Aldosterone ELISA ( pg/ml)

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1 Userś Manual Aldosterone ELISA ( pg/ml) Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of Aldosterone in human serum, plasma and urine. HZ

2 Aldosterone ELISA HZ4128 Version 5.0 Effective, February 2010 (E Sept. 24, 2009) (SpMGL200801) Please use only the valid version of the package insert provided with the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Arbeitsanleitung. Si prega di usare la versione valida dell'inserto del pacco a disposizione con il kit. Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit. Table of Contents / Inhaltsverzeichnis / Tabella die Contenuti / Tabla de Contenidos 1 INTENDED USE PRINCIPLE OF THE TEST CLINICAL APPLICATIONS PROCEDURAL CAUTIONS AND WARNINGS LIMITATIONS SAFETY CAUTIONS AND WARNINGS SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE REAGENTS AND EQUIPMENT NEEDED BUT NOT PROVIDED REAGENTS PROVIDED ASSAY PROCEDURE CALCULATIONS PERFORMANCE CHARACTERISTICS EXPECTED NORMAL VALUES SERUM/PLASMA REFERENCE NORMAL VALUESURINE USO DEL KIT PRINCIPIO DEL METODO APPLICAZIONI CLINICHE PRECAUZIONI PER L USO LIMITI DEL METODO PRECAUZIONI PER L USO RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI REATTIVI E MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO REATTIVI FORNITI PRINCIPIO DEL METODO CALCOLO DEI RISULTATI CARATTERISTICHE DEL METODO VALORI ATTESISIERO / PLASMA VALORI ATTESIURINE Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 1

3 Aldosterone ELISA HZ FINALIDAD FUNDAMENTO DEL TEST APLICACIONES CLÍNICAS PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO LIMITACIONES ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS RECOGIDA DE MUESTRAS Y ALMACENAMIENTO REACTIVOS Y EQUIPAMIENTO REQUERIDO PERO NO PROVISTO REACTIVOS PROVISTOS PROCEDIMIENTO DE ENSAYO CÁLCULOS CARACTERÍSTICAS DEL PROCEDIMIENTO VALORES NORMALES ESPERADOS EN SUERO/PLASMA VALORES NORMALES DE REFERENCIA EN ORINA NAME UND ANWENDUNG PROBENMATERIAL LAGERUNG UND VORBEREITUNG KITINHALT VORBEREITUNG DER REAGENZIEN TESTDURCHFÜHRUNG TESTCHARAKTERISTIKA ERWARTETE WERTE FÜR SERUM REFERENZWERTE FÜR URIN REFERENCES / BIBLIOGRAFIA / REFERENCIAS / LITERATUR SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 2

4 1 INTENDED USE Aldosterone ELISA HZ4128 For the direct quantitative determination of Aldosterone in human serum, plasma and urine by an enzyme immunoassay. For in vitro diagnostic use only. 2 PRINCIPLE OF THE TEST The principle of the following enzyme immunoassay test follows the typical competitive binding scenario. Competition occurs between an unlabeled antigen (present in standards, control and patient samples) and an enzymelabelled antigen (conjugate) for a limited number of antibody binding sites on the microwell plate. The washing and decanting procedures remove unbound materials. After the washing step, the enzyme substrate is added. The enzymatic reaction is terminated by addition of the stopping solution. The absorbance is measured on a microtiter plate reader. The intensity of the colour formed is inversely proportional to the concentration of aldosterone in the sample. A set of standards is used to plot a standard curve from which the amount of aldosterone in patient samples and controls can be directly read. 3 CLINICAL APPLICATIONS Aldosterone is a potent mineral corticoid whose synthesis and release are controlled by the reninangiotensin system of the body. Aldosterone promotes the reabsorption of sodium in the distal tubules of the kidney resulting in potassium secretion along with sodium retention, which controls the circulating blood volume. Chronic overproduction and secretion of aldosterone leads to hypertension. Measurement of aldosterone levels in serum in conjunction with plasma renin levels can be used to differentiate between primary and secondary aldosteronism. Condition Serum Aldosterone Plasma Renin Primary Aldosteronism High Low Secondary Aldosteronism High High The measurement of aldosterone in concert with selective suppression and stimulation tests can be used to further differentiate primary aldosteronism into two basic types: Primary aldosteronism caused by an adenoma of one or both adrenals. Primary aldosteronism caused by adrenal hyperplasia. This differentiation is vital in the treatment and management of the disease. The adrenal adenomas respond well to surgery whereas hyperplastic disease of the adrenals is generally better managed medically. In summary, the precise and accurate measurement of serum aldosterone by enzyme immunoassay can be an important adjunct to a diagnostic laboratory battery for the differential diagnosis of hypertensive disease. 4 PROCEDURAL CAUTIONS AND WARNINGS 1. Users should have a thorough understanding of this protocol for the successful use of this kit. Reliable performance will only be attained by strict and careful adherence to the instructions provided. 2. Control materials or serum pools should be included in every run at a high and low level for assessing the reliability of results. 3. When the use of water is specified for dilution or reconstitution, use deionized or distilled water. 4. In order to reduce exposure to potentially harmful substances, gloves should be worn when handling kit reagents and human specimens. 5. All kit reagents and specimens should be brought to room temperature and mixed gently but thoroughly before use. Avoid repeated freezing and thawing of reagents and specimens. 6. A Standard curve must be established for every run. 7. The control should be included in every run and fall within established confidence limits. 8. Improper procedural techniques, imprecise pipetting, incomplete washing as well as improper reagent storage may be indicated when assay values for the control do not reflect established ranges. 9. When reading the microplate, the presence of bubbles in the microwells will affect the optical densities (ODs). Carefully remove any bubbles before performing the reading step. 10. The substrate solution (TMB) is sensitive to light and should remain colourless if properly stored. Instability or contamination may be indicated by the development of a blue colour, in which case it should not be used. 11. When dispensing the substrate and stopping solution, do not use pipettes in which these liquids will come into contact with any metal parts. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 3

