FACTORES QUE DETERMINAN EL RESULTADO DE LA TRANSFERENCIA NO QUIRURGICA DE EMBRIONES BOVINOS

Transcripción

1 FACTORES QUE DETERMINAN EL RESULTADO DE LA TRANSFERENCIA NO QUIRURGICA DE EMBRIONES BOVINOS Cutini, A. 1, Teruel, M. 2 y Cabodevila, J. 3 Trabajo Publicado en la Revista Taurus Nº 7: y Nº 8: 35-47, 2000 Resumen Los porcentajes de preñez que se obtienen luego de la transferencia no quirúrgica de embriones se han incrementado de manera significativa en las últimas décadas. No obstante, se considera factible mejorar la eficiencia de la técnica en la que intervienen factores relacionados con el embrión, con la receptora y con la transferencia propiamente dicha, produciéndose además interacciones entre ellos. Dentro de los factores embrionarios, la calidad influye claramente en el resultado de la transferencia, independientemente de que los embriones sean frescos, criopreservados, micromanipulados y/o producidos in vitro. La congelación afecta la viabilidad de los embriones producidos in vivo, no obstante, como las diferencias no son sustanciales se compensan con las ventajas que la técnica trae aparejada. La viabilidad pos transferencia de los embriones producidos in vitro y/o micromanipulados es marcadamente inferior a la de los embriones producidos in vivo, tales diferencias se acrecientan cuando dichos embriones son criopreservados. En la selección de receptoras son más importantes las condiciones de crianza, el manejo sanitario y el estado nutricional de las mismas que su raza o categoría. Al momento de la transferencia, la receptora ideal es aquella con sincronismo o con un asincronismo de ±24 hs, en la que se ha comprobado la presencia del cuerpo lúteo; además se debe relacionar el estadio de desarrollo embrionario con el día del ciclo de la receptora. La experiencia del operario en el manejo del tracto genital y la comodidad con que efectúa la maniobra condicionan el éxito de la transferencia embrionaria, por ello es recomendable utilizar anestesia epidural y sedantes dependiendo del temperamento de la receptora. La transferencia de vesículas embrionarias y la aplicación de tratamientos hormonales, utilizados para aumentar los porcentajes de preñez no han arrojado resultados que justifiquen su aplicación. 1 Becario de Perfeccionamiento. Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC). 2 Profesor Adjunto. Departamento de Ciencias Biológicas. 3 Profesor Asociado. Departamento de Clínica. Area de Reproducción. Grupo Consolidado de Investigación en Fisiología y Farmacología Veterinaria (FISFARVET). Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Campus Universitario. (7000) Tandil

2 1. Introducción En bovinos, la transferencia de embriones a través del cervix comenzó a ser utilizada en trabajos experimentales en Dificultades de distinta índole que se presentaron en el desarrollo del método hicieron que el nacimiento del primer ternero se produjera recién en 1964 (71). En las últimas décadas, los porcentajes de preñez se han incrementado de manera significativa posibilitando actualmente obtener porcentajes de alrededor del 60%, aún con la transferencia de embriones congelados (22). Teniendo en cuenta un estudio de Xu y col. (119), donde el porcentaje de preñez a primoinseminación promedió 64%, con un rango que varió entre 48 y 79%, un primer análisis comparando los resultados de ambas técnicas llevaría a pensar que con la transferencia no quirúrgica se está cerca de alcanzar el límite biológico. No obstante, al profundizar dicho análisis surgen diferencias. Las hembras que retornan al celo en las primeras 3 semanas pos inseminación son aquellas en las que no se produjo la fecundación o que sufrieron mortalidad embrionaria temprana; por el contrario en la transferencia embrionaria, las receptoras reciben embriones que al séptimo día de gestación son morfológicamente normales. Según Dunne y col. (30), en la inseminación artificial, un 10% de los ovocitos no son fecundados y la mayor parte de las pérdidas embrionarias ocurren antes del día 14 de gestación. La transferencia embrionaria permite evitar muchas de estas pérdidas, es por ello que pese a los notables progresos registrados, se considera factible incrementar los porcentajes de preñez que se obtienen actualmente con la transferencia no quirúrgica. El objetivo de este trabajo es efectuar un análisis de aquellos factores que determinan el resultado de la transferencia no quirúrgica. Se abordarán aspectos propios del embrión, de la receptora y del método, sin dejar de lado las interacciones que se producen entre ellos. Finalmente, se discutirán distintas alternativas que han sido utilizadas con la finalidad de mejorar la eficiencia de la técnica. 2. Factores relacionados con el embrión A partir del desarrollo de la técnica de transferencia se observó que tanto la calidad de los embriones como el estadio de desarrollo y su edad podían afectar el resultado de la aplicación de la misma. Además de los factores propios del embrión, con la puesta a punto de técnicas tales como criopreservación, micromanipulación y más recientemente producción in vitro de embriones, otros factores se fueron sumando a aquellos que modificaban los resultados de preñez. Además, está demostrado que los resultados de preñez dependen no sólo de cada factor embrionario, sino de la interacción que pueda existir entre dos o más de ellos (11,37,54,108,110)

3 2. 1. Calidad embrionaria La realización de una minuciosa evaluación de la calidad embrionaria es de fundamental importancia para el éxito de la transferencia. Es así que embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta probabilidad de alcanzar la preñez. No obstante, debe considerarse que embriones calificados excelentes luego de ser transferidos normalmente, no terminan en preñez, mientras que embriones de buena calidad y transferidos con algún tipo de problema, resultan en preñeces y nacimientos normales (31). Este hecho nos indica que si bien la calidad embrionaria puede determinar los resultados obtenidos, otros factores relacionados con la receptora o con la transferencia podrían modificar dichos resultados. Resulta dificultoso comparar la información publicada por distintos autores dado que se utilizan diferentes escalas para evaluar la calidad embrionaria. Hasta mediados de la década del 90, se utilizó principalmente una escala de 5 puntos, considerando a los embriones como excelentes, buenos, regulares, malos o degenerados. Actualmente muchos autores optan por la escala propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria que agrupa los embriones según su calidad en 4 grados: excelentes y buenos, regulares, malos o degenerados. En la Tabla 1 se muestran algunos resultados de preñez obtenidos luego de la transferencia de embriones frescos (sin criopreservar) donde se observa el efecto de la calidad de los mismos. Por otro lado, se ha reportado una mayor incidencia de muerte embrionaria cuando se transfieren embriones de calidad pobre, que cuando los mismos son morfológicamente normales (60). Tabla 1. Efecto de la calidad embrionaria sobre el porcentaje de preñez pos transferencia de embriones sin criopreservar. Autores Wright (116) Hasler y col. (36) Reinchenbach y col. (91)* Hasler y col. (37)* Calidad embrionaria buena regular pobre buena regular pobre excelente y buena regular pobre excelente y buena regular a, b, c diferencias significativas (p< 0,05) * Embriones producidos in vitro Embriones transferidos Receptoras preñadas n n % ,2 a ,2 b 33 33,0 c ,1 a ,5 b 31 40,8 c 33 54,1 a 21 51,2 7 25,9 b ,4 a ,7 b - 3 -

