Métodos de determinación del virus del papiloma humano (HPV) en cribado de cáncer de cérvix

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1 Métodos de determinación del virus del papiloma humano (HPV) en cribado de cáncer de cérvix Beatriz Bellosillo Servicio de Anatomía Patológica Hospital del Mar, Barcelona

2 Virus del Papiloma Humano- HPV El virus del Papiloma pertenece a un grupo diverso de virus DNA infectan a piel y a membranas mucosas de humanos y una variedad de animales cerca de 150 tipos de papilomavirus afectan a humanos 40 de ellos se localizan en el tracto ano-genital, y pueden ser: alto riesgo bajo riesgo

3 Virus del Papiloma Humano- HPV El HPV se infecta por transmisión sexual, un 80% de las mujeres podrían haber sido infectadas por al menos un tipo de HPV antes de cumplir los 50 años A menudo no se observan síntomas, especialmente en el caso de HPV de alto riesgo Mayoría de las infecciones de HPV son transitorias y asintomáticas y se solucionan sin tratamiento. El 91/% puede revertirse en dos años Otras permanecen en estado latente durante largos periodos La mujeres con riesgo de cancer de cérvix son aquellas en las que persiste la infección de un HPV de alto riesgo (HR)

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7 Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot Hibridación + Amplificación de señal Hybrid Capture 2 (hc2) Cervista HPV Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS 4800 Abbott real time PapilloCheck CLART HPV 2 INNO-LiPA Linear Array MCHA PreTect Proofer APTIMA HPV Assay FlowChip

8 Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot Hibridación + Amplificación de señal Hybrid Capture 2 (hc2) Cervista HPV Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS 4800 Abbott real time PapilloCheck CLART HPV 2 INNO-LiPA Linear Array MCHA PreTect Proofer APTIMA HPV Assay FlowChip

9 Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot Hibridación + Amplificación de señal Hybrid Capture 2 (hc2) Cervista HPV Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS 4800 Abbott real time PapilloCheck CLART HPV 2 INNO-LiPA Linear Array MCHA PreTect Proofer APTIMA HPV Assay FlowChip

10 Hybrid Capture 2 (hc2)

11 DNA de HPV Unión de sondas de RNA que hibridan con DNA de HPV Formación de hídridos DNA-RNA Unión de Ac que reconocen los híbridos DNA- RNA Unión de Ac secundario Emisión de luz

12 Test Cervista HPV HR Resumen del Flujo de trabajo Botón celular MAGNET Extracción Agencourt Alícuota 2ml de muestra desde el Vial Preparación de la Reacción Leer & Analizar Incubación

13 Cervista HPV

14 Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot Amplificación de señal Hybrid Capture 2 (hc2) Cervista HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS 4800 Abbott real time PapilloCheck CLART HPV 2 INNO-LiPA Linear Array MCHA PreTect Proofer APTIMA HPV Assay FlowChip

15 La reacción en cadena de la polimerasa Amplificación de secuencias específicas de DNA Diseño de dos oligonucleótidos primers complementarios a los extremos del fragmento a amplificar y que actúan como cebadores de la reacción

16 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 1- Desnaturalización 94ºC-96ºC 2- Hibridación 55ºC-70ºC 3- Extensión 72ºC

17

18 Original DNA target region Thermal cycle Thermal cycle En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean 1.07 billones de copias del ADN de interés

19

20 Detección de HPV mediante PCR

21 tubo microarray CLART HPV2

22 FLOWCHIP

23 cobas 4800 Configuración cobas x 480 Equipo para la extracción de ácidos nucléicos cobas z 480 PCR en tiempo real

24 cobas 4800 Kit multiplex cualitativo en un único tubo para la detección simultánea de14 genotipos de alto riesgo e identificación de los tipos 16 & 18 de HPV con ß- globina como control interno 4 canales de detección para medir los diferentes objetivos Canal 1 = panel AR HPV l (12 de 14 tipos de alto riesgo Canal 2 = HPV genotipo 16 Canal 3 = HPV genotipo 18 Canal 4 = beta-globin Diferentes tipos de muestra PreservCyt cobas PCR media HPV High Risk HR Panel 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 GT 16 GT 18 GT 18 HR Cont Ch1 Ch2 Ch3 Ch4

25

26 APTIMA HPV Assay

27

28 HPV assay Targeted HPV genotypes Detection technology DNA/RNA, target HPV gene Controls Certificates Hybrid Capture 2 13 HR Sandwich capture molecular DNA, whole genome Batch control for process FDA, IVD, CE Cervista 14 HR Signal amplification DNA, whole genome Sample by sample Reaction HIST2H2BE for sample sufficiency FDA, IVD, CE CLART 13 HR + 22 LR Polymerase chain reaction/ DNA, L1 Sample by sample hcftr microarray gene for sample sufficiency IVD, CE Flow CHIP 18 HR + 18 LR PCR + dot blot DNA Sample by sample housekeeping gene for sample sufficiency IVD, CE Cobas 14 HR Real-time polymerase chain DNA, L1 Sample by sample reaction b-globin for sample sufficiency FDA, IVD, CE APTIMA 14 HR MMLV reverse transcriptase and T7 RNA polymerase mediated amplification RNA, E6/E7 Spiked control for sample process validity FDA, IVD, CE

29 5064 muestras- 33.2% positivas con 1 técnica (41% positivas con los 4 ensayos). Menos concordancia en : Mujeres mayores (>30 años): 30% vs 49% Muestras cribado primario (29%) vs muestras de seguimiento (38%) Citología normal (22%) vs mujeres con citología anormal (68%)

30 Rebolj et al, PLOS One, January 2014

31 Elección de los ensayos de detección de HPV requisitos a considerar - Sensibilidad clínica adecuada - Controles internos (evitar falsos negativos) - Procesamiento de elevado número de muestras - Automatizable - Tiempos de respuesta adecuados - Genotipado no es imprescindible en estos momentos

32 Servei de Patologia Francesc Alameda Mercè Muset Belén Lloveras Sergi Serrano

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