ENFERMEDADES INFECCIOSAS GRADO EN VETERINARIA

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1 FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE SANIDAD ANIMAL ENFERMEDADES INFECCIOSAS GRADO EN VETERINARIA GUIÓN DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO CURSO MÓDULO: PORCINO

2 Síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRS). El síndrome respiratorio y reproductor porcino (del inglés, PRRS) es una de las enfermedades infecciosas más importantes por el impacto económico que supone para la industria porcina nacional e internacional (Albina, 1997). El agente causante es un virus (VPRRS) con envoltura perteneciente al género Arterivirus. Su genoma consta de ARN de cadena sencilla, dividido en 8 marcos de lectura abiertos (del inglés, ORFs). Los ORFs 1a y 1b ocupan la mayor parte del genoma del VPRRS y codifican, entre otras proteínas no estructurales, la polimerasa vírica; los ORFs 2a, 3, 4 y 5 codifican 4 glicoproteínas que forman parte de la envoltura del virus; ORF2b y 6 codifican proteínas de membrana no glicosiladas y el ORF7 la proteína de la nucleocápside (N) (Zimmerman et al., 1997). Los más conservados son los ORFs 1a, 1b y 7, mientras que el ORF5 es el más variable, y el que se utiliza para los estudios de epidemiología molecular (Andreyev et al. 1997). Así, se han descrito dos variantes del VPRRS presentes en EEUU (US), Europa (EU) y China cuya comparación de secuencias ha mostrado diferencias genéticas significativas fundamentalmente entre las dos primeras, siendo la China más parecida a las de EEUU. En España, la prevalencia de PRRS es bastante elevada en granjas de porcino. El contacto entre cerdos es la principal vía de transmisión, el segundo mecanismo de transmisión es la vía aérea, particularmente en invierno y en distancias menores de 3 Km. Una tercera vía de transmisión es la venérea. El verdadero papel de los fómites no está claramente determinado pero se conoce que el virus es excretado en orina y heces, por lo que debe considerarse la posibilidad de que esta vía actúe como fuente de infección (Albina et al. 1998). Uno de los métodos más empleados para el diagnóstico etiológico de PRRS es la RT-PCR que, acompañada de la secuenciación del amplicón, nos permite determinar el genotipo viral. En los últimos años se han empezado a desarrollar nuevas técnicas de RT-PCR en tiempo real que suponen una mejora sobre las convencionales debido a que presentan ventajas como su mayor sensibilidad, la posibilidad de cuantificar la carga viral o el ahorro de tiempo y material, mejorando el control de la enfermedad. En este caso, emplearemos la qrt-pcr en tiempo real basada en SYBR Green. El SYBR-GREEN es el fluoróforo específico de ADN bicatenario más usado en la RT-PCR, ya que es económicamente más competitivo que otras sondas y permite cuantificar la amplificación. El SYBR Green se une a cualquier ADN bicatenario presente en la muestra y emite una señal de fluorescencia que es directamente proporcional a la cantidad de ADN existente. Debido a esto, este formato de detección necesita una puesta a punto previa para que la PCR no amplifique productos inespecíficos que luego la molécula detectaría, introduciendo errores en el posterior análisis de los resultados. La interpretación se realiza mediante la curva de amplificación y la curva de disociación obtenidas (consultar imágenes más abajo. Diagnóstico del Síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRS) Al igual que con otros agentes virales, se pueden realizar análisis virológicos (qrt-pcr) y serológicos (ELISA). Debido a que el diagnostico precoz de esta enfermedad en la granja evitará mayores pérdidas económicas, es importante el uso de técnicas con una alta sensibilidad, así como la elección de las mejores muestras para el diagnóstico, como podrían ser muestras de pulmón o suero (Reiner et al., 2009).

3 Etapas de la Técnica de detección de PRRS por RT-PCR: Imagen 1. Etapas en el análisis de la muestra: 1. Animal origen de la muestra. 2. Pulmón recogido en la necropsia del animal. 3. Macerado del tejido. 4. Extracción de ARN con columnas de sílice. 5. ARN extraído listo para hacer la amplificación por RT-PCR. 6. qrt-pcr Real Time en Ilumina y resultados obtenidos de la técnica.