4 Por su parte, los resultados de preñez luego de transferir embriones congelados de calidad excelente pueden diferir de los de calidad buena. Con ambas calidades se obtienen mejores resultados que con aquellos de calidad regular (6,50,70) (Tabla 2). Tabla 2. Efecto de la calidad embrionaria pre-congelación sobre el porcentaje de preñez pos transferencia. Autores Leibo (50) Arreseigor y col. (6) Munar y col. (70) Calidad embrionaria pre-congelación excelente buena regular excelente buena regular excelente buena regular a, b, c diferencias significativas (p< 0,05) Embriones transferidos Receptoras preñadas n n % ,6 a 98 44,6 a 20 24,1 b ,1 a ,9 a 86 31,2 b ,9 a ,3 b 49 39,8 c Estadio de desarrollo El efecto que puede llegar a tener el estadio de desarrollo embrionario sobre los porcentajes de preñez es un factor que ha sido estudiado por diversos autores con resultados dispares. En algunos casos, blastocistos tempranos y blastocistos resultaron en mayores porcentajes de preñez que mórulas, blastocistos expandidos y blastocistos protruidos (36). Otros autores, obtuvieron mejores resultados con blastocistos que con mórulas (28,34,46,55,116); Dochi y col. (26), observaron que mórulas y blastocistos tempranos resultaron en porcentajes de preñez más elevados que blastocistos o blastocistos expandidos. Contrariamente, otros autores no han hallado efecto del estadio de desarrollo (32,41,53,67,101). Los porcentajes de preñez para embriones frescos producidos in vivo y transferidos en estadio de mórula han sido muy variados oscilando entre 48 y 70%. Cuando los que se transfirieron fueron blastocistos, los porcentajes de preñez fueron del 65-70% (32,36,67,116). Para embriones producidos in vivo y congelados, los porcentajes de preñez fueron del 40% para mórulas y blastocistos tempranos, disminuyendo a un 27% para blastocistos y blastocistos expandidos (26). Para blastocistos protruidos, se han comunicado resultados de preñez comparables a blastocistos tempranos y blastocistos (28,67). Otros autores han obtenido menores porcentajes de preñez con este estadio y lo atribuyen a daños mecánicos durante la recolección, inadecuados sistemas de cultivo o a que sean menos viables por permanecer mayor tiempo en el útero de las donantes superovuladas (36)

5 Para embriones producidos in vitro, los mayores porcentajes de preñez (60%) resultaron con blastocistos tempranos, blastocistos y blastocistos protruidos de 7 días de edad que a su vez fueron significativamente mayores que para los mismos estadios pero para una edad de 8 días, lo cual estaría indicando que la edad embrionaria sería lo determinante del éxito de la transferencia y no el estadio en sí (37). Coincidentemente, Ling y col. (54), comunicaron mejores resultados de preñez cuando se transfirieron mórulas de día 5 a 6 y blastocistos de día 7 que blastocistos de día 6 y blastocistos expandidos de días 7 a 8 corroborando una interacción entre estos dos factores embrionarios. A su vez, resultados de preñez del 80% fueron comunicados por Takeda y col. (108), cuando se utilizaron embriones de alta calidad, independiente de que fueran mórulas, blastocistos tempranos, blastocistos o blastocistos expandidos, confirmando la interacción del estadio de desarrollo con otro factor embrionario como es la calidad Edad embrionaria Muchos de los datos publicados sobre el efecto de la edad embrionaria y/o del estadio del desarrollo al momento de la transferencia sobre la tasa de supervivencia, derivan del análisis retrospectivo de transferencias, donde el factor edad se confunde con el grado de sincronismo y el método de transferencia, entre otros. La mayoría de los embriones bovinos son recolectados y transferidos con una edad de 6 a 8 días y no queda claro si realmente hay un efecto de la edad en días o del estadio de desarrollo (29). A su vez, distintos estudios han mostrado que no hubo diferencias en los porcentajes de preñez luego de la transferencia de embriones de estas edades (74,78,101,116). Por otro lado, la transferencia de embriones de 9 días o más, prácticamente no se realiza, pues es dificultoso encontrar los embriones en el medio de lavaje luego que los mismos han perdido la zona pelúcida. No obstante cuando se realizaron transferencias con dichos embriones, los resultados fueron contradictorios y mientras algunos autores no hallaron disminución en los porcentajes de preñez (78,101), otros observaron menores valores que cuando utilizaron aquellos de días 6-8 (36). Los resultados de preñez luego de transferir embriones frescos producidos in vitro, de día 6 ó 7 no mostraron diferencias significativas, con valores de preñez al día 40 de gestación de 78 y 68% respectivamente (2). Por su parte, Hasler y col. (37), habían comunicado resultados de preñez del 56% para embriones de día 7 y de 43 y 41% para aquellos de día 8 y 9 respectivamente, no obstante, la transferencia de embriones clasificados como excelentes y buenos ya sean de día 7 u 8 resultaron en mayores porcentajes de preñez que aquellos de calidad regular. Ling y col. (54) obtuvieron mayores porcentajes de preñez con mórulas de día 6 ó 7 y blastocistos de día 7 que con blastocistos de día 6 ó blastocistos expandidos de día 7 u 8 quedando demostrado una vez más la interacción entre factores embrionarios

