NOVA Lite Monkey Oesophagus IFA Kit/Slides (sólo anticuerpos ante la piel)
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- Veronica Rico de la Cruz
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1 NOVA Lite Monkey Oesophagus IFA Kit/Slides (sólo anticuerpos ante la piel) Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: , Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Estas secciones de esófago de mono se utilizan como substrato para el screening de autoanticuerpos ante los antígenos intraepidérmicos o las áreas de la membrana basal en el suero humano, como auxiliar en el diagnóstico respectivamente del pénfigo buloso y del penfigoide buloso. Las secciones podrían no contener tejido endomisial y no deberían utilizarse por tanto para la determinación de los anticuerpos antiendomisio. Sumario y Explicación de la prueba Los anticuerpos IgG intraepidérmicos, que caracterizan diferentes formas clínicas de pénfigo, reaccionan con los antígenos presentes en la superficie celular de los queratinocitos epidérmicos. Si el resultado del ensayo es positivo, se encuentra un patrón típico de enrejado de alambre. La deposición tisutal de inmunoglobulinas ocurre en prácticamente todos los casos. En las enfermedades bulosas se recomienda analizar tanto el suero como los tejidos del paciente. Los anticuerpos dirigidos contra las áreas de la membrana basal se encuentran tradicionalmente en el penfigoide buloso. En esta patología, la biopsia directa revela una deposición lineal de IgG y C3 a lo largo de la unión dermoepidérmica. Estos autoanticuerpos están presentes normalmente, aunque no siempre, en el suero de los pacientes afectados por la patología. Sin embargo, el título anticorporal no se córrela con el estado patológico y durante la remisión clínica se pueden todavía encontrar anticuerpos tanto en los tejidos como en el suero. Con el kit se suministra un conjugado de anti-igg humanas (H&L) FITC (adsorbido con tejido de mono) para determinar ambos autoanticuerpos. Procedimiento de trabajo Se utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta 1 en la que las muestras de los pacientes y los controles adecuados se incuban en los portaobjetos con substrato. Los anticuerpos no específicos se eliminan mediante lavado y, a continuación, se aplica un conjugado apto etiquetado con fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediante lavado. Los portaobjetos se examinan en un microscopio de fluorescencia. Las muestras positivas producen una fluorescencia de color verde brillante que corresponde a las áreas de la sección en las que se ha unido el autoanticuerpo. Reactivos 1. Cortes de esófago de mono en portas de 5 ó 10 pocillos Sólo kits: 2. Suero de control positivo (derivado de suero humano) que da el patrón del pénfigo de enrejado de alambre en secciones de esófago de mono. Prediluido, listo para usar. 3. Suero de control positivo (derivado de suero humano) que da el patrón de la membrana basal del penfigoide en secciones de esófago de mono. Prediluido, listo para usar. 4. Suero de control negativo, universalmente negativo para todos los autoanticuerpos. Prediluido, listo para usar. 5. Tampón PBS II, suministrado en solución líquida concentrada 40x. 6. Antisuero de oveja anti-igg humanas (H&L) purificado por afinidad (adsorbido con tejido de mono) conjugado con fluoresceína. Prediluido, listo para usar. 7. Azul de Evans al 1% (coloración de contraste opcional). 8. Papeles absorbentes. 9. Solución de montaje, que contiene un agente anti-debilitamiento (DABCO, 1, 4 diazabiciclo [2.2.2] octano). 10. Cubreobjetos. Advertencias/ Precauciones El material de partida para la elaboración de los calibradores y controles proviene de sangre humana (solo los kits). Cada una de las muestras han sido examinadas y libres de anticuerpos del virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (HIV 1 & 2), Hepatitis C así como antígenos superficiales de Hepatitis B (HBsAG). No obstante, hasta la fecha no existen métodos seguros para la exclusión de estos agentes infecciosos ni de otros. