de desafío y examinar microscópicamente los anillos traqueales para actividad de los cilios (20). La incapacidad de resistir un desafío se refleja en la pérdida de la movilidad de los cilios. La vacuna viva es adecuada para su empleo si, después del desafío, al menos el 90% de las aves vacunadas no muestran evidencia del IBV en sus tráqueas, mientras que en el 90% o más de las aves control debería de haber evidencia de la presencia del virus. Para valorar una vacuna inactivada dirigida a proteger aves ponedoras, se vacunan 30 o más pollos SPF según se recomiende, a la edad más temprana permitida. Si se realiza antes una vacunación primaria con vacuna viva, a un grupo adicional de aves se administra solo la vacunación primaria. En ambos casos, estas vacunaciones primarias no deben hacerse después de las 3 semanas de edad. La vacuna inactivada se administra 4 6 semanas después de la vacuna viva primaria. Otro grupo control de 30 aves se deja sin vacunar. Todos los grupos se mantienen por separado hasta 4 semanas antes de la producción máxima de huevos, y luego se mantienen juntos. Se controla la producción individual de huevos y, una vez que se normaliza, todas las aves reciben una inyección de desafío y se registra la producción de huevos durante otras 4 semanas. El inóculo de desafío debe ser lo bastante fuerte como para asegurar una pérdida de producción en las 3 semanas siguientes al desafío. La pérdida en el grupo control debe ser por lo menos del 67%; el grupo que recibió la vacunación primaria con virus vivos y después la vacuna inactivada debe mantener el nivel de producción previo, y el grupo que sólo recibió la vacunación primaria debe mostrar una pérdida intermedia de producción. Se toman sueros de todas las aves al mismo tiempo que se vacuna, 4 semanas después, y en el desafío; no debería haber respuesta en las aves control. Para evaluar una vacuna inactivada diseñada para proteger las aves contra la enfermedad respiratoria, se vacunan 20 pollos SPF de 4 semanas tal como se recomienda. Junto con este primer grupo, se mantiene otro de 20 aves de la misma edad y origen como control. Se determinan las respuestas de anticuerpos 4 semanas después; no debería haber respuesta en las aves control. A continuación todas las aves se inoculan en desafío con 10 3 CID 50 (50% de dosis infectiva en pollo) de virus virulento, se sacrifican 4 7 días después y se examinan secciones traqueales para observar la movilidad de los cilios. Al menos el 80% de los controles no vacunados deben mostrar un cilio completo, mientras que los cilios traqueales deben permanecer sin ser afectados en un porcentaje similar de las aves vacunadas. En algunos países hay vacunas disponibles, tanto vivas como atenuadas, que contienen también el virus de la enfermedad de Newcastle, el de la bursitis infecciosa, reovirus y el virus EDS76. La eficacia de los diferentes componentes de estas vacunas se debe establecer de forma independiente y luego en forma conjunta, para determinar si existe interferencia entre los diferentes antígenos. 2. Método de producción Todas las cepas de virus destinadas a vacunas vivas se cultivan en el saco alantoideo de embriones de pollo SPF o en cultivos celulares adecuados. Para las vacunas inactivadas, se pueden utilizar huevos de gallina de poblaciones sanas que no sean SPF. El líquido reunido se clarifica y se titula para infectividad. Para vacunas vivas este líquido se liofiliza en viales, y para vacunas inactivadas se mezcla con aceite mineral de grado alto hasta formar una emulsión a la que se añade un conservante. 3. Control del proceso El contenido antigénico necesario se basa en las pruebas iniciales con lotes de vacunas de eficacia demostrada en ensayos de laboratorio y de campo. Las titulaciones sobre infectividad se realizan en embriones de pollo. Las vacunas vivas deben contener por lo menos EID 50 por dosis y por ave hasta la fecha de caducidad indicada, y no menos de EID 50 por dosis y por ave después de una incubación a 37 C durante 7 días a la fecha del envasado. Para las vacunas inactivadas, el agente inactivante y el proceso de inactivación deben ser 10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

