Cuantificación mediante la técnica de PCR en tiempo real Usos y aplicaciones

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1 Cuantificación mediante la técnica de PCR en tiempo real Usos y aplicaciones Paula Fernández Instituto de Biotecnología. CICVyA. INTA-Castelar

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3 PCR Standard vs. PCR Tiempo Real Análisis de punto final Detección del producto por Electroforesis en gel Análisis de la cinética de la reacción Detección del producto en cada ciclo de la reacción

4 VENTAJAS DE PCR SOBRE OTRAS TÉCNICAS ALTA SENSIBILIDAD ALTA ESPECIFICIDAD RAPIDEZ DESVENTAJA: PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)

5 Geles de agarosa. * Baja precisión * Baja sensibilidad * Baja resolución * No automatizado * Discriminación sólo por tamaño * Resultados cualitativos

6 Consiste en dos pasos: RT-PCR OBJETIVO: Detección de la expresión de un gen por presencia de mrna Transcripción reversa PCR mrna cdna (simple cadena) cdna (doble cadena) PCR

7 PCR en tiempo real La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.

8 Real Time PCR

9 Step One Applied Biosystems

10 Fluoróforo que se intercala en el surco menor de la doble cadena de ADN Desventaja: se une a CUALQUIER ADN de doble cadena (dímeros de primers y productos inespecíficos).

11 Observación del proceso de amplificación Se adquieren los datos cuando la amplificación está todavía en la fase exponencial. Esto está determinado por la identificación del número de ciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background) Este número de ciclo se llama ciclo umbral (C t : threshold cycle). El C t está determinado en la fase exponencial de la reacción y es más confiable que las mediciones a punto final convencionales. El C t es inversamente proporcional al número de copias del target templado: a mayor concentración de templado, menor C t medido. Concepto de eficiencia

12 Ecuación de la PCR X n X n = X 0 (1 + E) n X n = producto de PCR luego del ciclo n X 0 = número inicial de copias E = eficiencia de amplificación n = número de copias X 0 Número de ciclos

13 Las ecuaciones de PCR Idealmente, cada ADN target en la muestra original se duplica de ciclo en ciclo Esto equivale a una eficiencia de transcripción E=2 o de (E-1)x100=100% La eficiencia no siempre alcanza el máximo teórico.

14 Eficiencia La eficiencia de la reacción puede ser calculada por la siguiente ecuación: E=10 (-1/slope). La eficiencia de la PCR debería ser de aprox % (pendiente ideal = 3.32) Diversos factores afectan la eficiencia como puede ser: el largo del amplicón, la estructura secundaria y el diseño de primers (entre otros).

15 Efecto de la eficiencia de amplificación Caso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8 X n = X 0 (1+E) n X n = 100 (1+0.9) 30 X n = 100 (1+0.8) 30 X n = 2.3 x X n = 4.6 x 10 9 Resultados Una diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificación resultó en u número final de copias significativamente menor.

16 log view Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a lo largo del plateau los datos no representarían la cantidad inicial del target.

17 En la práctica uno no observa los amplicones sino una medida indirecta de su abundancia. Lo que se mide es la fluorescencia de la muestra amplificada Se supone que la fluorescencia es proporcional al número de amplicones

18 Cómo sería una curva teórica de fluorescencia en función del número de ciclos? Fluorescencia Ciclos

19 Cómo es una curva de fluorescencia real en función del número de ciclos? Fluorescencia Ciclo

20 La mayoría de las curvas de fluorescencia presentan valores erráticos para los ciclos iniciales de la reacción cuyo origen es diverso. La curva de fluorescencia no crece indefinidamente. La cantidad de reactivos limita la reacción.

21 Como interpretar Rn? Sample R n Threshold R n R n C T No Template Control R n Cycle number

22 Rn * Rn + es el valor Rn de una reacción que contiene todos los componentes (muestra de interés, GOI, blanco); Rn - es el valor Rn detectado in NTC (valor de base) * Delta Rn es la diferencia entre Rn + and Rn -. Es además un indicador de la magnitud de señal generada por la PCR * El gráfico de Delta Rn versus el número de ciclos y muestra las curvas de amplificación para estimar los valores de Ct NTC: no template control GOI: gene of interest

23 PROBLEMAS PRODUCTOS NO ESPECÍFICOS (artefactos): que pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green. ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS: Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en el DNA o cdnas de la muestra Dímeros: los primers pueden hibridarse entre ellos creando productos pequeños

24 CURVA DE DENATURALIZACIÓN Muestra el perfil de denaturalización de los productos amplificados. Si un producto presenta un perfil de denaturalización diferente (valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no específico) de amplificación, pueden ser dímeros.