5 Aldosterone ELISA HZ To prevent contamination of reagents, use a new disposable pipette tip for dispensing each reagent, sample, standard and control. 13. Do not mix various lot numbers of kit components within a test and do not use any component beyond the expiration date printed on the label. 14. Kit reagents must be regarded as hazardous waste and disposed of according to national regulations. 5 LIMITATIONS 1. All the reagents within the kit are calibrated for the direct determination of aldosterone in human serum, plasma and urine. The kit is not calibrated for the determination of aldosterone in saliva or other specimens of human or animal origin. 2. Do not use grossly hemolyzed, grossly lipemic, icteric or improperly stored serum or plasma. 3. Any samples or control sera containing azide or thimerosal are not compatible with this kit, as they may lead to false results. 4. Only Standard 0 may be used to dilute any high serum samples. Only the urine diluent may be used to dilute any high urine samples. The use of any other reagents may lead to false results. 5. The results obtained with this kit should never be used as the sole basis for a clinical diagnosis. For example, the occurrence of heterophilic antibodies in patients regularly exposed to animals or animal products has the potential of causing interferences in immunological tests. Consequently, the clinical diagnosis should include all aspects of a patient s background including the frequency of exposure to animals/products if false results are suspected. 6 SAFETY CAUTIONS AND WARNINGS POTENTIAL BIOHAZARDOUS MATERIAL Human serum that may be used in the preparation of the standards and control has been tested and found to be nonreactive for Hepatitis B surface antigen and has also been tested for the presence of antibodies to HCV and Human Immunodeficiency Virus (HIV) and found to be negative. However no test method can offer complete assurance that HIV, HCV and Hepatitis B virus or any infectious agents are absent. The reagents should be considered a potential biohazard and handled with the same precautions as applied to any blood specimen. CHEMICAL HAZARDS Avoid contact with reagents containing TMB, hydrogen peroxide and sulfuric acid. If contacted with any of these reagents, wash with plenty of water. TMB is a suspected carcinogen. 7 SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE Serum: Approximately 0.2 ml of serum is required per duplicate determination. Collect 45 ml of blood into an appropriately labelled tube and allow it to clot. Centrifuge and carefully remove the serum layer. Store at 4 C for up to 24 hours or at 10 C or lower if the analyses are to be done at a later date. Plasma: Approximately 0.2 ml of plasma is required per duplicate determination. Collect 45 ml of blood into EDTA plasma tubes. Store at 4 C for up to 24 hours or at 10 C or lower if the analyses are to be done at a later date. Urine: Approximately 0.2 ml of urine is required per duplicate determination. Collect 24hour urine into a specimen collection container. Store at 4 C for up to 24 hours or at 10 C or lower if the analyses are to be done at a later date. Consider all human specimens as possible biohazardous materials and take appropriate precautions when handling. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 4

6 Aldosterone ELISA HZ SPECIMEN PRETREATMENT Serum and plasma: This assay is a direct system; no specimen pretreatment is necessary. Urine: Dilute urine samples 1:50 in urine diluent before use. Example: To 1 ml of urine diluent, add 20 μl of urine sample. 8 REAGENTS AND EQUIPMENT NEEDED BUT NOT PROVIDED 1. Precision pipettes to dispense 50, 100, 150 and 300 μl 2. Disposable pipette tips 3. Distilled or deionized water 4. Plate shaker 5. Microwell plate reader with a filter set at 450nm and an upper OD limit of 3.0 or greater* (see assay procedure step 10). 6. Urine Diluent Required if urine samples are to be analysed. Used for dilution of urine specimens before assaying. Available in any quantity. REF ALD45011 (20 ml) 9 REAGENTS PROVIDED 1. Rabbit AntiAldosterone Antibody Coated Microwell PlateBreak Apart Wells Ready To Use. Contents: One 96 well (12x8) polyclonal antibodycoated microwell plate in a resealable pouch with desiccant. Storage: Refrigerate at 28 C; Stability: 12 months or as indicated on label. 2. AldosteroneHorse Radish Peroxidase (HRP) Conjugate Concentrate 50X. Contents: AldosteroneHRP conjugate in a proteinbased buffer with a nonmercury preservative. Volume: 300 μl/vial Storage: Refrigerate at 28 C; Stability: 12 months or as indicated on label. Preparation: Dilute 1:50 in assay buffer before use (eg. 40 μl of HRP in 2 ml of assay buffer). If the whole plate is to be used dilute 240 μl of HRP in 12ml of assay buffer. Discard any that is left over. 3. Aldosterone Standards Ready To Use. Contents: Six vials containing aldosterone in a human serumbased buffer with a nonmercury preservative. Prepared by spiking serum with a defined quantity of aldosterone. *Listed below are approximate concentrations, please refer to vial labels for exact concentrations. Standard Concentration Volume/Vial Standard 0 0 pg/ml 2.0 ml Standard 1 15 pg/ml 0.6 ml Standard 2 50 pg/ml 0.6 ml Standard pg/ml 0.6 ml Standard pg/ml 0.6 ml Standard pg/ml 0.6 ml Storage: Stability: Refrigerate at 28 C 12 months in unopened vials or as indicated on label. Once opened, the standards should be used within 14 days or aliquoted and stored frozen. Avoid multiple freezing and thawing cycles. 4. Control Ready To Use. Contents: One vial containing aldosterone in a human serumbased buffer with a nonmercury preservative. Prepared by spiking buffer with a defined quantity of aldosterone. Refer to vial label for expected value and acceptable range. Volume: 0.6 ml/vial; Storage: Stability: Refrigerate at 28 C 12 months in unopened vial or as indicated on label. Once opened, the control should be used within 14 days or aliquoted and stored frozen. Avoid multiple freezing and thawing cycles. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 5