4 Material y Métodos: 1. Macerado (Etapa 3): Bandeja con hielo. Lejía al 50 %. Tijeras y pinzas. Macerador Tenbroeck. Rotulador permanente. Gradilla para tubos de 10ml.y para tubos de microcentrifuga Tubos de microcentrífuga. Pipetas serológicas y puntas estériles. PBS 1X. Vaso de precipitado. Papel adsorbente. Guantes de látex o nitrilo Pipeteador automático 1.1 Identificar el papel donde vamos a cortar. 1.2 Cortar 1gr aproximadamente de tejido. 1.3 Identificar los maceradores. 1.4 Introducir la muestra en el macerador. 1.5 Añadir 10ml de PBS 1X y maceramos. 1.6 Identificar los tubos de microcentrífuga. 1.7 Alicuotar el contenido del macerador en los tubos de microcentrífuga. 1.8 Guardar -20 ºC si se va a usar en las próximas 24 horas. Si no es así, se guardará a -80ºC.

5 2. Extracción de ARN (Etapa 4): Lejía al 50 %. Rotulador permanente. Guantes de látex o nitrilo Gradilla para tubos de microcentrífuga. Tubos de microcentrífuga. β-mercaptoetanol Pipetas y puntas estériles. Centrífuga. Vaso de precipitado. Etanol al 100% y al 70% NucleoSpin RNA. (Macherey-Nagel) 2.1 Añadir 150µl de macerado y (350µl de Buffer RA1 + 3,5µl de β-mercaptoetanol = 353,5µl) por cada muestra y agitar en el vortex. 2.2 Introducir la mezcla en una columna de filtro morado y centrifugar 1 min. a 11000g. 2.3 Desechar la columna de filtro morado y añadir 350µl de etanol al 70% al líquido y mezclar pipeteando 5 veces aprox. 2.4 Pipetear 2-3 veces más para deshacer cualquier precipitado, pasar la mezcla a una columna de filtro azul, centrifugar 30seg. a g y cambiar la columna a otro tubo recolector limpio. 2.5 Añadir 350µl de MDB y centrifugar a 11000g durante 1min. Asegurarse de que el líquido del tubo recolector NO toque la columna a la hora de cambiarlo a un tubo limpio. 2.6 En un eppendorf añadir 10µl de DNAsa a 90µl del reactivo RXN Buffer DNAsa por cada muestra a extraer. Mover el tubo invirtiéndolo de arriba abajo. 2.7 Añadir 95µl de DNasa react. Mixture en el centro de la membrana de la columna e incubar 15 min. a tª ambiente. 2.8 Una vez transcurrido el tiempo de incubación, añadir 200 µl de Buffer RA2 y centrifugar 30seg. a 11000g. Cambiar el tubo recolector por otro limpio. 2.9 Añadir 600µl de Buffer RA3 y volver a centrifugar 30seg. A Tirar el sobrenadante Añadir 250µl de Buffer RA3 y centrifugar 2min a 11000g. Poner la columna en un eppendorf Eluir el ARN en 60µl de H2O y centrifugar a 11000g durante 1min. Recoger el líquido y volver a pasarlo por la columna, para concentrar más la muestra. Centrifugar de nuevo a la misma velocidad y el mismo tiempo. Lo que obtenemos es el ARN ya extraído Congelar inmediatamente a -20ºC