6 2. 4. Criopreservación El efecto de la criopreservación de los embriones sobre los resultados de preñez es muy variado y ello se debe a que se producen interacciones con otros factores tales como la edad embrionaria, la calidad embrionaria y el estadio de desarrollo y a su vez si los mismos han sido producidos in vivo o in vitro. Es importante considerar además que los porcentajes de preñez resultantes de la transferencia de embriones congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección hasta el comienzo de la congelación (117), dado que la viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho período es mayor de 3 hs (85). A su vez, la calidad embrionaria pos descongelación también afecta los porcentajes de preñez, con valores que oscilan entre 30% y 68% para embriones de calidad regular y excelente respectivamente (68). El método de criopreservación utilizado debe tenerse en cuenta. Cuando los embriones son congelados convencionalmente, las tasas de preñez oscilan entre 50 y 60% resultando levemente inferiores a las obtenidas con embriones frescos (7,15,22,26,40,67,70,79,85); cuando se utiliza la vitrificación como método de conservación, los porcentajes de preñez oscilan entre 0 y 60% (1,24,88,107,113). Las bajas temperaturas a las que son sometidos los embriones así como las altas concentraciones de crioprotectores utilizadas serían la causa de la disminución en la viabilidad de estos embriones (25,81,87) Micromanipulación Actualmente los embriones bovinos son micromanipulados con el fin de obtener algunas células y proceder a la identificación del sexo previo a su transferencia o para ser divididos en dos partes iguales (hemiembriones) y producir mellizos idénticos, lo que permite la disponibilidad de animales idénticos en los programas de transferencia embrionaria. Con referencia a aquellos embriones que son destinados a la identificación del sexo, los blastómeros son abordados penetrando la zona pelúcida y aspirando 4 a 6 células o cortando la zona y los blastómeros con una navaja. En trabajos realizados con embriones sexados y transferidos frescos, la tasa de preñez fue de alrededor de 45%, observándose además que los resultados dependieron de la calidad embrionaria (11,110). En referencia a los embriones divididos, cuando son transferidos, los porcentajes de preñez dependen de la calidad de los hemiembriones con resultados que van desde un 76,2% de fetos para mitades de calidad muy buena, hasta un 24,7% para aquellas de calidad regular (12) lo cual sugiere la necesidad de destinar a la micromanipulación sólo aquellos embriones de excelente y buena calidad. La sección de los embriones provoca una pérdida celular embrionaria de aproximadamente 10%, que posiblemente compromete - 6 -

7 la viabilidad de los embriones de calidad inferior (64). Las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de hemiembriones son muy variables con una media que varía entre 50 y 60% (51,108). A su vez, la ausencia de la zona pelúcida en los hemiembriones no afecta los porcentajes de preñez para embriones transferidos frescos (45,64). Un grupo especial de embriones a ser transferidos lo constituyen aquellos que han sido micromanipulados y que posteriormente fueron sometidos a criopreservación. La supervivencia de estos embriones es menor que la de embriones intactos, y esta sensibilidad podría deberse a la perforación de la zona pelúcida y/o a la reducción del número de células que sufren estos embriones (56). Para mejorar la tasa de supervivencia se implementaron distintas alternativas metodológicas, tales como sellar el orificio practicado en la zona pelúcida cubriendo éste con una zona pelúcida adicional o que el embrión micromanipulado sea embebido en agar, previniendo así la pérdida de blastómeros adicionales, simplemente por una mejor protección física durante el crecimiento de los cristales de hielo. También se ha intentado mejorar la viabilidad de estos embriones realizando cultivos de los mismos en células epiteliales oviductales (96,97) o modificando los protocolos de congelación mediante el agregado de polivinilpirrolidona (106). Los resultados obtenidos han sido sin embargo muy variados (49,56,86,92,96,97,99,111). Los porcentajes de preñez obtenidos luego de la transferencia de los embriones micromanipulados generalmente no superan el 30% siendo a su vez muy variables según las condiciones de cultivo utilizadas, la calidad embrionaria así como el protocolo de congelación empleado (19,38,80,99,111) Producción in vitro En referencia a los embriones producidos in vitro, los mismos presentan una serie de características propias que los diferencian de aquellos producidos in vivo y que trae aparejado que los porcentajes de preñez luego de la transferencia embrionaria no exceden en promedio el 40% siendo a su vez muy variables con valores extremos de 24% y 54% (2,5,42,48,62,90,91,112,118). La morfología y la bioquímica de los embriones producidos in vitro están afectadas por las condiciones en que se desarrollan los mismos y que difieren de aquellas que tienen cuando lo hacen in vivo. Dentro de ellas se encuentran la temperatura constante, tensión controlada de oxígeno y dióxido de carbono, un permanente intercambio entre el embrión y la madre entre otras. Estas diferencias en el medio ambiente en que se desarrollan los embriones, se traducen en que los mismos presentan mayor cantidad de cromosomas anormales, blastómeros irregulares, un espacio perivitelino pequeño, una mala compactación de las mórulas, blastocistos con forma irregular y menor número de células, incremento en la cantidad de vacuolas citoplasmáticas y uniones imperfectas entre blastómeros, entre otras fallas (63)