7 Aldosterone ELISA HZ Wash Buffer Concentrate 10X. Contents: One bottle containing buffer with a nonionic detergent and a nonmercury preservative Volume: 50 ml/bottle Storage: Refrigerate at 28 C; Stability: 12 months or as indicated on label. Preparation: Dilute 1:10 in distilled or deionized water before use. If the whole plate is to be used dilute 50 ml of the wash buffer concentrate in 450 ml of water. 6. Assay Buffer Ready To Use. Contents: One vial containing a proteinbased buffer with a nonmercury preservative. Volume: 15 ml/vial Storage: Refrigerate at 28 C; Stability: 12 months or as indicated on label. 7. TMB Substrate Ready To Use. Contents: One bottle containing tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide in a nondmf or DMSO containing buffer. Volume: 16 ml/bottle Storage: Refrigerate at 28 C; Stability: 12 months or as indicated on label. 8. Stop Solution Ready To Use. Contents: One vial containing 1M sulfuric acid. Volume: 6 ml/vial Storage: Refrigerate at 28 C; Stability: 12 months or as indicated on label. 10 ASSAY PROCEDURE 10.1 Specimen Pretreatment: Serum and plasma: None. Urine: Dilute 1:50 in Urine Diluent Before Use Procedure All reagents must reach room temperature before use. Standards, controls and specimen samples should be assayed in duplicate. Once the procedure has been started, all steps should be completed without interruption. 1. Prepare working solutions of the aldosteronehrp conjugate and wash buffer. Dilute any urine samples if they are to be analyzed. 2. Remove the required number of microwell strips. Reseal the bag and return any unused strips to the refrigerator. 3. Pipette 50 μl of each standard, control and specimen sample (serum or diluted urine) into correspondingly labelled wells in duplicate. 4. Pipette 100 μl of the conjugate working solution into each well (We recommend using a multichannel pipette). 5. Incubate on a plate shaker (approximately 200 rpm) for 1 hour at room temperature. 6. Wash the wells 3 times with 300 μl of diluted wash buffer per well and tap the plate firmly against absorbent paper to ensure that it is dry. (The use of a washer is recommended). 7. Pipette 150 μl of TMB substrate into each well at timed intervals. 8. Incubate on a plate shaker for 1520 minutes at room temperature (or until Standard 0 attains dark blue colour for desired OD). 9. Pipette 50 μl of stop solution into each well at the same timed intervals as in step Read the plate on a microwell plate reader at 450nm within 20 minutes after addition of the stopping solution. * If the OD exceeds the upper limit of detection or if a 450nm filter is unavailable, a 405 or 415nm filter may be substituted. The optical densities will be lower, however, this will not affect the results of patient/control samples. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 6

8 OD 450nm Aldosterone ELISA HZ CALCULATIONS 1. Calculate the mean optical density of each Standard duplicate. 2. Draw a Standard curve on semilog paper with the mean optical densities on the Yaxis and the Standard concentrations on the Xaxis. If immunoassay software is being used, a 4parameter curve is recommended. 3. Calculate the mean optical density of each unknown duplicate. 4. Read the values of the serum and plasma samples directly off the Standard curve. 5. Read the values of the urine samples directly off the curve and multiply by a factor of 50. Next, multiply by the volume of collected 24hour urine (in ml) to obtain values in pg/24 hour. Finally, divide the pg/24 hour values by 1x10 6 to obtain values in μg/24 hour. 6. If a serum or plasma sample reads more than 1000 pg/ml then dilute it with Standard 0 at a dilution of no more than 1:8. The result obtained should be multiplied by the dilution factor. If a urine sample reads more than 1000 pg/ml then dilute it with the urine diluent at a dilution of no more than 1:2 (from the original 1:50 dilution). The result obtained should be multiplied by the dilution factor. TYPICAL TABULATED DATA Standard OD 1 OD 2 Mean OD Value (pg/ml) Unknown TYPICAL CALIBRATOR CURVE 2,5 2 1,5 1 0, Aldosterone (pg/ml) Sample curve only. Do not use to calculate results. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 7

9 Aldosterone ELISA HZ PERFORMANCE CHARACTERISTICS 12.1 SENSITIVITY The lower detection limit is calculated from the standard curve by determining the resulting concentration of the mean OD of Standard 0 (based on 10 replicate analyses) minus 2 SD. Therefore, the sensitivity of the Aldosterone ELISA kit is 10.0 pg/ml SPECIFICITY (CROSS REACTIVITY) The following compounds were tested for crossreactivity with the Aldosterone ELISA kit with aldosterone crossreacting at 100%. Steroid % Cross Reactivity Aldosterone Deoxycoticosterone 1.1 The following steroids were tested but crossreacted at less than 0.001%: Androsterone, Cortisone, 11Deoxycortisol, 21Deoxycortisol, Dihydrotestosterone, Estradiol, Estriol, Estrone and Testosterone INTRAASSAY PRECISION Three samples were assayed ten times each on the same Standard curve. The results (in pg/ml) are tabulated below: Sample Mean SD CV% INTERASSAY PRECISION Three samples were assayed ten times over a period of four weeks. The results (in pg/ml) are tabulated below: Sample Mean SD CV% Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 8

10 Aldosterone ELISA HZ RECOVERY Spiked samples were prepared by adding defined amounts of aldosterone to three patient serum samples. The results (in pg/ml) are tabulated below: Sample Obs.Result Exp.Result Recovery% 1 Unspiked Unspiked Unspiked LINEARITY Two patient serum samples were diluted with Standard 0. The results (in pg/ml) are tabulated below: Sample Obs.Result Exp.Result Recovery% 1 1:2 1:4 1:8 2 1:2 1:4 1: EXPECTED NORMAL VALUES SERUM/PLASMA As for all clinical assays each laboratory should collect data and establish their own range of expected normal values. Group Range (pg/ml) Normal Salt Intake, Standing Normal Salt Intake, Recumbent REFERENCE NORMAL VALUESURINE As for all clinical assays each laboratory should collect data and establish their own range of expected normal values. Group Range (μg/24 hr) Normal Salt Intake 519 Wilson, J.D. and Foster, D.W. Williams Textbook of Endocrinology 8 th Edition. W.B. Saunders Company, London. P 582, Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 9

