CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Transcripción

1 CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Servicio de Microbiología Alimentaria JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS 5-7 junio 2013 CONTROL MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS. ACTIVIDADES DE REFERENCIA. Mª Carmen Blanco Vidal Jefe del Servicio de Microbiología Alimentaria Mª Jesús Zamora Escribano Facultativo Especialista David Pérez Boto Carmen Zigorraga Laboratorio de Salud Pública de Gipuzkoa Juan Olmedo Mendicouague Jefe de Sección de Parasitología y Técnicas Especiales Inmaculada García Laboratorio Normativo de Salud Pública del Gobierno Vasco

2 PROGRAMA 2013 Actividades de referencia en el control microbiológico de alimentos. PONENTE: Mª Carmen Blanco Vidal Nuevas tendencias en las normas ISO relacionadas con el control microbiológico de alimentos. PONENTE: Mª Jesús Zamora Escribano Tipificación molecular de gérmenes patógenos mediante la técnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE). PONENTE: David Pérez Boto Ejercicios de intercomparación. PONENTE: Carmen Zigorraga Actividades de referencia para parásitos de origen alimentario. PONENTE: Juan Olmedo Mendicouague Programa de seguridad microbiológica de la C. A. del País Vasco. PONENTE: Inmaculada García

3 SERVICIO DE MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA Actividades de referencia en el control microbiológico de alimentos Ponente: Mª del Carmen Blanco Vidal

4 PARTICIPACIÓN EN EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN ORGANIZADOS POR LR-UE 1. LR-UE Campylobacter 2. LR-UE Salmonella 3. LR-UE E.coli (VTEC) 4. LR-UE Parásitos 5. LR-UE contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos 6. LR-UE Listeria monocytogenes 7. LR-UE Enterotoxinas estafilocócicas

5 ORGANIZACIÓN DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN POR EL CNA EN 2012 Ejercicios de Intercomparación: 8 Nº TOTAL DE LABORATORIOS PARTICIPANTES E. coli y Salmonella en moluscos 30 Investigación de Salmonella spp. 43 Investigación de Listeria monocytogenes 40 Recuento de Listeria monocytogenes 40 Recuento de Estafilococos coagulasa positivo 41 Recuento de gérmenes aerobios 41 Investigación de Trichinella spp. 27 Investigación de Enterotoxinas estafilocócicas 15

6 LNR Contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos. I Organización de Ejercicios de Intercomparación de recuento (NMP) de E. coli en moluscos Nº laboratorios participantes MUESTRA A MUESTRA B 2006 ( Donovan) 2007 (Donovan) 2009 (ISO ) 2010 (ISO ) 2011 (ISO ) 24 75% 79% 27 63% 89% 25 80% 81% % 75% % 71.4% 2012 (ISO ) 25 92% 100%

7 LNR Contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos. II Organización de Ejercicio de Intercomparación de recuento (NMP) de E. coli en moluscos 2012 (ISO ) ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS PARTICIPANTES TOTAL (25 laboratorios) Acreditados por ISO/TS :2005 Acreditados por Procedimiento Interno No Acreditados 5 laboratorios (4 laboratorios en 2011) 8 laboratorios 12 laboratorios (16 laboratorios en 2011) 1 laboratorio acreditado 3 laboratorios no participan

8 LNR Contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos. III Organización de Ejercicios de Intercomparación de Salmonella en moluscos ( NORMA ISO 6579) Nº laboratorios participantes % resultados satisfactorios % % % % % %

9 LNR Salmonella spp Organización por el CNA - VII Ejercicio de Intercomparación Año Nº laboratorios participantes Tipo de alimento % resultados satisfactorios P. Cárnicos 98% Leche 96 % P. Cárnicos 100 % Leche 100% P. lácteos 97,4% P. lácteos 100% P. lácteos 100%

10 LNR Salmonella spp Métodos utilizados por los 43 Laboratorios participantes en el Ejercicio de Intercomparación Salmonella spp NORMA ISO P.I. BASADO EN NORMA ISO ISO + PCR BAX 2 ISO + VIDAS 2 MÉTODO VIDAS 2 NO INFORMAN 2 TOTAL 43