8 Se ha demostrado que cuando son criopreservados embriones producidos in vitro, presentan una viabilidad pos descongelación que está correlacionada con la velocidad con que ellos se segmentan luego de la fecundación y por lo tanto con el tiempo que tardan en alcanzar el estadio de blastocisto. Esto se traduce en diferencias en los porcentajes de preñez luego de su transferencia, resultando en 42% para blastocistos de día 7 y sólo 20% para aquellos de día 8 (37). No obstante, la combinación de calidad y edad embrionaria fue la determinante de los porcentajes de preñez resultando los valores más altos para aquellos embriones fecundados in vitro que presentaron calidad excelente o buena al día 7 (59%), mientras que los menores porcentajes se lograron con embriones de calidad regular al día 8 (30%) (37). También se ha observado que cuando se emplean embriones producidos in vitro existe una mayor incidencia de abortos tempranos y distocias que lo normal, estas últimas aparentemente relacionadas con un incremento en el peso al nacer de los terneros. Hasler y col. (37), encontraron entre un 7,6% y 11% de abortos y hasta un 15,6% de muertes al nacer, después de la transferencia de dichos embriones. 3. Factores relacionados con la receptora Si la manipulación de los embriones y su evaluación morfológica han sido realizadas correctamente, se considera que todos los embriones seleccionados se encuentran con posibilidades de establecer una preñez, por lo tanto a partir de allí todo dependerá de la receptora y de la transferencia (14). Las receptoras deben ser reproductivamente sanas para recibir un embrión y llevar la gestación a término, poseer un tamaño que les permita parir sin grandes dificultades y deben ser de buena capacidad lechera para alimentar al ternero de manera que le permita expresar su potencial genético (3). Existe evidencia que la procedencia de la receptora afecta significativamente el porcentaje de preñez (27). La disponibilidad, el costo y la adaptación al medio, en términos de alimentación, enfermedades y cambios climáticos, son probablemente los factores más importantes que gobiernan la elección de la receptora (14). La situación ideal es aquella donde las receptoras son del propio establecimiento dado que su historia reproductiva es conocida y al haber sido criadas en el lugar, el estrés sufrido será menor. Utilizando estas receptoras, se suele obtener un 10% a un 15% más de preñez que con el empleo de animales recientemente incorporados al rodeo (3). Los trabajos de investigación de los últimos años han sido orientados principalmente a los embriones, tendiendo a mejorar su viabilidad después de la transferencia. En contraste, son menores los esfuerzos que se han hecho para incrementar el potencial de las receptoras para preñarse y llevar la gestación a término (65)

9 Los aspectos más relevantes relacionados con las receptoras que pueden afectar el resultado final en un programa de transferencia embrionaria son: raza, categoría, estado nutricional, empleo reiterado, calidad del cuerpo lúteo y nivel de progesterona, sincronización con respecto a la donante y al embrión Raza Las evidencias en la literatura sobre el efecto de la raza de la receptora sobre el resultado de la transferencia son escasas. Generalmente se prefiere a las razas cruzas antes que a las puras, posiblemente porque las primeras sean más fértiles (14). Según la opinión de estos autores, las cruzas entre las razas británicas y la Holstein son preferibles a las cruzas continentales porque ellas son baratas, de tamaño medio y de buen potencial lechero, además algunas cruzas continentales son consideradas temperamentales. Por otra parte, prefieren animales de origen lechero, particularmente si se trata de vaquillonas o vacas jóvenes, antes que animales para carne con cría al pie. Argumentan su elección en que dichos animales son más dóciles y probablemente más fértiles. Además, generalmente ofrecen menos dificultades para llevar a cabo la transferencia. No obstante, otros autores, si bien transfirieron embriones congelados y vitrificados, no hallaron diferencias de preñez entre receptoras de razas lecheras (46,0%), carniceras (43,2%) y doble propósito (43,9%) (114) Categoría Este es un aspecto importante, pero con criterios encontrados respecto a si es mejor utilizar vaquillonas o vacas. Los que proponen el uso de vacas lo hacen argumentando que las mismas ya han parido alguna vez. Por otro lado, las vaquillonas son seleccionadas principalmente como receptoras por razones económicas, logísticas y técnicas, entre ellas podemos mencionar que es menos probable que se encuentren bajo estrés nutricional o que tengan una historia de problemas sanitarios, además el útero virgen es más apropiado para recibir un embrión transferido. Se considera que, así como en la inseminación artificial, en la transferencia embrionaria se obtiene mayor porcentaje de preñez en vaquillonas que en vacas (3). Sin embargo, muchos autores no hallaron diferencias (14,16,66,73,116) (Tabla 3)

10 Tabla 3. Tasas de preñez después de la transferencia de embriones en vaquillonas y vacas. Autores Wright (116) Callesen y col. (16) Neumann y col. (73) Categoría Vaquillona Vaca Vaquillona Vaca Vaquillona Vaca Receptoras transferidas n porcentaje de preñez , , , ,5 El porcentaje de receptoras que abortan después de que ha sido confirmada la preñez ronda el 5% (16,17,18,44), resultando similar al reportado en hembras inseminadas. Munar y col. (69), observaron mayor porcentaje de abortos cuando se utilizaron como receptoras vaquillonas. Tales diferencias no fueron corroboradas por otros autores (16,18). Wright (116), observó que el estrés lactacional no tuvo efecto sobre la tasa de preñez, no encontrando diferencias entre las vacas con terneros al pié y las vacas secas. Por otro lado, Van Wagtendonk-de Leeuw y col. (114), no hallaron diferencias de preñez entre receptoras que tenían de 1 a 7 pariciones. Si bien las vacas pueden, en general, tener un porcentaje de preñez ligeramente inferior a las vaquillonas, cuando también se tienen en cuenta la supervivencia y la viabilidad de los terneros, la tasa de éxito final es de la misma magnitud que cuando se emplean vaquillonas (3,16,18). Además el cervix de las vaquillonas es estrecho y durante la fase luteal se encuentra cerrado, lo cual dificulta en algunas ocasiones la inserción del instrumental de transferencia, requiriendo un tiempo adicional que actúa negativamente sobre el resultado final (43). En las condiciones de manejo semiintensivo o extensivo que predominan en nuestro país, Alberio (3) recomienda la utilización de vacas jóvenes de primera y segunda parición, las que al tener menos problemas al parto permitirán obtener resultados superiores que con vaquillonas. En síntesis, si bien existen razones biológicas, prácticas y técnicas que justifican la elección de vaquillonas o vacas, tanto unas como otras pueden resultar muy buenas receptoras después de una adecuada selección. La elección de la categoría dependerá de las condiciones bajo las cuales se desarrolle el programa de transferencia (16)