11 1 USO DEL KIT Aldosterone ELISA HZ4128 Per la determinazione quantitativa diretta dell aldosterone in siero, plasma e urine umani con metodo immunoenzimatico. Solo per uso diagnostico in vitro. 2 PRINCIPIO DEL METODO Questo metodica immunoenzimatica applica il classico metodo competitivo. L antigene presente in standard, controlli e campioni compete con lo stesso antigene legato ad un enzima (coniugato) per un numero limitato di siti di un anticorpo specifici adsorbito sui pozzetti di una micropiastra. Dopo l incubazione l antigene non legato all anticorpo viene allontanato mediante lavaggio. Si aggiunge quindi un cromogeno e, dopo l incubazione, si arresta la reazione enzimatica con l aggiunta della soluzione di stop. Si misura con un lettore di micropiastre l assorbanza dei pozzetti. L intensità del colore formato è inversamente proporzionale alla concentrazione di aldosterone in standard, controlli e campioni. Si traccia quindi una curva di taratura, dalla quale, per interpolazione, è possibile ricavare la concentrazione di aldosterone presente in controlli e campioni. 3 APPLICAZIONI CLINICHE L aldosterone è un potente mineralcorticoide la cui sintesi e liberazione è controllata dal sistema reninaangiotensina. L aldosterone regola il volume sanguigno promuovendo il riassorbimento del sodio nei tubuli distali del rene con escrezione di potassio e ritenzione del sodio. L aumento cronico di produzione di aldosterone provoca ipertensione. La misurazione dei livelli plasmatici di aldosterone e di renina viene utilizzata per differenziare l iperaldosteronismo primario da quello secondario. Condizione Aldosterone nel siero Renina plasmatica Iperaldosteronismo primario Elevato Basso Iperaldosteronismo secondario Elevato Elevato La misura dei livelli di aldosterone insieme alla soppressione selettiva o ai test di stimolo, possono essere utilizzati per differenziare ulteriormente l iperaldosteronismo primario in due sottotipi: Iperaldolsteronismo primario provocato da un adenoma in una o in entrambe le surrenali. Iperaldolsteronismo primario provocato da un iperplasia delle surrenali. Questa differenziazione è di vitale importanza nel trattamento della malattia. Gli adenomi surrenalici rispondono bene alla chirurgia, mentre l perplasia delle surrenali risponde meglio alla terapia emonizzata. Il dosaggio dell aldosterone con un metodo preciso e accurato come questo metodo immunoenzimatico può essere importante, insieme ad altri esami di laboratorio, nella diagnosi differenziale dell ipertensione. 4 PRECAUZIONI PER L USO 1. Gli utilizzatori devono prendere attenta visione di questo protocollo per poter utilizzare con successo il kit. Si ottengono risultati corretti solo attenendosi strettamente alle istruzioni fornite. 2. Inserire in ogni esperimento sieri di controllo o pool di sieri a livello basso ed elevato per verificare la correttezza dei risultati. 3. Quando richiesto utilizzare acqua emonizzata o distillata per la diluizione o la ricostituzione dei reattivi. 4. Indossare sempre guanti monouso quando si manipolano reattivi e campioni. 5. Prima dell uso portare a temperatura ambiente reattivi e campioni e agitarli con cura. Evitare di sottoporre a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento reattivi e campioni. 6. Inserire la curva standard in ogni dosaggio. 7. Inserire il controllo in ogni dosaggio; il valore del controllo deve essere compreso nei limiti indicati dal produttore. 8. Valori del controllo esterni ai limiti indicati possono essere provocati da tecniche procedurali improprie, imprecisione nelle fasi di pipettamento, lavaggi incompleti e conservazione errata dei reattivi. 9. La presenza di bollicine nei pozzetti può modificare le densità ottiche (OD) di standard, controlli e campioni; prima della lettura agitare brevemente la micropiastra per allontanare eventuali bollicine. 10. Il substrato (TMB) è sensibile alla luce; se correttamente conservato deve essere incolore. In caso di contaminazione o di instabilità si sviluppa un colore blu; in questo caso il substrato non deve essere utilizzato. 11. Per la dispensazione di substrato e soluzione di stop non utilizzare pipette con parti di metallo che potrebbero venire a contatto con i liquidi. 12. Cambiare sempre il puntale della micropipetta per ogni reattivo, campione, standard o controllo da dispensare. 13. Non reattivi di lotto diverso e non utilizzarli oltre la data di scadenza riportata sulle rispettive etichette. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 10

12 Aldosterone ELISA HZ I reattivi contenuti nel kit devono essere considerati materiale pericoloso ed eliminati secondo le normative esistenti. 5 LIMITI DEL METODO 1. Tutti i reattivi contenuti nel kit sono tarati per il dosaggio diretto dell aldosterone in siero, plasma e urine umani. Il kit non è tarato per la determinazione dell aldosterone in saliva o in altri campioni di origine umana o animale. 2. Non utilizzare campioni fortemente emolizzati, lipemici o itterici o non conservati come consigliato. 3. Campioni o sieri di controllo contenenti sodio azide o thimerosal non possono essere dosati con questo kit, in quanto fornirebbero risultati errati. 4. Utilizzare lo Standard 0 per diluire campioni di siero elevati e il diluente per le urine per diluire urine ad elevata concentrazione di aldosterone. L uso di diluenti diversi può fornire risultati errati. 5. Non utilizzare i risultati ottenuti con questo dosaggio per formulare una diagnosi clinica. Infatti, soggetti esposti ad animali o a prodotti derivati da animali possono sviluppare anticorpi emonizzat che interferiscono nel dosaggio. Ogni diagnosi clinica deve tenere conto di tutti i dati disponibili sul paziente; se si sospettano falsi risultati considerare le pregresse esposizioni ad animali o a prodotti derivati da animali. 6 PRECAUZIONI PER L USO 6.1 MATERIALE BIOLOGICO POTENZIALMENTE PERICOLOSO Il siero umano utilizzato per la preparazione di standard e controlli è stato dosato e trovato non reattivo per l antigene di superficie del virus dell epatite B e trovato negativo per la presenza di anticorpi contro il virus dell epatite C e anti HIV. Non sono disponibili metodi in grado di offrire la certezza assoluta che questi o altri agenti infettivi siano assenti. Manipolare questi reattivi e i campioni dei pazienti come potenziali fonti di infezione. 6.2 PRODOTTI CHIMICI PERICOLOSI Evitare il contatto con reattivi contenenti TMB, perossido di idrogeno e acido solforico. In caso di contatto con questi reattivi, lavare abbondantemente con acqua la zona colpita. Il TMB è un sospetto agente cancerogeno. 7 RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero: per li dosaggio in duplicato sono necessari 200 µl di siero. Prelevare 45 ml di sangue periferico, trasferirli in una provetta senza anticoagulante e lasciar coagulare. Centrifugare e trasferire il siero. I campioni possono essere conservati fino a 24 ore a 28 C o, suddivisi in aliquote, a 10 C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. Evitare ripetuti cicli di congelamento scongelamento dei campioni. Plasma: per li dosaggio in duplicato sono necessari 200 µl di siero. Prelevare 45 ml di sangue periferico, trasferirli in una provetta EDTA. I campioni possono essere conservati fino a 24 ore a 28 C o, suddivisi in aliquote, a 10 C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. Urine: per li dosaggio in duplicato sono necessari 200 µl di urine. Raccogliere le urine delle 24 ore in un contenitore adatto. I campioni possono essere conservati fino a 24 ore a 28 C o, suddivisi in aliquote, a 20 C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. Manipolare i campioni biologici come possibili fonti di infezione. 7.1 PRETRATTAMENTO DEI CAMPIONI Siero e plasma: non è necessario il pre trattamento dei campioni. Urine: prima dell uso, diluire i campioni di urine 1:50 con il diluente. Esempio: aggiungere 20 μl di urine a 1 ml di diluente per le urine. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 11