11 VI E.I. Detección de Listeria monocytogenes CNA. Organización de Ejercicios Intercomparación Tipo de muestra Productos lácteos Productos lácteos (GSC) Productos Lácteos (GSC) Productos Lácteos Productos Lácteos Productos Lácteos Nº laboratorios participantes Muestras Resultados 2006 Resultados 2007 Resultados 2009 Resultados 2010 Resultados 2011 Resultados 2012 A B 95 % satisfactorios 100 % satisfactorios 100% satisfactorios 100 % satisfactorios 97,9 % satisfactorios 100 % satisfactorios 91,2% satisfactorios 97,8 % satisfactorios 100% satisfactorios

12 LNR Listeria monocytogenes ESTADO DE ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS PARTICIPANTES E.I Listeria monocytogenes Detección de Listeria monocytogenes (40 Participantes) IMPLANTADO ACREDITADO NORMA UNE-EN-ISO PROCEDIMIENTO INTERNO BASADO EN NORMA UNE-EN-ISO OTROS MÉTODOS (VIDAS, ALOA ONE DAY) 2 4 TOTAL 13 27

13 E.I. Recuento de Listeria monocytogenes CNA. ORGANIZACIÓN DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN Número de Laboratorios participantes Resultados Satisfactorios 24 (92,3 %) 39 (88,6%) 31 (77,5%) Resultados Cuestionables 1 (3,8 %) 2 ( 4,5%) 3 (7,5%) Resultados No Satisfactorios 1 (3,8 %) 3 (6,8%) 6 (15%)

14 LNR Listeria monocytogenes ESTADO DE ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS PARTICIPANTES E.I Listeria monocytogenes Recuento de Listeria monocytogenes (40 Participantes) IMPLANTADO ACREDITADO NORMA UNE-EN-ISO PROCEDIMIENTO INTERNO BASADO EN NORMA UNE-EN-ISO OTROS MÉTODOS (ALOA COUNT, Rapid L. mono) 1 4 TOTAL 16 24

15 LNR ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVO CNA. ORGANIZACIÓN EJERCICIO INTERCOMPARACIÓN Recuento Estafilococos coagulasa positivo (Norma ISO 6888) Número de Laboratorios participantes Resultados Satisfactorios 31 (81,6 %) 42 ( 97,7%) 41 (100%) Resultados No satisfactorios 7 (18,4 %) 1 (2,3%) 0 (0%)

16 LNR ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVO ESTADO DE ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS DE CONTROL OFICIAL. CUESTIONARIO 2013 Recuento de Estafilococos coagualasa positivo IMPLANTADO ACREDITADO NORMA UNE-EN-ISO PRODECIMIENTO INTERNO BASADO EN NORMA UNE-EN-ISO TEMPO 0 1 AFNOR V Otros métodos 3 0 TOTAL 22 30

17 LNR ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS PARA DETECCIÓN DE ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS MÉTODOS Nº LABORATORIOS ACREDITADOS Nº LABORATORIOS NO ACREDITADOS Método del LR-UE v5 VIDAS 5 2 RIDASCREEN 1 1 Protocolo VIDAS BioMrieux

18 Recuento de aerobios mesófilos CNA. ORGANIZACIÓN EJERCICIO INTERCOMPARACIÓN Recuento de aerobios mesófilos totales a 30ºC (método, Norma ISO 4833) Número de Laboratorios Resultados Satisfactorios 36 (97,3 %) 43 ( 97,7%) 38 (92,7%) Resultados No satisfactorios 1 (2,7 %) 1 (2,3%) 1 (2,3%)

19 VISITAS INSPECCION: FVO- DG SANCO 2012 Misión DG SANCO 2012/6431: Producción y comercialización de carne de ave de corral y derivados. 5 marzo 2012 Misión DG SANCO 2012/6335: Evaluar los controles oficiales en preparados para lactantes, preparados de continuación y alimentos infantiles, incluida la cadena de suministro. 16 abril Misión DG SANCO 2012/6368: Control sobre criterios de seguridad alimentaria y de Higiene de los Procesos (Reglamento 2073/2005). 26 noviembre - 7 diciembre Misión DG SANCO 2013/6672: Control sobre Productos de la Pesca y Agua de Bebida. 21 mayo - 31 mayo FVO Misión DG (SANCO) 2013/6837. Perfil País. 30 de mayo 2013.