11 eficaces durante la producción tanto sobre el IBV como sobre los contaminantes potenciales. Con la utilización de beta-propiolactona o formalina, cualquier virus vivo de la leucosis o cualquier especie de Salmonella deben eliminarse; y con otros agentes inactivantes, se debe hacer inactivo el espectro completo de posibles contaminantes. Es importante asegurar la homogeneidad de las suspensiones antes de los procesos de inactivación y, después de la inactivación, se debería llevar a cabo una prueba de inactivación en cada lote de la masa del material cosechado, así como en el producto final. Las pruebas de inactivación deben ser apropiadas para la vacuna particular y deben comprender dos pases en cultivos celulares, en embriones o en pollos, inoculando 0,2 ml y haciendo diez réplicas en cada pase. 4. Control de lotes a) Esterilidad Cada lote de vacuna viva debe probarse para ausencia de agentes extraños como en el inóculo de virus (véase el capítulo ). b) Inocuidad Para vacunas vivas Se ha de utilizar no menos de diez pollos de una población SPF que sean de la edad mínima para la vacunación que se establezca en el prospecto. Se administra a cada pollo, por vía intraocular, diez dosis de la vacuna una vez reconstituida para obtener una concentración adecuada para la prueba. Se obserban los pollos durante 21 días. Para vacunas dirigidas a pollos de 2 o más semanas de edad, se utilizan los pollos inoculados según la "prueba para agentes extraños utilizando pollos" (véase la sección C.1.c.4.). Si durante el período de observación más de dos pollos mueren por causas no relacionadas con la vacuna, se repite la prueba. La vacuna supera la prueba si ningún pollo muestra síntomas clínicos serios, particularmente signos respiratorios, y si no muere ningún pollo por causas atribuibles a la vacuna. Para vacunas inactivadas Se inolculan diez pollos de días de edad, de una población SPF, con una dosis doble de vacuna por la vía recomendada. Se observan los pollos durante 21 días. Se verifica que no ocurren reacciones anormales locales o sistémicas. c) Potencia La prueba de potencia se establece a partir de los resultados de las pruebas de eficacia del inóculo primario de virus. Las vacunas vivas se prueban para comprobar su potencia mediante la titulación de la infectividad, y las inactivadas se prueban midiendo la producción de anticuerpos. La prueba de potencia para un lote de vacuna inactivada consiste en vacunar 20 pollos SPF de 4 semanas de edad y demostrar que cuatro semanas después su título IH medio no es inferior a 6 log 2. d) Duración de la inmunidad Debe mostrarse que la vacuna tiene la potencia necesaria para lograr la duración pretendida de inmunidad al final del período de caducidad. e) Estabilidad Se deben probar al menos tres lotes en esta prueba y deben dar resultados satisfactorios pasados 3 meses de la fecha de caducidad. La estabilidad de una vacuna viva debe medirse por el mantenimiento de un título de infectividad adecuado. La estabilidad de una vacuna inactivada debe medirse a intervalos mediante pruebas de potencia de los lotes. Debería determinarse a través del período de validez la concentración y persistencia del conservante. No debería producirse ningún cambio físico en la vacuna y debería adquirir su estado inicial de emulsión después de una agitación rápida. f) Conservantes Existen unos niveles máximos para el empleo de antibióticos, conservantes, y agentes inactivantes residuales. Manual de la OIE sobre animales terrestres

12 g) Precauciones (riesgos) No se conoce que el IBV represente por sí mismo, un peligro para el personal empleado en la producción o prueba de las vacunas. Sin embargo, los agentes indeseables pueden ser peligrosos y las fases iniciales de la manipulación de un nuevo inóculo de virus deben realizarse en una cabina de seguridad. Una precaución deseable en la producción de todas las vacunas es tomar medidas para reducir la exposición del personal a aerosoles de proteínas extrañas. En este trabajo nunca se debe emplear a personas que sean alérgicas a los componentes del huevo. 5. Pruebas sobre el producto final a) Inocuidad En cada lote del producto final se debe realizar una prueba de inocuidad, como en la sección C.4.b. b) Potencia En cada lote de producto final se debe realizar una prueba de potencia, como en la sección C.4.c., en la fecha de producción y al final del período de caducidad indicado. REFERENCIAS 1. ALEXANDER D.J., ALLAN W.H., BIGGS P.M., BRACEWELL C.D., DARBYSHIRE J.H., DAWSON P.S., HARRIS A.H., JORDAN F.T., MACPHERSON I., MCFERRAN J.B., RANDALL C.J., STUART J.C., SWARBRICK O. & WILDING G.P. (1983). A standard technique for haemagglutination inhibition tests for antibodies to avian infectious bronchitis virus. Vet. Rec., 113, ALEXANDER D.J., GOUGH R.E. & PATTISON M. (1978). A long-term study of the pathogenesis of infection of fowls with three strains of avian infectious bronchitis virus. Res. Vet. Sci., 24, BHATTACHARJEE P.S., NAYLOR C.J. & JONES R.C. (1994). A simple method for immunofluorescence staining of tracheal organ cultures for the rapid identification of infectious bronchitis virus. Avian Pathol., 23, CASAIS R., DOVE B., CAVANAGH D. & BRITTON P. (2003). A recombinant avian infectious bronchitis virus expressing a heterologous spike gene demonstrates that the spike protein is a determinant of cell tropism. J. Virol., 77, CAVANAGH D. (1991). Sequencing approach to IBV antigenicity and epizootiology. En: Proceedings of the Second International Symposium on Infectious Bronchitis. Rauischholzhausen, Germany, June 1991, CAVANAGH D. (2003). Severe acute respiratory syndrome vaccine development: experiences of vaccination against avian infectious bronchitis coronavirus. Avian Pathol., 32, CAVANAGH D., DAVIS, P.J. & COOK J.K.A. (1992). Infectious bronchitis virus: evidence for recombination within the Massachusetts serotype. Avian Pathol., 21, CAVANAGH D., MAWDITT K., BRITTON P. & NAYLOR C.J. (1999). Longitudinal field studies of infectious bronchitis virus and avian pneumovirus in broilers using type-specific polymerase chain reactions. Avian Pathol., 28, CAVANAGH. D., MAWDITT K., SHARMA. M., DRURY S.E., AINSWORTH H.L., BRITTON P. & GOUGH R.E. (2001). Detection of a coronavirus from turkey poults in Europe genetically related to infectious bronchitis virus of chickens. Avian Pathol., 30, CAVANAGH D., MAWDITT K., WELCHMAN D. DE B., BRITTON P. & GOUGH R.E. (2002) Coronaviruses from pheasants (Phasianus colchicus) are genetically closely related to coronaviruses of domestic fowl (infectious bronchitis virus) and turkeys. Avian Pathol., 31, CAVANAGH D. & NAQI S.A. (1997). Infectious Bronchitis. En: Diseases of Poultry, Tenth Edition, Calnek B. W., Barnes H.J., Beard C.W., McDougald L.R. & Saif Y.M., eds. Iowa State Press, Iowa, USA, Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

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