13 Aldosterone ELISA HZ REATTIVI E MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO 1. Micropipette di precisione per dispensare 50, 100, 150 e 300 μl 2. Puntali monouso 3. Acqua distillata o emonizzata 4. Agitatore per micropiastre 5. Lettore per micropiastre con filtro per 450nm e linearità di 3,0 OD o superiore* (vedi paragrafo 10). 6. Diluente per le urine Necessario per la diluizione delle urine prima del dosaggio. Disponibile a richiesta. REF ALD45011 (20ml) 9 REATTIVI FORNITI 1. Aldosterone Antibody Coated Microwell PlateBreak Apart Wells (Micropiastra con pozzetti separabili sensibilizzata con anticorpo anti aldosterone da coniglio ) Pronta per l uso. Contenuto: Una micropiastra da 96 pozzetti (12x8) sensibilizzata con anticorpo policlonale in una busta richiudibile con disseccante. Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. 2. AldosteroneHorse Radish Peroxidase (HRP) Conjugate Concentrate 50X (Coniugato di rafano (HRP) aldosterone; concentrato Preparazione necessaria) Contenuto: Coniugato aldosteronehrp in tampone proteico con un conservante privo di mercurio. Volume: 300 μl/flacone Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. Preparazione: Diluire 1:50 con tampone (assay buffer) prima dell uso (ed es. 40 μl di HRP con 2 ml di tampone). Se si utilizza l intera piastra, diluire 240 μl di HRP con 12 ml di tampone. Scartare il reattivo diluito avanzato. 3. Aldosterone Standards (Standard di aldosterone ) Pronti per l uso. Contenuto: Sei flaconi contenenti aldosterone in tampone con siero umano e un conservante privo di mercurio. Preparati aggiungendo quantità definite di aldosterone ad un siero free. *Le concentrazioni degli standard riportate qui sotto sono approssimate. Fare riferimento alle concentrazioni riportate sull etichetta di ciascun flacone. Standard Concentrazione Volume/Flacone Standard 0 0 pg/ml 2.0 ml Standard 1 15 pg/ml 0.6 ml Standard 2 50 pg/ml 0.6 ml Standard pg/ml 0.6 ml Standard pg/ml 0.6 ml Standard pg/ml 0.6 ml Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta per gli standard non ancora utilizzati. Dopo l apertura gli standard possono essere conservati 14 giorni a 28 C o, suddivisi in aliquote, a 20 C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. Evitare ripetuti cicli di congelamento scongelamento degli standard. 4. Control (Controllo) Pronto per l uso. Contenuto: Un flacone contenente aldosterone in tampone con siero umano e un conservante privo di mercurio. Preparato aggiungendo una quantità definita di aldosterone ad un siero free. Il valore atteso con i limiti di accettabilità è riportato sull etichetta del flacone. Volume: 0,6 ml/flacone Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta per il controllo non ancora utilizzato. Dopo l apertura il controllo può essere conservato 14 giorni a 28 C o, suddiviso in aliquote, a 20 C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. Evitare ripetuti cicli di congelamento scongelamento del controllo. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 12

14 Aldosterone ELISA HZ Wash Buffer Concentrate (Tampone per il lavaggio concentrato 10X) Contenuto: Un flacone contenente tampone con un detergente non ionico e un conservante privo di mercurio. Volume: 50 ml/flacone Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. Preparazione: Prima dell uso diluire 1:10 con acqua distillata o emonizzata. Se si utilizza l intera piastra, diluire 50 ml di tampone di lavaggio concentrato con 450 ml di acqua distillata o emonizzata. 6. Assay Buffer (Tampone) Pronto per l uso. Contenuto: Un flacone contenente un tampone proteico e un conservante privo di mercurio. Volume: 15 ml/flacone Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. 7. TMB Substrate (Substrato) Pronto per l uso. Contenuto: Un flacone contenente tetrametilbenzidina e perossido di idrogeno in tampone privo di DMF o DMSO. Volume: 16 ml/flacone Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. 8. Stop Solution (Soluzione di stop) Pronta per l uso. Contenuto: Un flacone contenente acido solforico 1M. Volume: 6 ml/flacone Conservazione: 28 C Stabilità: 12 mesi o fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. 10 PRINCIPIO DEL METODO 10.1 Pre trattamento dei campioni Siero e plasma: nessuno. Urine: prima dell uso diluire i campioni 1:50 con il diluente delle urine. Prima dell uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente. Dosare standard, controlli e campioni in duplicato. Eseguire il dosaggio completando tutti i passaggi senza interruzioni Attuazione del test 1. Preparare le soluzioni di lavoro del coniugato aldosteronehrp e del tampone di lavaggio. Diluire come descritto i campioni di urine. 2. Togliere dalla busta il numero di strip necessario per il dosaggio. Richiudere la busta e conservare le strip inutilizzate a 28 C. 3. Pipettare in duplicato 50 μl di standard, controlli e campioni (siero e urine diluite) nei rispettivi pozzetti. 4. Pipettare 100 μl della soluzione di lavoro del coniugato in tutti i pozzetti, utilizzando preferibilmente una pipetta multicanale. 5. Incubare su un agitatore per micropiastre (a 200 rpm) 1 ora a temperatura ambiente. 6. Lavare 3 volte i pozzetti con 300 μl di tampone di lavaggio diluito. Aspirare con cura il liquido di lavaggio e lasciare la micropiastra capovolta su carta assorbente per eliminare le gocce residue. Si raccomanda l uso di un lavatore per micropiastre. 7. Pipettare 150 μl di TMB in ciascun pozzetto. Prendere nota della sequenza di pipettamento e del tempo utilizzato. 8. Incubare su un agitatore per micropiastre 1520 minuti a temperatura ambiente (o fino al momento in cui lo standard A presenti la colorazione blu corrispondente alle OD desiderate). 9. Pipettare 50 μl di soluzione di stop in tutti i pozzetti ripetendo la sequenza e i tempi del punto Leggere le assorbanze su un lettore per micropiastre con filtro a 450 nm entro 20 minuti dall aggiunta della soluzione di stop. * Se le OD superano il limite superiore di linearità dello strumento o non è disponibile un filtro di 450 nm, è possibile utilizzare un filtro da 405 o 415 nm. Si otterrano densità ottiche inferiori senza variazioni dei risultati per pazienti e controlli. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 13