20 ORGANIZACIÓN DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN PREVISTOS PARA EL 2013 EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN Nº TOTAL DE LABORATORIOS SOLICITANTES E. Coli y Salmonella en moluscos 32 Investigación de Salmonella spp. 50 Investigación de Listeria monocytogenes 42 Recuento de Listeria monocytogenes. 41 Recuento de gérmenes aerobios 39 Recuento de Estafilococos coagulasa positivo 49 Investigación de Trichinella spp. 29 Investigación de Enterotoxinas estafilocócicas 16

21 LABORATORIOS DE CONTROL OFICIAL. Reg (CE). 882/2004 Métodos analíticos de referencia. Anexo I- Reg (CE). 2073/2005 Laboratorios acreditados conforme a la Norma ISO Participación en ejercicios de intercomparación LNR: Seguimiento adecuado de los participantes en los ejercicios de intercomparación

22 MODIFICACIONES DEL REGLAMENTO 2073 Reglamento de ejecución (UE) nº 1235/2012 de la Comisión de 19 de diciembre de Intensificación de los controles oficiales de las importaciones de piensos de origen animal Fresas congeladas: Origen China. Norovirus y Hepatitis A Hojas de cilantro, albahaca, menta: Origen Tailandia. Salmonella Reglamento (UE) nº 209/2013 de la Comisión de 11 de marzo de Criterios microbiológicos para los brotes y las normas de muestreo para los canales de aves de corral y la carne fresca de aves de corral E. coli STEC: ISO/TS 13136:2012 Salmonella

23 NUEVAS NORMAS ISO PARA PATÓGENOS EN ALIMENTOS Vibrio ISO/TS :2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs-horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. Part 1. Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholera. ISO/TS :2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs-horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. Part 2. Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholera. E. coli VTEC / STEC ISO/TS 13136:2012. Microbiology of food and animal feed. Real time polimerasa chain reaction (PCR) based method for the detection of food-borne pathogen. Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the detection of Shiga toxinproducing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O103 and O145 serogroups. Virus ISO/TS :2013. Microbiology of food and animal feed. Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Part 1: Method for quantification. ISO/TS :2013. Microbiology of food and animal feed. Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Part 2: Method for qualitative detection.

24 SERVICIO DE MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA Nuevas tendencias en las normas ISO relacionadas con el control microbiológico de alimentos PONENTE: María Jesús Zamora Escribano

25 NOMENCLATURA Se establecen dos tipos de Shiga-toxinas Stx o Verotoxinas VTX Stx1 3 subtipos Stx1a, Stx1c, Stx1d Stx2 7 subtipos Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2g

26 Ejercicios intercomparación LRUE Número Ejercicio Año Muestra Objetivo Resultado 1º 2007 Cepas Estudio genes virulencia Satisfactorio 2º 2008 Cepas Estudio genes virulencia Satisfactorio 3º 2009 Esponjas muestras de superficie Estudio genes virulencia y principales serogrupos Satisfactorio 4º 2010 Leche 5º 2010 Cepas Estudio genes virulencia y principales serogrupos Estudio genes virulencia y principales serogrupos Satisfactorio Satisfactorio 6º 2011 Cepas SUBTIPADO Satisfactorio 7º 2011 Espinacas frescas 8º 2012 Agua 9º 2012 Semillas Estudio genes virulencia y principales serogrupos Estudio genes virulencia y principales serogrupos Estudio genes virulencia y principales serogrupos Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio

27 Modificaciones relativas STEC/VTEC Publicación en Nov. de 2012 de la Norma ISO/TS : 2012 Microbiology of food and animal feed Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens. Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups. Modificación del Reglamento (EC) Nº 2073/2005 marzo de de julio de 2013 Matriz Brotes semillas. Productos durante su vida útil Ausencia en 25 gramos E. coli (STEC/VTEC) productor de Shiga toxinas O157, O26, O111, O103, O145 y O104:H4 CEN/ISO TS y procedimiento del Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para Escherichia coli Verotoxigenica (VTEC), para detectar el serotipo O104:H4. )

28 Norma ISO Es una norma que se aplica para la detección de E.coli STEC/VTEC : Productos destinados a consumo humano y la alimentación de animales Muestras ambientales en el área de manipulación y producción alimentaria Muestras ambientales en el área de producción primaria.

29 Norma ISO OBJETIVO : La detección de los genes de virulencia que codifican las Stx asociados a E.coli STEC/VTEC : stx1 y stx2. La detección se realiza mediante Tiempo Real. La detección de los genes asociados a los principales serogrupos asociados a E.coli STEC/VTEC :O157, O111, O26, O103 y O145 y el gen que codifica la intimina, eae. La detección se realiza mediante Tiempo Real. Confirmación del resultado de las colonias aisladas de aquellas muestras con resultado stx positivo y/o alguno o algunos de los otros genes descritos en el método.