11 3. 3. Estado nutricional La nutrición es un factor importante en el manejo de las receptoras y afecta todos los aspectos de la reproducción. Por lo tanto, la receptora preñada no debe ser tratada como cualquier otra vaca, ya que gestará y amamantará a los terneros de mayor valor del establecimiento, resultando vital la alimentación de las mismas para el éxito final de la transferencia (3). La condición corporal de las receptoras y el contenido energético de la alimentación que éstas reciben son los factores más importantes. El cambio que se produce en la condición corporal entre el parto y la transferencia, guarda estrecha relación con el contenido energético de la alimentación que la receptora recibe en dicho período. Si se produce una disminución marcada de la condición corporal se afectan el intervalo parto-celo y los porcentajes de preñez y parición. Tomando como referencia la escala 1-5, es necesario lograr una condición corporal 2,5 al parto para que ésta no resulte inferior a 2 en el momento de la transferencia (14). Luego, el nivel energético debe seguir siendo correcto, sin llegar al exceso, y debe continuar hasta que la nidación del embrión haya finalizado, resultando determinante entre los días 21 y 45 de gestación (83,105). Mapletoft y col. (57), obtuvieron mayor porcentaje de preñez con receptoras de condición corporal entre 2 y 3, que con aquellas de 1 o 4 (Tabla 4). Tabla 4. Efecto de la condición corporal de la receptora sobre el porcentaje de preñez después de la transferencia no quirúrgica (57). Condición corporal Receptoras transferidas n porcentaje de preñez a b b a a, b diferencias significativas (p< 0,05) Empleo reiterado Cuando se diagrama un programa de transferencia embrionaria surge el interrogante sobre cuántas veces puede repetirse la transferencia a una misma receptora. Se ha observado que la tasa de preñez no es afectada hasta la tercera transferencia y que luego tiende a disminuir progresivamente (18,27,36,52). Esto ocurre con vaquillonas y vacas (18) y con embriones producidos in vivo e in vitro. En base a esta información se ha establecido un criterio donde se señala que cada receptora podrá tener tres oportunidades de quedar preñada, luego de haber sido transferida correctamente con un embrión de buena calidad (3)

12 En la Tabla 5 se presentan resultados obtenidos por distintos autores luego de efectuar transferencias sucesivas. Tabla 5. Porcentajes de preñez obtenidos por distintos autores luego de efectuar transferencias sucesivas. Autores Transferencias 1º 2º 3º 4º Donaldson (27) 58,8 52,6 56,4 50,2 Hasler y col. (36) Liebrich (52)* *Embriones producidos in vitro Calidad del cuerpo lúteo y nivel de progesterona Considerar la calidad del cuerpo lúteo a partir de su tamaño y consistencia, como un factor asociado al éxito en la selección de las receptoras parece razonable; sin embargo, como se aprecia en la Tabla 6, no es posible establecer una relación entre la calidad del cuerpo lúteo y la preñez (8,14,20,27,36,47,52,55,82). Tabla 6. Efecto de la calidad del cuerpo lúteo, estimada en función de su tamaño y consistencia a la palpación, sobre la tasa de preñez después de la transferencia embrionaria. Autores Calidad Receptoras Preñez n n % Excelente ,5 Donaldson (27) Buena ,2 Regular ,3 Dudosa , ,4 Hasler y col. (36) , ,3 Muy buena ,0 Liebrich (52)* Buena ,3 Regular y mala ,0 Bó y col. (8)** , ,9 Lagomarsino y col. (47)*** , ,1 Referencias: - (No consignado), * Embriones producidos in vitro, ** Embriones frescos + congelados, *** Embriones congelados. Actualmente, es aceptado que existen factores más importantes a tener en cuenta para descartar o seleccionar una receptora. Entre ellos, haber

13 observado el celo y comprobado la presencia de un cuerpo lúteo funcional, cualquiera fuese su calidad (8,16,18,36,47). Probablemente, el empleo de la ecografía y el análisis computarizado de imágenes aportarán en un futuro próximo nuevas herramientas para mejorar la clasificación del cuerpo lúteo (47). La progesterona es indispensable para el establecimiento y el mantenimiento de la preñez. No obstante, fueron infructuosos los intentos de seleccionar a las receptoras en base al nivel de dicha hormona al momento de la transferencia dado que éste, no se correlacionó con el porcentaje de preñez (32,82,84,105). Además, se ha observado en las receptoras que la repetibilidad de los niveles de progesterona en el día 7 del ciclo estral es baja (89) Sincronismo donante-receptora El sincronismo que se establece entre la donante y la receptora condiciona el éxito de la transferencia, pues para la nutrición del embrión resulta necesario que el ambiente uterino de ambas sea similar (43). Debido a la diversidad de criterios existente en la bibliografía, en cuanto al sincronismo entre la donante y la receptora, en el presente trabajo se asume como asincronismo positivo (+) a aquél en donde la receptora se presenta en celo antes que la donante. Por el contrario, se considera un asincronismo negativo (-) cuando la receptora presenta celo después que la donante. Se ha llegado a tolerar hasta un asincronismo de ±48 hs. (53,58), y se ha observado que no se producen grandes diferencias de preñez con asincronismos de hasta ±36 hs., no obstante, se considera que para la obtención de buenos resultados no se debe superar las ±24 hs. de asincronismo (16,59,82). Cuando la donante y las receptoras presentaron celo simultáneamente se obtuvieron las tasas de preñez más elevadas en varios trabajos (28,74,77,94,100,102), sin embargo, generalmente se considera que es más probable obtener mejores resultados transfiriendo a receptoras con asincronismo positivo (13,20,23,36,43,116). Si bien la causa es desconocida, es probable que los embriones de vacas superovuladas estén levemente más avanzados en el desarrollo que aquellos provenientes de un animal no superovulado, de allí que tengan mayor posibilidad de implantarse en una receptora con un ciclo estral más avanzado. En la Tabla 7 se presentan resultados de preñez obtenidos luego de evaluar el efecto del sincronismo donante-receptora