15 OD 450nm Aldosterone ELISA HZ CALCOLO DEI RISULTATI 1. Calcolare la media delle densità ottiche per ogni duplicato degli standard. 2. Tracciare una curva di taratura su carta semilog ponendo in ordinata (asse delle Y) la media delle densità ottiche per ciascuno standard e in ascissa (asse delle X) le rispettive concentrazioni. Se si dispone di un programma computerizzato per l elaborazione dei dati, utilizzare l interpolazione a 4 parametri. 3. Calcolare la media delle densità ottiche per ogni duplicato dei campioni. 4. Ricavare le concentrazioni per i campioni di siero e plasma direttamente dalla curva standard. 5. Per calcolare le concentrazioni dei campioni di urine procedere come segue: moltiplicare il valore ricavato dalla curva standard per 50 (fattore di diluizione delle urine); moltiplicare il risultato per il volume delle urine delle 24 ore (in litri), dividere questo risultato per 1000 per ottenere la concentrazione di aldosterone nelle urine in μg/24 ore. 6. Diluire con lo standard A, fino ad un massimo di 1:8, i campioni di siero o plasma con concentrazione di aldosterone superiore a 1000 pg/ml e ridosarli. Moltiplicare i risultati ottenuti per il rispettivo fattore di diluizione. Diluire 1+ 1 con il diluente per le urine, a partire dalle urine diluite 1:50, i campioni di urine con densità ottiche inferiori a quelle dello standard 1000 pg/ml. Moltiplicare per 2 il risultato finale. DATI TIPICI OTTENUTI CON IL KIT Standard OD 1 OD 2 Media OD Valore (pg/ml) 0 2,267 2,197 2, ,102 2,037 2, ,848 1,836 1, ,210 1,190 1, ,763 0,788 0, ,542 0,550 0, Campione 1,522 1,493 1, CURVA STANDARD TIPICA 2,5 2 1,5 1 0, Aldosterone (pg/ml) La curva è riportata solo come esempio e non deve essere utilizzata per calcolare i risultati dei campioni. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 14

16 Aldosterone ELISA HZ CARATTERISTICHE DEL METODO 12.1 SENSIBILITA La dose minima rilevabile è stata calcolata per interpolazione sulla curva standard della media delle OD di 10 replicati dello standard A meno 2 SD. La sensibilità del kit Aldosterone ELISA è 10,0 pg/ml SPECIFICITA (CROSS REATTIVITA ) Sono stati dosati i seguenti composti per verificare la loro cross reattività con l anticorpo utilizzato nel kit Aldosterone ELISA. L aldosterone ha una cross reazione del 100%. Steroide Cross reattività % Aldosterone Deossicorticosterone 1,1 I seguenti steroidi hanno mostrato una cross reattività < 0,001%: Androsterone, Cortisone, 11Deossicortisolo, 21Deossicortisolo, Diidrotestosterone, Estradiolo, Estriolo, Estrone e Testosterone PRECISIONE INTRASAGGIO Tre campioni sono stati dosati 10 volte nello stesso esperimento con i seguenti risultati ( espressi in pg/ml): Campione Media SD CV% 1 18,79 1,96 10, ,67 5,26 4, ,22 27,44 5, PRECISIONE INTERSAGGIO Tre campioni sono stati dosati 10 volte durante 4 settimane con i seguenti risultati ( espressi in pg/ml): Campione Media SD CV% 1 18,36 1,72 9, ,52 12,50 9, ,77 48,55 9,6 Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 15

17 Aldosterone ELISA HZ RECUPERO A tre campioni di siero sono state aggiunte quantità definite di aldosterone; il dosaggio ha dato i seguenti risultati ( espressi in pg/ml): Campione Osservato Atteso Recupero% 1 tal quale + 51, , ,80 45,30 119,1 143,8 227,5 96,3 147,2 249,1 123,7 97,6 91,3 2 tal quale + 51, , ,80 130,0 209,4 243,1 307,5 181,0 231,9 333,8 115,7 104,8 92,1 3 tal quale + 51, , ,80 208,4 289,3 341,6 460,1 259,4 310,3 412,2 111,5 110,1 111, LINEARITA Due campioni di siero sono stati diluiti con lo Standard 0; il dosaggio ha dato i seguenti risultati ( espressi in pg/ml): Campione Osservato Atteso Recupero% 1 1:2 1:4 1:8 395,1 198,6 80,7 44,2 197,6 98,8 49,5 100,5 81,7 89,5 2 1:2 1:4 1:8 414,2 206,7 103,9 56,7 207,1 103,6 51,8 99,8 100,3 109,5 13 VALORI ATTESISIERO / PLASMA Come per qualsiasi altro dosaggio ciascun laboratorio deve stabilire i propri limiti di normalità. Gruppo Range (pg/ml) Normal Salt Intake, Standing Normal Salt Intake, Recumbent VALORI ATTESIURINE Come per qualsiasi altro dosaggio ciascun laboratorio deve stabilire i propri limiti di normalità. Gruppo Range (μg/24 hr) Libero accesso al sale, soggetti seduti. 519 Wilson, J.D. and Foster, D.W. Williams Textbook of Endocrinology 8 th Edition. W.B. Saunders Company, London. p 582, Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 16