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Algunos kits contienen azida sódica 0,09% y deben tratarse según las medidas de seguridad correspondientes. Debe evitarse tanto la ingesta como el contacto con la piel y las mucosas. En caso de contacto, aclarar con abundante agua y consultar a un médico. La azida sódica puede formar azidas metálicas explosivas en contacto prolongado con tubos de plomo o cobre. Tras la eliminación aclarar con gran cantidad de agua con el fin de evitar depósitos de azida. Esta prueba solo deberá efectuarse para el propósito indicado y por personal de laboratorio adecuadamente instruido. 1
2 Condiciones de almacenamiento El kit sin estrenar es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el envase almacenándolo entre 2 y 8ºC. NO CONGELAR! Tras la extracción de los portas de su embalaje deberán ser empleados inmediatamente. El tampón PBS II diluido puede conservarse durante un mes a 2-8 C. Todos los reactivos deben almacenarse entre 2 y 8ºC. Recolección de Muestras Las muestras de suero se deben recolectar mediante extracción intravenosa y dejar coagular de forma natural. Separar rápidamente el suero del coagulo con el fin de evitar hemólisis. El suero puede conservarse a 2-8 C durante un máximo de 7 días antes del ensayo, o para periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20 C, o temperatura inferior. 4 Evitar repetidas congelaciones y descongelaciones. No utilizar muestras de suero contaminado microbiológicamente o con partículas, ni tampoco sueros hemolíticos o lipémicos ya que puede darse un título inferior o patrones de fluorescencia poco claros. Procedimiento Materiales Suministrados (kits) Monkey Oesophagus (skin abs) Slide (5-well) (portaobjetos de 5 pocillos con esófago de mono (para anticuerpos cutáneos) x 1mL Pemphigus Positive Control (Control positivo al pénfigo) prediluido x 1mL Pemphigoid Positive Control (Control positivo al penfigoide) prediluido x 1mL IFA System Negative Control (Control Negativo del sistema IFA) prediluido x 7mL FITC IgG (H&L) (monkey adsorbed) Conjugate (Conjugado IgG (H&L) FITC, purificado por afinidad, adsorbido con tejido de mono) prediluido x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans al 1%) 7. 2 x 25mL PBS II Concentrate (x40) (concentrado de PBS II) x x 3mL Mounting Medium (Solución de montaje) x Blotters (Papeles absorbentes) x Coverslips (Cubreobjetos) folleto de instrucciones Monkey Oesophagus (skin abs) Slide (10-well) (portaobjetos de 10 pocillos con esófago de mono (para anticuerpos cutáneos) x 1mL Pemphigus Positive Control (Control positivo al pénfigo) prediluido x 1mL Pemphigoid Positive Control (Control positivo al penfigoide) prediluido x 1mL IFA System Negative Control (Control Negativo del sistema IFA) prediluido x 15mL FITC IgG (H&L) (monkey adsorbed) Conjugate (Conjugado IgG (H&L) FITC, purificado por afinidad, adsorbido con tejido de mono) prediluido x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans al 1%) 7. 2 x 25mL PBS II Concentrate (x40) (concentrado de PBS II) x x 10mL Mounting Medium (Solución de montaje) x Blotters (Papeles absorbentes) x Coverslips (Cubreobjetos) folleto de instrucciones Material suministrado (portaobjetos) x Portaobjetos Esófago de mono (para anticuerpos cutáneos), 5 pocillos x Portaobjetos Esófago de mono (para anticuerpos cutáneos), 5 pocillos Material necesario no incluido Agua destilada o desionizada para diluir el concentrado de PBS II Recipientes para el PBS II Pipetas y tubos de reacción desechables Cámara húmeda para los pasos de incubación Microscopio de campo oscuro con filtros para una longitud de onda de excitación de 495nm y emisión de 515nm Botella de plástico para un prelavado con PBS II Otros componentes suministrables de INOVA Diagnostics: PBS II (508998), control negativo del sistema IFA (508186), control positivo pénfigo (504051), control positivo penfigoide (504055), conjugado FITC (H+L), adsorbido de mono (504011, ), Azul de Evans 1% (504049) y medio de montaje (508001, , ). Procedimiento del test Control de calidad Los controles negativos y positivos deben efectuarse cada vez que se dosifican las muestras. 