14 Tabla 7. Efecto del sincronismo donante-receptora sobre la tasa de preñez post-transferencia. Porcentaje de preñez Autor Asincronismo positivo (hs) Asincronismo negativo (hs) Rowson y col. (94) Sreenan y Beehan (104) Newcomb y Rowson (74) Sreenan y col. (102) Hansen (35) Shea y col. (100) Kunkel y Stricklin (46) Nelson y col. (72) Newcomb (77) Schneider y col. (98) Wright (116) Lindner y Wright (53) Donaldson (28) 35,3 40,9 45,6 49,8 52,5 50,6 47,7 37,9 33,3 De Armas y col. (23) ,9-31,6 - - Munar y col. (67) 38,5 55,0 59,6 69,3 68,3 65,4 63,2 52,1 50,0 Asincronismo positivo: La receptora presenta celo antes que la donante. Asincronismo negativo: La receptora presenta celo después que la donante. El sincronismo donante-receptora no debe ser analizado como un factor que en forma aislada pueda afectar el porcentaje de preñez. Hasler y col. (36), transfirieron embriones de distintos grados de calidad a receptoras con sincronismo y con asincronismo (+) y (-). Obtuvieron buenos porcentajes de preñez con embriones de calidad buena y receptoras con y sin sincronismo. Por el contrario, cuando los embriones transferidos fueron de calidad pobre, los mayores porcentajes de preñez se obtuvieron en receptoras con asincronismo negativo. Esto puede estar relacionado con el hecho que en los embriones de calidad pobre, el desarrollo embrionario retardado es frecuente, resultando un mejor ambiente uterino para este tipo de embrión, el proporcionado por una receptora con asincronismo negativo Sincronismo embrión-receptora Si tenemos en cuenta que en un animal superovulado los folículos pueden ovular en un periodo largo y que además el desarrollo del embrión se acelera, el sincronismo entre la donante y la receptora puede no ser el mejor indicador a tener en cuenta en el momento de decidir qué embrión transferir en una determinada receptora. Es por ello que, en el momento de efectuar la transferencia, debe ser considerado también el sincronismo embrión-receptora. Por ejemplo, si la recolección se lleva a cabo en el día 7 y contamos con receptoras disponibles entre los días 6-8 del ciclo estral, las mórulas deben ser transferidas a las de día 6, las mórulas compactas y blastocistos tempranos a las de día 7 y los blastocistos expandidos a las de día 8 (95). Esta

15 recomendación se basa en trabajos en los que se observó que la transferencias de embriones en estadios más avanzados (blastocistos expandidos y protruidos) a receptoras con asincronismo negativo, resultó en una disminución del porcentaje de preñez (13,36). Cuando se transfieren embriones congelados, las receptoras deben estar en sincronismo con el estadio de desarrollo del embrión al momento de la congelación (58). No obstante, según Wright (116), la tasa de preñez depende de la capacidad de los distintos estadios de desarrollo embrionario para implantarse y no del sincronismo donante-receptora, cuando éste no supera las ± 36 hs. Por su parte, Donaldson (28), observó que las mórulas tempranas toleraron mejor el asincronismo que cualquier otro estadio y que los embriones de calidad regular y mala, toleraron mejor el asincronismo que los de calidad excelente o buena. Cuando se emplean embriones producidos in vitro puede generarse confusión con respecto al sincronismo embrión-receptora dado que, en los sistemas de producción in vitro, se considera como día 0 al de la fecundación y en las receptoras el día 0 corresponde al estro. Hasler y col. (37), encontraron que la tasa de preñez no se vio afectada cuando se transfirieron embriones producidos in vitro frescos en receptoras que se encontraban en el día 7 u 8 del ciclo estral y que presentaban un asincronismo de ± 36 hs. 4. Transferencia no quirúrgica Los factores más importantes relacionados con la transferencia propiamente dicha que pueden influir en el resultado del programa son: ubicación del embrión en el útero, experiencia del operador, protección del instrumental de transferencia y la utilización de sedantes, relajantes uterinos y/o anestesia epidural Ubicación del embrión en el útero y experiencia del operador Estos factores son analizados en conjunto, dado que existe estrecha relación entre ambos. Rowe y col. (93), demostraron que el tiempo que insume atravesar el cervix y colocar el embrión en el cuerno uterino se correlaciona negativamente con el porcentaje de preñez. La velocidad con la que el operador realiza dicha maniobra depende principalmente del grado de dificultad que encuentra para atravesar el cervix. En esas circunstancias, la experiencia resulta de vital importancia; observándose que cuando el pasaje a través del cervix se realiza sin dificultad, los porcentajes de preñez son mayores (9,10). Del mismo modo, operadores con experiencia pueden lograr buenos porcentajes de preñez (50%) aún cuando deben transferir los embriones a receptoras que presentan un cuello uterino tortuoso, difícil de enhebrar (116). Munar y col. (69), reportaron que el grado de dificultad al atravesar el cervix con el instrumental y la dificultad para depositar el embrión en el sitio deseado del útero, afectaban significativamente la tasa de abortos

16 En la Tabla 8 se presentan resultados de trabajos de transferencia embrionaria no quirúrgica, en los que se compararon los porcentajes de preñez obtenidos por operadores con o sin experiencia. Sólo en el trabajo de Rowe y col. (93) se especifica claramente qué criterio se utilizó para calificar a los operadores; el A había realizado 56 transferencias y el B ninguna, pese a que contaba con experiencia en palpación transrectal, inseminación artificial y recolección no quirúrgica de embriones. En la mayoría de estos trabajos, realizados hace más de 20 años se observaron diferencias entre operadores pese a que los porcentajes de preñez que se registraban en ese momento eran relativamente bajos. Por entonces, el método no quirúrgico estaba siendo puesto a punto y era común que, a causa de la maniobra, se produjera luteólisis y por consiguiente mortalidad embrionaria. Tabla 8. Comparación de los porcentajes de preñez obtenidos por distintos operadores utilizando el método no quirúrgico. Autores Operador A B C Bowen y col. (10) 27,0 13,0 18,0 Halley y col. (34) 46,0 a 22,6 b - Rowe y col. (93) 57,5 a 35,0 b - Schneider y col. (98) 53,1 a 47,7 a 28,0 b a, b diferencias significativas (p< 0,05) En diferentes trabajos quedó claramente demostrado que el embrión debe ser transferido al cuerno uterino ipsilateral al ovario con cuerpo lúteo (75,76,103,109). Teniendo en cuenta que la migración transuterina rara vez ocurre en bovinos (109), dicha ubicación favorece el reconocimiento materno de gestación (43). En cambio, no resulta tan claro el lugar preciso donde el embrión debe ser depositado dentro del cuerno uterino. En un principio, basado en la experiencia con la transferencia quirúrgica, se indicaba que el embrión debía ser colocado en el tercio anterior del cuerno uterino. Rowe y col. (93), no encontraron diferencias en el porcentaje de preñez entre los tercios anterior y medio, mientras que Callesen y col. (16), en un estudio que involucró más de 2000 transferencias, observaron mejores resultados transfiriendo en el tercio anterior, con respecto al medio y especialmente al posterior. Sreenan y Diskin (105) sostienen que el intento de transferir embriones por delante del tercio medio con un cateter rígido puede lesionar el endometrio y en consecuencia, causar mortalidad embrionaria. Por otra parte, Wright (116) comparó los porcentajes de preñez de transferencias efectuadas al cuerno derecho con las realizadas al izquierdo sin encontrar diferencias