18 1 FINALIDAD Aldosterone ELISA HZ4128 Este ensayo está diseñado para la determinación cuantitativa directa de Aldosterona por inmunoensayo enzimático en suero, plasma y orina humanos (directo). Solamente para uso en diagnóstico in vitro. 2 FUNDAMENTO DEL TEST El fundamento de este test de inmunoensayo enzimático se basa en el método de unión competitiva. La competencia por un número limitado sitios de unión de anticuerpo en una placa multipocillo ocurre entre un antígeno no marcado (presente en los estándares, controles y muestras de pacientes) y un antígeno marcado enzimáticamente (conjugado). El lavado y decantado elimina los componentes no unidos. Después del paso de lavado, se añade el sustrato del enzima. La reacción enzimática termina por la adición de la solución de parada. La absorbancia se mide en un lector de microplacas. La intensidad del color desarrollado es inversamente proporcional a la concentración de aldosterona en la muestra. Se utiliza un conjunto de estándares para la representación gráfica de una curva estándar a partir de la cual se puede leer directamente la cantidad de Aldosterona en las muestras de pacientes y controles. 3 APLICACIONES CLÍNICAS La aldosterona es un potente corticoide mineral cuya síntesis y liberación está controlada por el sistema reninaangiotensina del cuerpo. La aldosterona promueve la reabsorción del sodio en los túmulos distales del riñón produciéndose así la secreción de potasio junto con la retención de sodio, que controla el volumen de sangre circulante. La sobreproducción crónica de aldosterona conduce a hipertensión. La medida de los niveles de aldosterona en el suero junto con los niveles plasmáticos de renina pueden utilizarse para diferenciar entre aldosterinismo primario y secundario. Condición Aldosterona en suero Renina plasmática Aldosterinismo Primario Alta Baja Aldosterinismo Secundario Alta Alta Para diferenciar dos tipos básicos de aldosterinismo puede utilizarse la medida de aldosterona junto con tests de supresión selectiva y estimulación: Aldosterinismo primario causado por un adenoma de una o ambas glándulas adrenales. Aldosterinismo primario causado por hiperplasia adrenal. Esta diferenciación es vital en el tratamiento y evolución de la enfermedad. Los adenomas adrenales responden bien a la cirugía mientras que la enfermedad hiperplásica de las adrenales normalmente responde mejor médicamente. En resumen, la medida precisa y exacta de la aldosterona en el suero por inmunoensayo enzimático puede ser un complemento a la batería de ensayos diagnósticos para la diagnosis diferencial de la enfermedad hipertensiva. 4 PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO 1. Los usuarios deben poseer un conocimiento profundo de este protocolo para el uso exitoso de este kit. Sólo se conseguirá una ejecución fiable si se siguen estricta y cuidadosamente las instrucciones de este kit. 2. Los controles y los conjuntos de suero deben incluirse en cada ensayo en nivel alto y bajo para evaluar la fiabilidad de los resultados. 3. Utilizar agua desionizada o destilada cuando se especifica el uso de agua para diluir o para reconstituir. 4. Deben utilizarse guantes cuando se manejen los reactivos del kit y las muestras humanas para reducir la exposición a sustancias potencialmente dañinas. 5. Todos los reactivos del kit y las muestras han de alcanzar la temperatura ambiente y mezclarse cuidadosamente pero perfectamente antes de utilizarse. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas de los reactivos y las muestras. 6. Ha de establecerse una curva estándar para cada ensayo. 7. El control ha de incluirse en cada ensayo y debe estar dentro de los límites de confianza establecidos. 8. El uso de técnicas de procedimiento incorrectas como: pipeteado impreciso, lavado incompleto así como un almacenamiento incorrecto de los reactivos ha de indicarse cunado los valores del ensayo para el control no reflejan los rangos establecidos. 9. Cuando se lee la microplaca, la presencia de burbujas en los pocillos afectará a los valores de la densidad óptica (ODs). Eliminar cuidadosamente cualquier burbuja antes de leer la placa. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 17

19 Aldosterone ELISA HZ La solución sustrato (TMB) es sensible a la luz y debe permanecer incolora si se almacena correctamente. Contaminación o inestabilidad pueden verse indicados por el desarrollo de un color azul, en este caso no debe utilizarse. 11. No utilizar pipetas en las que los líquidos entren en contacto con partes metálicas cuando se dispensan las soluciones sustrato y de parada, 12. Para prevenir la contaminación de los reactivos, utilizar puntas dispensables de pipetas nuevas para dispensar cada reactivo, muestra, estándar y control. 13. No mezclar varios números de lotes de los componentes en un ensayo y no utilizar ningún componente caducado (fecha impresa en la etiqueta). 14. Los reactivos del kit han de considerarse como basura peligrosa y ser eliminados de acuerdo a las directivas nacionales. 5 LIMITACIONES 1. Todos los reactivos del kit están calibrados para la determinación directa de aldosterona en el suero y plasma humano y en la orina. El kit no está calibrado para la determinación de Aldosterona en saliva u otros especimenes de origen humano o animal. 2. No utilizar suero extremadamente hemolizado, extremadamente lipémico, ictérico o almacenado incorrectamente. 3. Cualquier muestra o control de suero que contenga azida o timerosal no es compatible con este suero, ya que pueden llevar a resultados falsos. 4. Sólo el estándar 0 puede utilizarse para diluir cualquier muestra de suero alta. Solamente el diluyente de orina puede utilizarse para diluir muestras de orina altas. El uso de cualquier otro reactivo puede conducir a resultados falsos. 5. Los resultados obtenidos con este kit no deben utilizarse nunca como la única base para el diagnóstico clínico. Por ejemplo, la existencia de anticuerpos heterofílicos en pacientes regularmente expuestos a animales o a productos que tengan el potencial de provocar interferencias en los tests inmunológicos. Consecuentemente, el diagnóstico clínico debe incluir todos los aspectos de los antecedentes del paciente incluida la frecuencia de exposición a animales/productos si se sospecha que los resultados son falsos. 6 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS MATERIAL POTENCIALMENTE BIOPELIGROSO El suero humano que ha de ser usado en la preparación de los estándares y los controles ha sido analizado y encontrado no reactivo para el antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B y también ensayado y encontrado negativo para la presencia de anticuerpos para HCV y virus de la inmunodeficiencia (VIH). Sin embargo, ningún método de análisis puede ofrecer una seguridad absoluta de la ausencia de virus VIH, HCV y Hepatitis. Los reactivos han de considerarse como potencialmente biopeligrosos y manejados con las mismas precauciones aplicadas a cualquier espécimen sanguíneo. SUSTANCIAS QUÍMICAS PELIGROSAS Evitar contacto con los reactivos que contengan TMB, peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico. Si se produce el contacto con cualquiera de estos reactivos, lavar con abundante agua. Se sospecha que el TMB es carcinogénico. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 18