1. Solución de montaje: sacar la solución de montaje de la nevera para llevarla a temperatura ambiente (18-28ºC) antes del uso. 2. PBS II concentrado: Diluya el PBS II con agua destilada o desionizada (1 parte de PBS II + 39 partes de agua destilada o desionizada) y mezcle. N.B. Diluya todo el PBS II contenido en el kit solamente si se prevé utilizarlo en el plazo de un mes. El PBS II se utiliza para diluir las muestras de los pacientes y como tampón de lavado. 3. Dilución de muestras de los pacientes Diluya las muestras 1/10 añadiendo 20µL de suero a 180µL de tampón PBS II. 4. Portaobjetos con substrato. Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente (18-28 C) antes de sacarlos del envase. Etiquete los portaobjetos correctamente, colóqueles en la cámara húmeda y añada una gota de control positivo y negativo en los respectivos pocillos. Añada 50µL de las muestras diluidas en los pocillos restantes. 2
3 5. Incubación de portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28 C). (El papel húmedo en el fondo de la cámara conservará la humedad). 6. Lavado con PBS II. Quitar los portaobjetos de la cámara húmeda y aclararlos brevemente con el PBS II en una botella de plástico a presión. No rociar directamente en los pocillos. Situar los portaobjetos en un rack y sumergirlos en el PBS II, luego agitar durante 5-10 minutos. 7. Adición de conjugado de fluoresceína. Elimine el exceso de PBS II y seque el contorno de los pocillos con papeles absorbentes suministrados. Vuelva a colocar los portaobjetos en la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado de fluoresceína. NO DEJE LOS POCILLOS DESCUBIERTOS DURANTE MÁS DE 15 SEGUNDOS. 8. Incubación de portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28 C) a oscuras. 9. Lavado con PBS II. Vuelva a lavar, tal como se describe en el paso Adición opcional de color de contraste. Añada 2-3 gotas de Azul de Evans al 1% por cada 100mL de PBS II antes de proceder a la inmersión de los portaobjetos. 11. Montaje con cubreobjetos. Quite uno a uno los portaobjetos de la solución PBS II de lavado. Seque rápidamente el contorno de los pocillos y añada una gota de solución de montaje en cada pocillo. Coloque con cuidado el portaobjeto en el cubreobjeto, evitando que se formen burbujas de aire, pero sin intentar eliminar las que se hayan formado. Elimine el exceso de solución de montaje del contorno del cubreobjeto. 12. Lectura de los portaobjetos con el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos pueden conservarse a 2-8 C a oscuras durante un máximo de 3 días, sin una pérdida significativa de fluorescencia. Resultados Control de calidad El control positivo al pénfigo debe mostrar un patrón de color verde brillante en la sustancia cementante intercelular del epitelio (aspecto de enrejado de alambre ). El control positivo al penfigoide debe mostrar un patrón de color verde brillante en la membrana basal. El control negativo debe mostrar una coloración verde oscura en todo el tejido, sin fluorescencia visible. Si los controles no resultan tal como se describe arriba, el ensayo debe considerarse no válido y debe repetirse. Interpretación de los resultados Véase la referencia 2 para un ejemplo fotográfico en color de este patrón. Los resultados se notifican como positivos o negativos. Positivo a los anticuerpos del pénfigo Coloración de la sustancia cementante intercelular del epitelio estratificado. Positivo a los anticuerpos del penfigoide Coloración del área de la membrana basal a lo largo de la unión dermoepidérmica. N.B.: Cada laboratorio debe establecer cuándo un resultado positivo se considera clínicamente significativo. Limitaciones del Procedimiento 1. La fuente luminosa, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia de diferentes marcas influirán en la sensibilidad del kit. Las prestaciones del microscopio dependen considerablemente de un mantenimiento correcto y, en particular, del centrado y de la sustitución de la lámpara de vapores de mercurio tras el periodo de tiempo aconsejado. 