6 3. qrt-pcr Real time (Etapa 5-6): Se han descrito numerosas PCRs para el diagnóstico de PRRS. Para diagnóstico, conviene centrarse en el ORF con la región más conservada (ORF7). Micropipetas automáticas monocanales de 1-20µl, µl, y µl Puntas de micropipeta de rangos 1-20, , y estériles Vortex Rotulador permanente Tubos eppendorf estériles Microcentrífuga para tubos eppendorf Gradilla Termociclador Eco Real-Time PCR System (Illumina) Placa y pegatina para PCR especial para el Termociclador Ilumina. Guantes de nitrilo o látex H2O estéril Mater Mix KAPA SYBR FAST qpcr (Kapa Biosystems) Retrotranscriptasa: KAPA RT Primers a una concentración de uso de 5 μm - primer P1 secuencia 5 -GCGAATCAGGCGCACWGTATG-3 (forward) - primer P2 secuencia 5 -CCAGCCAGTCAATCARCTGTG-3 (reverse) 3.1 Preparación de la mezcla de reacción (Mix) En un tubo de microcentrífuga de 1.5ml estéril, se preparará la mezcla de PCR, según se describe a continuación, para el número total de muestras a analizar (incluyendo los controles positivos y negativos de extracción y reacción) Cálculos del Mix de PCR para una muestra: Componentes Mater Mix KAPA SYBR FAST qpcr (Kapa Biosystems) Primers Fwd y Rwd 5 μm Retrotranscriptasa: KAPA RT Mix Agua Muestra (ARN) Volumen final de reacción ORF7 5 μl 0.5 μl (200 nm) 0,4 μl 1,8 μl 2 μl 10 l

7 3.2 Añadir 8 µl del Mix, al número de pocillos de la placa para PCR necesarios 3.3 Añadir 2 µl de ARN (muestra), Incluir un control positivo (2 µl de ARN positivo a PRRS) y un control negativo de reacción (2 µl de agua destilada) en cada PCR. 3.4 Cerrar bien y numerar la placa de PCR. Centrifugar la placa para que la mezcla no tenga burbujas de aire, y se baje al fondo del pocillo. 3.5 Colocar la placa en el termociclador Eco Real-Time PCR System (Illumina) y poner el programa de amplificación detallado a continuación: Pasos ORF7 Retrotranscripción 30 a 48ºC Desnaturalización 10 a 95ºC Amplificación Curva de Disociación 30 a 94ºC 45 ciclos: 90 a 60ºC 60 a 72ºC 15 a 95ºC 15 a 55ºC 15 a 95ºC Secuenciación y análisis filogenético: OPCIONAL: mediante las técnicas empleadas se puede conocer si el virus de las muestras positivas es de genotipo EU o US. Para poder conocer la secuencia completa, los productos de PCR de las muestras positivas serán enviadas al servicio de secuenciación para poder determinar la variante exacta del virus y así establecer relaciones filogenéticas con otras cepas.

8 Resultados: Tras la realización de la qrt-pcr basada en SYBR Green, obtenemos las siguientes curvas que debemos interpretar para conocer los resultados: ORF 7: Detección de PRRS por RT-PCR Real-Time : MUESTRA 1 MUESTRA 2 Imagen 2. Curva de amplificación. Esta curva representa el incremento de fluorescencia que se registra según avanzan los ciclos de la PCR. Como se ha explicado anteriormente, dicha fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de ADN bicatenario presente en la muestra. Se construye enfrentando los ciclos de la PCR (normalmente 40) a la cantidad de fluorescencia detectada al final de cada ciclo de amplificación. Así, cuanto mayor es el ciclo de la PCR en el que estamos, mayor es la fluorescencia emitida (hay más ADN amplificado). NO indica de donde viene esa fluorescencia por lo que siempre debemos confirmar si la amplificación es específica mirando la curva de disociación. El ciclo de la PCR a partir de la cual la muestra se considera positiva se denomina Ct. Cuanto menor sea el Ct de una muestra, mas cantidad de ADN inicial existía. Muestra 1: Control + de PCR. Muestra 2: Muestra problema. MUESTRA 1 MUESTRA 2 Imagen 1. Curva de disociación. Esta curva indica la especificidad de la amplificación de un fragmento de ADN durante la PCR. Debido a que el SYBR Green se une a cualquier fragmento de ADN bicatenario, esta representación es muy importante. Nos permite confirmar si la fluoresencia detectada procede de la amplificación de un único fragmento de ADN (misma longitud y composición de nucleótidos) o de varios distintos (observaríamos varias curvas de morfología diferente).se representa la temperatura de disociación del fragmento de ADN bicatenario amplificado frente a la fluorescencia emitida por ese mismo fragmento. Ambos parámetros dependen de la composición y longitud del ADN amplificado, y por tanto, cada fragmento tiene una curva específica y única. Muestra 1: Control + de PCR. Muestra 2: Muestra problema

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