30 FASES DEL MÉTODO 1. Enriquecimiento de la muestra 2. Extracción del ácido nucleico 3. Detección de los genes de virulencia 4. Detección de los genes del serogrupo (5) 5. Aislamiento de E.coli VTEC/STEC de las muestras con resultado stx positivo

31 FASES DEL MÉTODO 1. Fase de enriquecimiento Para muestras con elevada cantidad de flora acompañantente TSB + Acriflavina/Novobiocina Para muestras con bacterias estresadas APT Se incuban las muestras entre h/37 C 1 C

32 FASES DEL MÉTODO 2. Fase de Extracción del ADN Del sobrenadante del cultivo centrifugado se realiza la extracción el ADN de las muestras y de los controles. La extracción se realiza empleando un Kit comercial. Los controles empleados son los obtenidos de cepas positivas para cada uno de los genes analizados, una cepa negativa y un control interno de amplificación.

33 FASES DEL MÉTODO 3 y 4. Detección de los genes mediante tiempo real Amplificación empleando primers y sondas específicas para detectar el ADN presente en la muestra Interpretación de los resultados

34 ESQUEMA DE PROCEDIMIENTO de SCREENING Muestra g / ml 9 x ml TSB + N/A APT Enriquecimiento 18 h-24h a 37 C ± 1 C Porción del cultivo (1ml), purificación de DNA y PCR tiempo real de los genes stx y eae Pos para stx Pos para stx y eae. Estudio serogrupo Aislamiento de las colonias Neg stx CONFIRMACIÓN

35 ESQUEMA PROCEDIMIENTO DE CONFIRMACIÓN Aislar las colonias en medio sólido desde el medio de enriquecimiento Seleccionar 50 colonias típicas de E.coli y hacer pooles de 10 colonias PCR Tiempo Real para detectar stx y eae Seleccionar colonias positivas y analizar cada una por PCR tiempo real de los genes stx y eae Identificación de las colonias positivas y determinación del serogrupo (PCR o aglutinación) RESULTADO FINAL LRUE

36 Interpretacion de los resultados Muestras negativas no se ha detectado la presencia de los genes stx en la muestra analizada. Muestras sospechosas o presuntamente positivas aquellas muestras en la que no se han aislado las colonias pero se ha detectado: La presencia de los genes stx La presencia de los genes stx y eae La presencia de los genes stx, eae y uno de los 5 serogrupos estudiados. Muestras positivas aquellas muestras que resultan positivas para stx en el screening de PCR y se han aislado las colonias. Pueden ser: Positivas para los genes stx Positivas para los genes stx y eae Positivas para los genes stx, eae y uno de los 5 serogrupos estudiados.

37 RESULTADOS SENSIBILIDAD Y LÍMITE DE DETECCIÓN Gen Limite detección Nºcopias/reacción Sensibilidad % stx1 5 94,7 stx rfbe / O ,2 wbdi / O Wzx / O ,7 Ihp / O ,6

38 SERVICIO DE MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA Tipificación molecular de gérmenes patógenos mediante la técnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE) PONENTE: David Pérez Boto

39 Tipificación de microorganismos Definición: Caracterización de la variación intraespecie. Permite la diferenciación de aislamientos dentro de una misma especie. Métodos de tipificación disponibles Fenotípicos: Basados en características expresadas por las bacterias: serología, fagotipificación, biotipificación, Genotípicos: Basados en características del material genético (secuencia)

40 Tipificación de microorganismos Características de los métodos de tipificación Van Belkum 2007 Clin. Microbiol. Infect 1. Tipabilidad: Proporción de cepas que pueden ser asignadas a un tipo por un método determinado 2. Poder de discriminación: Capacidad de discriminar entre cepas no relacionadas 3. Reproductibilidad: Proporción de cepas tipificadas de la misma forma tras ensayos repetidos 4. Concordancia epidemiológica: Congruencia con los datos epidemiológicos existentes 5. Automatización: Reducción de errores en los métodos

41 Métodos genotípicos Comparación de dos cepas Métodos genotípicos disponibles: División binaria Idéntico material genético Basados en tamaños de fragmentos de ADN (tipo fingerprint): PCR-RFLP, RAPD, AFLP, PFGE,.. Basados en la secuencia del ADN: MLST, MLVA, secuencia genes individuales (pora, flaa, etc..) Cepa parental Variaciones: Mutaciones Inserciones Deleciones Recombinaciones