20 Aldosterone ELISA HZ RECOGIDA DE MUESTRAS Y ALMACENAMIENTO Suero: Se requieren aproximadamente 0.2 ml de suero para la determinación por duplicado. Recoger 45 ml de sangre en un tubo marcado correctamente y permitir la coagulación. Centrifugar y remover cuidadosamente la capa de suero. Almacenar a 4 C hasta 24 horas o a 10 C o menos si el análisis se realizará otro día mas tarde. Plasma: Se requieren aproximadamente 0.2 ml de suero para la determinación por duplicado. Recoger 45 ml de sangre en un tubo EDTA Almacenar a 4 C hasta 24 horas o a 10 C o menos si el análisis se realizará otro día mas tarde. Orina: Se requieren aproximadamente 0.2 ml de orina para la determinación por duplicado. Recoger orina de 24 h en un recipiente de recogida de muestra. Almacenar a 4 C hasta 24 horas o a 10 C o menos si el análisis se realizará otro día mas tarde. Considerar todas las muestras humanas como materiales posiblemente biopeligrosos y tomar las precauciones apropiadas durante su manejo. 7.1 PRETRATAMIENTO DE LOS ESPECÍMENES Suero y plasma: Este ensayo es un sistema directo; no se requiere pretratamiento. Orina: Diluir las muestras de orina 1:50 en diluyente de orina antes de utilizar. Ejemplo: Para 1ml de diluyente de orina añadir 20 μl de muestra de orina. 8 REACTIVOS Y EQUIPAMIENTO REQUERIDO PERO NO PROVISTO 1. Pipetas de precisión para dispensar 50, 100, 150 y 300 μl. 2. Puntas de pipeta desechables. 3. Agua destilada o desionizada. 4. Agitador de placas. 5. Lector de microplacas con un conjunto de filtros a 450 nm y un límite máximo de OD de 3.0 o mayor* (ver procedimiento de ensayo, paso 10). 6. Diluyente de orina Requerido si las muestras de orina han de ensayarse. Utilizar para diluir los especimenes de orina antes de ensayar. Disponible en cualquier cantidad. REF ALD45011 (20ml). 9 REACTIVOS PROVISTOS 1. Coated Microwell Plate Placa mulitipocillospocillos separable recubierta con anticuerpo de conejo antialdosterona Lista para usar. Contenido: Una placa con 96 pocillos (12x8) recubierta con anticuerpo policlonal en una bolsa resellable con desecante. Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C; Estabilidad: 12 meses o hasta cuando se indique en la etiqueta. 2. (HRP) Conjugate Concentrate Conjugado AldosteronaPeroxidasa de Rábano (HRP) concentrado 50X Contenido: conjugado AldosteronaHRP en un tampón basado en proteína con un conservante no mercúrico. Volumen 300 μl/vial Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C; Estabilidad: 12 meses hasta cuando se indique en la etiqueta. Preparación: Diluir 1:50 en tampón de ensayo antes de utilizar (ej. 40 μl de HRP en 2 ml de tampón de ensayo). Si se va a utilizar toda la placa diluir 240 μl de HRP en 12ml de tampón de ensayo. Descartar lo que sobre. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 19

21 Aldosterone ELISA HZ Standards Estándares de Aldosterona Listos para usar. Contenido: Seis viales que contienen aldosterona en un tampón basado en suero humano con un conservante no mercúrico. Preparar mediante enriquecido del suero con una cantidad definida de aldosterona. *Debajo se muestran concentraciones aproximadas, por favor referir a las etiquetas de los viales para conocer las concentraciones exactas. Estándar Concentración Volumen/Vial Estándar 0 0 pg/ml 2.0 ml Estándar 1 15 pg/ml 0.6 ml Estándar 2 50 pg/ml 0.6 ml Estándar pg/ml 0.6 ml Estándar pg/ml 0.6 ml Estándar pg/ml 0.6 ml Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C. Estabilidad: 12 meses en viales sin abrir o cuando indique la etiqueta. Una vez abiertos, los estándares han de ser utilizados en un plazo de 14 días o alicuotados y almacenados congelados Evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación. 4. Control Listo para usar. Contenido: Un vial que contiene aldosterona en un tampón basado en suero humano con un conservante no mercúrico. Preparado mediante tampón de enriquecido con una cantidad definida de aldosterona. Referirse al valor esperado y el rango aceptable indicado en la etiqueta. Volúmen: 0.6 ml/vial; Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C. Estabilidad: 12 meses en viales sin abrir o cuando indique la etiqueta. Una vez abierto, el control ha de ser utilizado en un plazo de 14 días o alicuotado y almacenado congelado. Evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación. 5. Wash Buffer Concentrate Tampón de lavado concentrado 10X Contenido: Una botella que contiene tampón con un detergente no iónico y un conservante no mercúrico. Volumen: 50 ml/botella Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C; Estabilidad: 12 meses en viales sin abrir o cuando indique la etiqueta. Preparación: Diluir 1:10 en agua destilada o desionizada antes de usar. Si se va ha utilizar toda la placa, diluir 50 ml del tampón de lavado concentrado en 450 ml de agua. 6. Assay Buffer Tampón den ensayo Listo para usar. Contenido: Un vial conteniendo tampón basado en proteína y un conservante no mercúrico. Volumen: 15 ml/vial Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C; Estabilidad: 12 meses en viales sin abrir o cuando indique la etiqueta. 7. TMB Substrate Sustrato TMB Listo para usar. Contenido: Una botella con tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno en un tampón sin DMF o DMSO. Volumen: 16 ml/botella Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C; Estabilidad: 12 meses en viales sin abrir o cuando indique la etiqueta. 8. Stop Solution Solución de parada Lista para usar Contenido: Un vial que contiene ácido sulfúrico 1M Volumen: 6 ml/vial Almacenamiento: Refrigerado a 2 8 C; Estabilidad: 12 meses en viales sin abrir o cuando indique la etiqueta. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 20

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