2. Los anticuerpos anti-núcleo (ANA), anti-mitocondria (AMA), anti-musculatura lisa (ASMA) o antimusculatura estriada pueden reaccionar con el substrato de esófago. La presencia de estos autoanticuerpos debe confirmarse en el substrato apropiado. 3. Este ensayo por sí mismo no permite formular un diagnóstico. Es necesario tomar en consideración todos los otros factores, incluida la historia clínica de los pacientes y otros resultados serológicos o de la biopsia. 4. Puesto que en los portaobjetos de 10 pocillos, los pocillos están colocados entre sí a breve distancia, es posible una contaminación cruzada de las muestras y de los controles. Tenga cuidado para que eso no ocurra, sobretodo en las fases de lavado. 5. La idoneidad para el uso del kit con reactivos IFA de otros fabricantes no se ha evaluado, pero el uso con estos reactivos no debe excluirse necesariamente. 6. Se puede observar una reactividad cruzada causada por anticuerpos anti-grupos sanguíneos A y B, puesto que la mucosa del esófago puede contener ciertos antígenos de grupos sanguíneos. 3 En algunos pacientes se puede observar un patrón de coloración muy similar a él de los anticuerpos del pénfigo, mientras que son los capilares de la musculatura del esófago que reaccionan. Los portaobjetos comercializados por separado se clasifican como reactivos específicos para los analitos. Salvo que se trate de componentes del kit, las características analíticas y de rendimiento no están establecidas. Valores Esperados Los portaobjetos con esófago de mono se utilizaron para analizar algunos pacientes afectados por pénfigo y penfigoide además de 20 donantes de sangre aleatorios. Los resultados a continuación: Número de positivos Grupos de pacientes Número Coloración intercelular Coloración de la membrana basal Pénfigo Penfigoide Normales
4 Características específicas de la operación Se llevó a cabo un estudio comparativo en 25 muestras de sueros (17 clínicas y 8 normales) utilizando este kit y un método de referencia disponible en el mercado, para muestras positivas al pénfigo y al penfigoide. En general, la correlación entre los kits era buena. 10 de las 13 muestras ensayadas resultaron positivas al pénfigo en ambos kits. Dos de las muestras discordantes resultaron positivas límite con el kit y negativas con el kit de referencia. Para el penfigoide, todas las cuatro muestras positivas ensayadas dieron el mismo resultado, aunque con una coloración apenas más débil en el kit alternativo. Las ochos muestras normales ensayadas resultaron negativas en ambos kits. Resumen del procedimiento 1. Diluir el PBS II con agua destilada o desionizada. 2. Diluir las muestras 1/10 con PBS II. 3. Dejar que los portas alcancen temperatura ambiente (18-28 C). 4. Aplicar 50µL de controles positivos y negativos así como suero diluido en los pocillos correspondientes. 5. Incubar en cámara húmeda durante 30 minutos. 6. Lavar en PBS II durante 5-10 minutos. 7. Secar alrededor de los pocillos e inmediatamente cubrir cada pocillo con una gota de conjugado. 8. Incubar según descrito punto Lavar según descrito en punto Montar. 11. Evaluar los portas bajo el microscopio de fluorescencia. Referencias 1. Weller, T. H; Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: Bradwell A. R. et al (1997): Atlas of autoantibody patterns on tissues. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. 3. Szulman AE. (1962): The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp. Med Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc., son marcas comerciales registradas. Copyright 2013 Todos los derechos 4
5 Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only): Technical Service (Outside the U.S.): support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ESP November 2013 Revision 2 5
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