42 PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis Schwartz y Cantor ADN: Carga negativa Electroforesis convencional: No podemos resolver entre fragmentos de más de ~50 Kb ADN PFGE: La dirección del campo eléctrico aplicado en la electroforesis no es unidireccional, sino que experimenta variaciones en su orientación en periodos de tiempo (pulsos) que aumentan progresivamente con el tiempo

43 Esquema general del método de PFGE Cultivo puro Suspensión bacteria Lisozima Proteinasa K Matriz de agarosa Lisis bacteriana Lavados Genoma intacto (sin cortes) Pulsotipos Tinción ADN. Captura de imagen y análisis horas Separación de fragmentos Electroforesis Enzima de restricción: Cortes en el ADN (sitios poco frecuentes) Generación de fragmentos de ADN genómico de tamaños Kb bandas

44 Análisis de los pulsotipos que se generan en la técnica de PFGE

45 Ejemplo práctico de uso de PFGE Aislamiento de Listeria monocytogenes Pruebas bioquímicas Serotipificación (Aglutinación o PCRm)

46 Ejemplo práctico de uso de PFGE Serotipado: Todas 1/2a Es la cepa aislada en el enfermo, en la comida y en el lugar de procesado del alimento la causante? No podemos afirmarlo hasta tipificar genotipicamente la cepa

47 Ejemplo práctico de uso de PFGE Tipificación por PFGE M A B C A B 100% semejanza C

48 Ejemplo práctico de uso de PFGE Tipificación por PFGE A M A B C Cepas A y B: alimento y sitio de procesado: 100% semejanza C B Cepa C (enfermo): No guarda relación con las anteriores. El alimento no es causante de la listeriosis

49 Conclusiones Ventajas y desventajas de la técnica de PFGE frente a otros métodos de tipificación Ventajas: Elevado poder de discriminación Reproductibilidad alta Elevada tipabilidad. Utilidad en brotes Aplicable a la mayoría de bacterias Screening completo del genoma Desventajas: Duración del método Poca automatización. Múltiples pasos Discriminación no es absoluta Equipamiento/Coste Comparación interlaboratorios

50 SERVICIO DE MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA Ejercicios de intercomparación PONENTE: Carmen Zigorraga

51 SERVICIO DE MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA Actividades de referencia para parásitos de origen alimentario PONENTE: Juan Olmedo Mendicouague

52 Actividades del LNR para zoonosis parasitarias transmitidas por los alimentos Envío de Material de Referencia a los Laboratorios de Control Oficial. Confirmación y aislamiento de muestras de suidos y équidos positivas a triquina y tipificación molecular de las mismas. Participación en los Ejercicios de Intercomparación organizados por el LCR para parásitos. Organización del tercer Ejercicio de Intercomparación de triquina en España. Asistencia y participación en el Workshop anual de los LNRs organizada por el LCR en Roma. Validación de nuevo método de detección de Anisakis mediante digestión clorhidropépsica. Jornadas de Referencia. CNA Majadahonda. Madrid

53 Resultados del ejercicio de intercomparación de detección de larvas de triquina mediante el método de referencia Reglamento CE 2075/05 Laboratorios participantes: 27 Muestras de carne picada de cerdo cargadas con larvas vivas. 5 muestras por envío: 1 sin cargar y 4 cargadas. Evaluación del ejercicio cualitativa. Resultados correctos 24 laboratorios. Falsos negativos: 2 laboratorios.

54 Brotes y casos de triquinelosis humana en España (CNE) AÑO BROTES CASOS HUMANOS

55 Confirmación, aislamiento y tipificación de muestras de Trichinella 2010 por Multiplex PCR Resultados : Total: 22 muestras (jabalíes) No detectado: 2 muestras T. spiralis: 11 muestras T. britovi: 9 muestras Foto: Gabriel Jiménez Jornadas de Referencia. CNA Majadahonda. Madrid

56 Resumen muestras analizadas por LNR para el aislamiento e identificación de larvas de triquina a nivel de especie Temporada de caza : 171 muestras Temporada de caza : 96 muestras Temporada de caza : 104 muestras Temporada de caza : 157 muestras Temporada de caza : 131 muestras Publicación Ley 17/2011 de 5 de julio de seguridad alimentaria y nutrición Temporada de caza : 43 muestras Temporada de caza : 22 muestras Jornadas de Referencia. CNA Majadahonda. Madrid

57 Gracias por su atención