17 4. 2. Protección del instrumental de transferencia La transferencia del embrión se efectúa cuando la receptora se encuentra en fase luteal. Esto es cuando su útero es susceptible a las infecciones. Sobre este aspecto hay que prestar especial atención, evitando que las bacterias presentes en los genitales externos y la vagina puedan ingresar al útero. Takahashi y col. (1982), citado por Kanagawa (43), observaron que la protección del instrumental de transferencia con una vaina estéril durante su pasaje por la vagina, incrementa de manera significativa el porcentaje de preñez. Mapletoft y col. (57), en cambio no corroboraron tales diferencias (Tabla 9). Tabla 9. Porcentajes de preñez obtenidos con la protección o no del instrumental de transferencia con una vaina descartable estéril. Autores Modalidad Kanagawa (43) Con vaina protectora Sin vaina protectora Mapletoft y col. (57) Con vaina protectora Sin vaina protectora a, b diferencias significativas (p< 0,05). Receptoras Transferidas Preñadas n n % ,6 a ,3 b ,4 a ,4 a Utilización de sedantes, anestesia epidural y/o relajantes uterinos Broadbent y col. (14), sostienen que pese a que la utilización de sedantes y anestesia epidural no es imprescindible, resulta conveniente para que el animal esté tranquilo y el operador pueda trabajar con comodidad. El costo de administrar estas drogas es bajo con relación a los beneficios potenciales, especialmente cuando la transferencia es efectuada por operadores sin demasiada experiencia. Con respecto a los relajantes uterinos, la administración de 300 µg de clorhidrato de clembuterol, minutos antes de la transferencia, no produjo mejoras en el porcentaje de preñez (4,57,115). 5. Alternativas utilizadas con el fin de incrementar los porcentajes de preñez Las alternativas utilizadas para incrementar los porcentajes de preñez han sido muy variadas. Una de ellas es el empleo de vesículas trofoblásticas, las cuales se transfieren conjuntamente con el embrión, con la finalidad de contribuir al mantenimiento de la fase luteal en la receptora, y mejorar la intensidad y la calidad de las señales embrionarias. Heyman y col. (39)

18 transfirieron un embrión congelado y dos vesículas trofoblásticas congeladas simultáneamente. A los 45 días de gestación, la tasa de preñez de estas receptoras (73%) fue mayor que la del grupo control (43%). Las diferencias entre ambos grupos dejaron de ser significativas al día 90, siendo de 57% y 40%, respectivamente. En el primer grupo, las pérdidas se produjeron principalmente entre los días 45 y 60 de gestación, en cambio en el grupo control ocurrieron entre los días 21 y 45. Por otra parte se ha intentado modificar el estado fisiológico del útero por medio de una terapia suplementaria con progesterona. Crhistie y col. (21), emplearon 100 mg de progesterona entre los días 13 y 35 del ciclo de receptoras que habían recibido un embrión en el día 7, sin encontrar efecto alguno sobre el porcentaje de preñez. También se ha empleado en receptoras luego de ser transferidas, gonadotrofina coriónica humana (HCG) por su efecto luteotrófico. Se llevaron a cabo distintos estudios donde las dosis empleadas variaron entre 1000 y 5000 UI, administradas en un solo momento o en un período comprendido entre el día 7 (momento de la transferencia) y el día 35. En estos estudios no se lograron mejorar los porcentajes de preñez (33,55,61,82,105). Con la misma finalidad se ha empleado la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) o alguno de sus análogos. Ellington y col. (32), administraron 8 µg de buserelina al momento de la transferencia o entre los días 4 y 7 pos transferencia. Los porcentajes de preñez logrados 72% y 66%, respectivamente no difirieron del grupo control, 68%. 6. Conclusiones - La calidad embrionaria es el único factor relacionado directamente con el embrión que influye claramente en el resultado de la transferencia. - Los porcentajes de preñez que se obtienen actualmente con embriones congelados son inferiores a los que se logran con embriones frescos. Las diferencias no son sustanciales, por lo tanto se compensan con las ventajas que la congelación trae aparejada. - La viabilidad pos transferencia de los embriones producidos in vitro y/o micromanipulados es marcadamente inferior a la de los embriones producidos in vivo. Tal diferencia se acrecienta cuando dichos embriones son criopreservados. - En la selección de receptoras son más importantes las condiciones de crianza, el manejo sanitario y el estado nutricional de las mismas que su raza o categoría