25 CURVA DE DENATURALIZACIÓN DE DILUCIONES (se observan dímeros, de menor temperatura de fusión) dímeros

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27 DISEÑO EN PLACA

28 Relative expression ( media Cq( control) media Cq ( muestra)) gen objetivo ( media Cq( control) media Cq( muestra)) gen referencia E R E gen objetivo gen referencia Pfaffl M.W. Horgan G.W., Dempfle L. (2002) Relative expression software tool (REST ) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 9 e36

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34 Ventajas del PCR en tiempo real Simple y rápida (semi-automatizada). No hay manipulación post-pcr. Eliminación de contaminación por amplicones. Cuantificación del DNA o RNA molde inicial. Muy sensible. Detección de productos inespecíficos con la opción curva de desnaturalización (Melt-Curve). Detección de más de un producto específico en una misma reacción. Extraordinariamente específico.

35 Desventajas del PCR en tiempo real Laborioso y dificultoso de poner a punto Determinación de genes presuntos constitutivos Alta sensibilidad

36 Determinación del ciclo umbral (Cq) y eficiencias de la reacción de PCR cuantitativa (LinReg PCR)

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39 Normalización con genes de referencia Usualmente son genes abundantes y expresados a un nivel celular/tisular constante Los más usados son en general los menos confiables Usar una combinación de varios genes

40 Valor M: índice de estabilidad de control interno (nivel de expresión de dos genes constitutivos debe ser idéntica) Media aritmética de los desvíos de los dos genes constitutivos (j y k) Limitantes: Dependencia de genes analizados Evalúa media aritmética de los desvíos estándard de a pares de genes Supuesto de estabilidad de todos los genes 40

41 Búsqueda de genes de referencia Modelo estadístico CL1: Control leaf 1 CL2: Control leaf 2 FE1: Flower excision 1 FE2: Flower excision2 D: Dehydrated1 Fernandez y col. 2011

42 Búsqueda de genes de referencia Uso de genorm

43 Functional Genomics Strategies applied to the study of senescence in sunflower Contro l Leaf sampling at different development stages Water stress Physiological approach Metabolomic approach Transcriptomi c approach Chlorophyll Sugars Nitrogen Leaf area GC-TOF-MS Bioinformatics data analysis and integration 4 x 44 Agilent Sunflower Microarray Biomarkers (genes, transcripts & metabolites) of senescence process in

44

45 Moschen 2009

46 Normalización de PCR cuantitativa y búsqueda de genes de referencia Imposibilidad de usar un solo gen constitutivo para todas las especies (Coker y Davies 2003) Tubulina es el más estable en hoja, raíz y flor (más conveniente para análisis dentro de clonotecas en tomate) y en Populus pero el menos estable en Arabidopsis. DNA-J-like protein más estable en su expresión media ( Ct) entre todas las clonotecas (tomate). Alta abundancia de 18S o 28S RNA frente a mrna (Kim y col. 2003) (refutado por Solanas y col. 2001).

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48 Sunflower Unigene Resource (SUR v.1.0) 133,682 EST Genbank (release May 2009) Helianthus annuus L. VecScreen ( Trimseq EMBOSS ( 28,089 singletons and 12,924 contigs = 41,013 unigenes (CAP3 software: Functional annotation and KEGG mapping (Blast2GO software: 38,485 GO terms resulted in 49.6% of total sequences with GO annotation Sunflower microarray 42,386 probes 74 specific control probes (10x: 740 controls, previous cdna chip) 1,417 Agilent controls Fernández y col 2012

49 Resultados preliminares microarreglo T-1 T-2 T-3 Hoja 10 CONTROL Campo Sólo Control :6280 probes Sólo Estres: 3781 probes T-1 T-2 T-3 Hoja 10 stress hídrico Invernáculo Sólo Control :1945 probes Sólo Estres: 587 probes

50 F401 H110 T289 EF432 F550 H124 F543 H354 H125 H123 F549 F443 H387 H302 T T234 H H H136 H304 H EF502 T340 H322 T253 EF H T107 T T322 T187 Validación por qpcr de genes diferencialmente expresados Perfil de expresión para cada uno de los 80 genes candidatos

51 Estudios de expresión de genes candidatos frente a estreses abióticos Validación de genes por PCR cuantitativa (PCR en tiempo real) De los 15 genes que fueron seleccionados para su validación se evaluaron 12, confirmándose la expresión diferencial de 10 de ellos (Método 2 - Ct Livak y Schmittgen, 2001). 7 (BU671806) EST T124 7 (BU671910) EST EF ? Rn 3 FH SH CH 4 Rn 3 FH SH CH Ciclo -1 Ciclo

52 Métodos de detección por hidrólisis de ADN (Sondas TaqMan) Permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos. Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula en el 5' que bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta sonda marcada hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener. Cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por tanto, se emite fluorescencia.

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