19 - Las receptoras que han sido transferidas sin dificultad con embriones de buena calidad en tres oportunidades y no han quedado preñadas, deben ser eliminadas del programa de transferencia. - En la elección de la receptora es importante haber observado el celo y comprobado la presencia del cuerpo lúteo, independientemente de su calidad y del nivel de progesterona. - El asincronismo donante-receptora no debe ser mayor de ±48 hs, resultando conveniente que no supere ±24 hs. Además, es recomendable relacionar el estadio de desarrollo embrionario con el día del ciclo de la receptora al momento de la transferencia. - La experiencia del operario en el manejo del tracto genital y la comodidad con que efectúa la maniobra condicionan el éxito de la transferencia embrionaria, por ello es recomendable utilizar anestesia epidural y sedantes, dependiendo del temperamento de la receptora. - Las distintas alternativas utilizadas para aumentar los porcentajes de preñez luego de la transferencia embrionaria no han arrojado resultados que justifiquen su aplicación. 7. Bibliografía 1. Agca, Y., Monson, R.L., Northey, D.L., Abas Mazni, O., and Rutledge, J.J Post-thaw survival and pregnancy rates of in vitro produced bovine embryos after vitrification. Theriogenology, 41: Agca, Y., Monson, R.L., Northey, D.L., Abas Mazni, O., Schaefer, D.M. and Rutledge, J.J Transfer of fresh and cryopreserved IVP bovine embryos: normal calving, birth weight and gestation lengths. Theriogenology, 50: Alberio, R.H. Manejo de donantes y receptoras. En G. A. Palma & G. Brem Transferencia de embriones y biotecnología de la reproducción en la especie bovina.. Editorial hemisferio sur. Buenos Aires, Argentina. 1ra. Edición 1993, Almeida, A.P Nonsurgical embryo transfer in cattle: The effect of clenbuterol on pregnancy rates. Theriogenology, 31: Aller, J.F., Alberio, R.H. y Alberio, R Producción de mellizos en bovinos por medio de la transferencia de embriones producidos in vitro. Therios, 27: Arreseigor, C.J., Sisul, A., Arreseigor, A.E. and Stahringer, R.C Effect of cryoprotectant, thawing method, embryo grade and breed on pregnancy rates of cryopreserved bovine embryos. Theriogenology, 49: Beal, W.E., Hinshaw, R.H. and Whitman, S.S Evaluating embryo freezing method and the site of embryo deposition on pregnancy rate in bovine embryo transfer. Theriogenology, 49: Bó, G.A., Cutaia, L., Tríbulo, R., Moreno, D., Caccia, M. y Tríbulo, H Efecto de la calidad del cuerpo lúteo a la palpación rectal sobre el porcentaje de preñez de embriones frescos y congelados. ΙΙΙ Simposio Internacional de Reproducción Animal, pg Boland, M.P., Crosby, T.F. and Gordon, I Birth of twin calves following a single transcervical non-surgical egg transfer technique. Vet. Rec., 99: Bowen, J.M., Elsden, R.P. and Sidel, G.E., Jr Non surgical embryo transfer in cow. Theriogenology, 10: Bredbacka, P Recent developments in embryo sexing and its field application. Reprod. Nutr. Dev., 38: Brem, G Micromanipulación en embriones bovinos y su aplicación en mejoramiento animal. Hemisferio Sur, Argentina,

20 13. Breuel, K.F., Baker, R.D., Butcher, R.L., Townsend, E.C., Inskeep, E.K., Dailey, R.A. and Lerner, S.P Effects of breed, age of donor and dosage of follicle stimulating hormone on the superovulatory response of beef cows. Theriogenology, 36: Broadbent, P.J., Stewart, M. and Dolman, D.F Recipient management and embryo transfer. Theriogenology, 35: Cabodevila, J Transferencia de embriones y biotécnicas derivadas. Therios, suplemento especial, Reproducción en bovinos, Callesen, H., Bax, A. and Greve, T Embryo recipients: Dairy cows or heifers? Proc. of the 10 th Scientific Meeting of the Association Eur. Transf Emb., September 1994, Lyon, France. Fondation Merieux, Lyon, pp Callesen, H., Lovendahl, P., Bak, A. and Greve, T Factors affecting the developmental stage of embryos recovered on day 7 from superovulated dairy cattle. J. Anim. Sci., 73: Callesen, H., Liboriussen, T. and Greve, T Practical aspects of multiple ovulationembryo transfer in cattle. Anim. Reprod. Sci., 42: Chesne, P., Heyman, Y., Chupin, D., Procureur, R. and Menezo, Y Freezing cattle demi-embryos: influence of period of culture between splitting and freezing on survival. Theriogenology, 27: Coleman, D.A., Dailey, R.A., Leffel, R.E. and Baker, R.D Estrous synchronization and establishment of pregnancy in bovine embryo transfer recipients. J. Dairy Sci., 70: Crhistie, W.B., Newcomb, R. and Rowson, L.E.A Embryo survival in heifers after transfer of an egg to the uterine horn contralateal to the corpus luteum and the effect of treatment with progesterone or hcg on pregnancy rates. J. Reprod. Fert. 56: Cutini, A., Teruel, M. y Cabodevila, J Criopreservación de embriones de especies de interés pecuario. Rev. Arg. Prod. Anim., 19: De Armas, R., Solano, R. y Caral, J Transferencia no quirúrgica de embriones en el bovino por un método transcervical. Revista Cubana de Producción Animal, 12: De Leeuw, A.M., den Daas, J.H., Kruip, T.A. and Rall, W.F The relative efficacy of bovine embryo cryopreservation by vitrification and conventional slow freezing. In: Proceedings 12th International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination. The Hague, The Netherlands, pp Dobrinsky, J.R Cellular approach to cryopreservation of embryos. Theriogenology, 45: Dochi, O., Yamamoto, Y., Saga, H., Yoshiba, N., Kano, N., Maeda, J., Miyata, K., Yamauchi, A., Tominaga, K., Oda, Y., Nakashima, T. and Inohane, S Direct transfer of bovine embryos frozen-thawed in the presence of propylene glycol or ethylene glycol under on-farm conditions in an integrated embryo transfer program. Theriogenology, 49: Donaldson, L.E Recipients as a source of variation in cattle embryo transfer. Theriogenology, 23: Donaldson, L.E Matching of embryo stage and grades with recipients oestrus synchrony in bovine embryo transfer. Vet. Rec., 117: Donaldson, L.E Day of embryo collection, quality and pregnancy rates in cattle. Vet. Rec., 118: Dunne, L.D., Diskin, M.G. and Sreenan, J.M Embryo and foetal loss in beef heifers between day 14 of gestation and full term. Anim. Reprod. Sci., 58: Elsden, R.P and Seidel, G.E En: Evaluation of embryos. Procedures for recovery, bisection, freezing and transfer of bovine embryos. Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory. Colorado State University, Ellington, J.E., Foote, R.H., Farrell, P.B., Hasler, J.F., Webb, J., Henderson, W.B. and McGrath, A.B Pregnancy rates after the use of a gonafdotropin releasing hormone agonist in bovine embryo transfer recipients. Theriogenology, 36: Greve, T. and Lehn-Jensen, H The effect of hcg administration on pregnancy rate following non-surgical transfer of viable bovine embryos. Theriogenology, 17: Halley, S.M., Rhodes, R.C., MsKellar, L.D. and Randel, R.D Successful superovulation, nonsurgical collection and transfer of embryos from Brahaman cows. Theriogenology, 12: