Unidad didáctica 3: Pruebas pre-transfusionales y administración de la transfusión

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1 Unidad didáctica 3: Pruebas pre-transfusionales y administración de la transfusión DUE. Ana Mateo Banc de Sang i Teixits. Reus DUE. Elisabeth Verdaguer Banc de Sang i Teixits. Badalona DUE. Sara Vilanova Banc de Sang i Teixits. Lleida

2 Sumario 1. Introducción 2. Objetivos 3. Solicitud transfusional y muestras de sangre 3.1 Criterios de aceptación de la solicitud transfusional 3.2 Muestras de sangre 4. Pruebas pre-transfusionales: componente y receptor 4.1 Identificación positiva del receptor y de la muestra de sangre 4.2 Revisión de los registros del servicio de transfusiones 4.3 Determinación del grupo ABO y Rh (D) 4.4 Estudio de la discrepancia sero-hemática 4.5 Resolución de las discrepancias ABO 4.6 Resolución de las discrepancias debidas a la ausencia de antígenos esperados 4.7 Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con anti-a y anti-b 4.8 Resolución de las discrepancias por reacciones séricas inesperadas 5 La prueba cruzada y la investigación de anticuerpos irregulares 5.1 Grupo ABO y Rh 5.2 Prueba cruzada 5.3 Escrutinio de anticuerpos 5.4 Identificación anticuerpos irregulares 6 Reacciones de sensibilización, aglutinación y prueba de la antiglobulina humana 6.1 Reacción antígeno-anticuerpo en 2

3 inmunohematología 6.2 Teoría del potencial Zeta 6.3 Factores que influyen en la sensibilización de los hematíes 6.4 Factores que influyen sobre la aglutinación de los hematíes 6.5 Utilidad de la prueba directa e indirecta de la anti-globulina humana 7 Soluciones potenciadoras de la unión antígenoanticuerpo 8 Bibliografía 3

4 1. Introducción La transfusión es generalmente un procedimiento beneficioso para el paciente. Pero algunas veces los hematíes del donante y a veces los del receptor tienen una destrucción acelerada. La mayoría de reacciones transfusionales hemolíticas se originan por errores en la identificación del paciente o de la muestra, pero a veces la hemolisis es provocada por anticuerpos irregulares que se encuentran en el suero del receptor. Los efectos nocivos fueron observados desde los principios de la primera transfusión, realizada en el siglo XVII por Jean-Baptiste Denis. Actualmente hay una gran variedad de pruebas pre-transfusionales que mejoran la seguridad y la eficacia transfusional. Realizar les pruebas pre-transfusionals correctamente asegura que se administren los productos sanguíneos ABO compatibles con el receptor y que se detecten la mayoría de anticuerpos irregulares clínicamente significativos. Así podemos seleccionar para cada receptor los componentes sanguíneos más adecuados y que estos una vez transfundidos tengan una superviencia aceptable y no se produzca una destrucción clínicamente significativa de los hematíes del paciente. Así la transfusión será lo más segura posible y habrá un mínimo riesgo para el receptor. 2. Objetivos Después de revisar esta Unidad, el alumno tendría que ser capaz de llevar a cabo las siguientes tareas: Conocer las pruebas pre-transfusionales que se realizan para que la transfusión de componentes sanguíneos sea lo más segura posible para el receptor. Definir las características, aplicación y metodología de los grupos sanguíneos. Conocer las discrepancias que nos pueden aparecer a la hora de determinar la tipificación del grupo sanguíneo de un paciente o receptor. Interpretar la prueba cruzada siendo ésta la prueba básica de compatibilidad pre-transfusional. 4

5 3. Solicitud transfusional y muestras de sangre 3.1 Criterios de aceptación de la solicitud transfusional La indicación de una transfusión es un tratamiento personalizado, por lo tanto hay que tener presente diferentes factores del paciente: la edad, la enfermedad de base, el motivo actual de la transfusión, antecedentes inmunohematològicos (transfusión previa, trasplantes, embarazos, abortos), antecedentes clínicos, estado inmune del paciente, la sintomatología que presenta y los resultados analíticos. Con todos los datos del receptor se tiene que valorar el riesgo/beneficio que la transfusión comporta para el paciente ya que los componentes sanguíneos suponen un riesgo, aunque pequeño, para el receptor. La administración de sangre y de sus componentes será siempre bajo prescripción médica y siempre que sea posible, el médico que la indique obtendrá la conformidad del paciente, después de haberle explicado los riesgos y beneficios de ésta terapéutica, así como las posibles alternativas. La solicitud de transfusión tendrá que contener toda la información necesaria para identificar el centro hospitalario, el receptor y el médico que la ha indicado así como las razones médicas que justifican la petición. También tendrán que constar con claridad los componentes pedidos y el grado de urgencia de la solicitud. Requisitos de la solicitud de transfusión Identificación del centro solicitante: o Nombre del centro donde está ingresado el receptor. Identificación del receptor: o Nombre y apellidos Fecha de nacimiento/edad. o Sexo o Número de historia clínica o Diagnóstico o Servicio que solicita la transfusión. 5

6 o Localización del enfermo. o Peso en caso de neonatos y en peticione de plaquetas o plasma Identificación del producto solicitado o Tipo de producto o Número de unidades o Volumen o Características especiales del componente (irradiado, lavado...) o Autotransfusión Identificación del tipo de solicitud o Inmediata: sin pruebas de compatibilidad o Urgente o Durante el día o Reserva operatoria o Reserva no operatoria Identificación del historial transfusional o Antecedentes transfusionales del paciente o Reacciones transfusionales anteriores o Embarazos, abortos o Trasplantes Identificación de la persona que extrae la muestra pretransfusional o Nombre y apellidos o Firma o identificación inequívoca. o Fecha de extracción Identificación del médico que hace la solicitud o Nombre y apellidos o Número de colegiado o firma o identificación inequívoca o fecha y hora de la solicitud o Identificación del responsable de la aceptación de la solicitud o Identificación o Fecha y hora de la recepción de la solicitud. 6

7 Solo deberían aceptarse las solicitudes transfusionales que fueran legibles y que estuvieran correctamente cumplimentadas. Las solicitudes parcialmente o defectuosamente cumplimentadas o con muestras insuficientes no serán admitidas, excepto las que sean sin pruebas de compatibilidad (inmediatas). El banco de sangre o el servicio de transfusiones siempre ha que tener un registro de todas las solicitudes transfusionales recepcionadas. Modelo de solicitud transfusional 7

8 Esquema de recepcion de solicitud transfusional. 8

9 3.2. Muestras de sangre Identificación del paciente Cuando se realice una extracción de sangre se tiene que identificar siempre al paciente de manera positiva preguntándole (si está consciente y orientado) el nombre y los apellidos. Si el paciente no está consciente u orientado compararemos la información de la solicitud de transfusión e identificaremos al paciente con la información de su pulsera identificativa, con la información que nos den los acompañantes, con la información que nos proporcione DUI de la planta o la información de la historia clínica del paciente. No se debe extraer nunca una muestra si la identificación de la solicitud no coincide con la identificación del paciente Identificación inmediata de les muestras después de la extracción Las muestras de sangre se identificaran correctamente en el momento de la extracción en la cabecera del paciente con el nombre y los apellidos del receptor, el número de identificación del paciente (historia clínica) y la fecha de la extracción. La realización correcta de este procedimiento evita la aparición de errores en la identificación del paciente y de la muestra, previniendo posibles reacciones transfusionales fatales. 9

10 Esquema obtención de muestras Para las pruebas pre-transfusionales se utiliza preferentemente sangre total anticoagulada con EDTA. Adulto o peso superior a 20 Kg: de 7-10 ml (no menos de 3 ml) 10

11 Niño de menos de 20 Kg: 1-3 ml. En neonatos se aceptan capilares heparinizados. Se puede obtener la muestra de una vía de infusión si el paciente está recibiendo medicación intravenosa. Antes de la extracción de la muestra se hará un lavado de la vía con solución salina y se rechazaran siempre los primeros 10 ml de la sangre extraída ya que la medicación que está recibiendo podría interferir en la pruebas serológicas del paciente. El intervalo aceptable entre la fecha de extracción de la muestra de sangre y la de la transfusión tiene que ser: <72 horas, si existen antecedentes de transfusiones, embarazos o trasplantes en los últimos 3 meses. >72 horas si no hay los antecedentes anteriores Recepción de la muestra Cuando se recibe una muestra en el laboratorio, un miembro cualificado de su personal tiene que confirmar que la información de la etiqueta de los tubos y la de la solicitud transfusional son idénticas. En caso de discrepancia o duda sobre la identidad del paciente se obtendrá una nueva muestra. Es totalmente inaceptable la corrección de una muestra incorrectamente identificada. Una vez verificado que no hay errores de identificación se dará un número de seguridad transfusional para cada tubo extraído y uno para la solicitud transfusional. Al recibir una muestra en el laboratorio se tiene que observar su aspecto. Si las muestras presentan un aspecto anómalo, el responsable médico decidirá si se acepta o se solicita nueva muestra. Las anomalías que se observan con más frecuencia son: Color anómalo del plasma: rojo, marrón o ámbar oscuro. Pueden indicar presencia de hemólisis. Muestra coagulada. Suero muy acuoso y hematocrito muy bajo. Puede ser debido a que la muestra se haya extraído de una línea de infusión y que la muestra esté diluida. 11

12 Las muestras mal identificadas, insuficientes o con aspecto anómalo se rechazarán y se obtendrá nueva muestra Almacenamiento de muestras después de la transfusión. - C un mínimo de 7 días Suero o plasma: tiempo no inferior a 10 días a una temperatura de - C El almacenamiento de las muestras del paciente y del donante (concentrado de hematíes) hace que sea posible repetir las pruebas o realizar pruebas adicionales si el paciente presenta una respuesta desfavorable a la transfusión. 4. Pruebas pretransfusionales: componente y receptor La realización de las pruebas pretransfusionales sirve para seleccionar para cada receptor los componentes sanguíneos más adecuados para que una vez transfundidos tengan una supervivencia óptima y no se produzca una destrucción clínicamente significativa de los hematíes del receptor. En las pruebas pre-transfusionals se incluyen: Identificación positiva del receptor y de la muestra de sangre de este. Revisión de los registros del servicio de transfusiones para buscar resultados previos de las muestras del receptor (historial receptor). Determinación de grupo ABO y Rh (D). Determinación de anticuerpos irregulares. Pruebas de compatibilidad con el suero o plasma del receptor y los hematíes del donante (pruebas cruzadas). Etiquetado de los componentes con la información del receptor. Realizar correctamente las pruebas pre-transfusionales asegura que se administre a un paciente los componentes sanguíneos designados, que estos componentes sean ABO compatibles y que se puedan detectar la mayoría de anticuerpos irregulares clínicamente significativos. 12

13 4.1. Identificación positiva del receptor y de la muestra de sangre. Cuando se realiza una extracción de sangre se tiene que identificar siempre al paciente de manera positiva comparando la información de la solicitud transfusional con la que obtendremos del paciente si está consciente y orientado. Si no, obtendremos la información de la pulsera del paciente o preguntando al DUI responsable o al acompañante. No se debe extraer la muestra si la información de la solicitud y la pulsera no coinciden 4.2. Revisión de los registros del servicio de transfusiones Las pruebas de compatibilidad han de incluir la comprobación de la historia serológica del receptor en los registros del servicio de transfusión. Se compararan ( si el paciente tiene ya historia transfusional anterior) los resultados actuales con los resultados anteriores del receptor: Grupo ABO / Rh (D), anticuerpos clínicamente significativos, dificultades en el estudio del paciente, las pruebas de compatibilidad realizadas, los componentes sanguíneos transfundidos, reacciones adversas a la transfusión, requisitos especiales de la transfusión y cualquier incidencia encontrada. Una de les informaciones más significativa que se puede obtener de los registros es la existencia de anticuerpos clínicamente significativos. La especificidad de los anticuerpos detectados en estudios anteriores ha de compararse con la de los anticuerpos que se detecten en el último estudio realizado Determinación del grupo ABO y Rh (D) El examen del grupo ABO debe incluir siempre una prueba sobre los hematíes que llamaremos parte o prueba globular, donde están los antígenos y otra sobre el suero que llamaremos parte o prueba sérica en la que se encuentran los anticuerpos. Estas dos partes son inseparables a la hora de clasificar el grupo sanguíneo. Si los resultados de ambas partes no son los esperados el grupo queda invalidado, deberán hacerse las investigaciones oportunas para averiguar las causas de dichas discrepancias hemático/séricas que ampliaremos más adelante. 13

14 En la parte globular enfrentaremos los reactivos correspondientes con los hematíes que queramos analizar ya sean del donante o receptor. Estos reactivos son comerciales y se denominan: Reactivo anti A que reaccionará con el antígeno A. Por lo tanto una reacción positiva significa que hay aglutinación entre antígeno y anticuerpo, de esta forma podemos decir que hay presencia de antígeno A. Si por el contrario no hay aglutinación y no se ven los hematíes aglutinados no hay antígeno A. Reactivo anti B que reaccionará con el antígeno B. Por lo tanto una reacción positiva significa que hay aglutinación entre antígeno y anticuerpo, de esta manera podemos decir que hay presencia del antígeno B. Si por el contrario no hay aglutinación y no se ven los hematíes aglutinados no hay antígeno B. Reactivo anti AB que reacciona en presencia del antígeno A y/o del antígeno B. Por lo tanto una reacción positiva indica presencia del antígeno A y/o B. Ejemplo de la aglutinación de la parte globular con los reactivos anti A, anti B i anti AB En la parte sérica enfrentaremos el suero del donante o receptor, con hematíes A y hematíes B cuya aglutinación indicará la existencia de 14

15 anticuerpos anti A y/o anticuerpos anti B en dicha parte sérica. Este resultado siempre será coherente con la parte globular, pero si no lo es estaremos ente una discrepancia sérica que deberemos de investigar para llegar a la correcta determinación del grupo sanguíneo. A continuación veremos unas imágenes que describen esta determinación al completo, es decir parte globular y parte sérica. Control Albúmina Reactivo anti D Aglutinación positiva Grupo O Parte globular Parte sérica Grupo AB Aglutinación negativa Aquí veríamos representada la opción manual con placa, pero habitualmente este proceso de determinación tanto del grupo como del Rh 15

16 está automatizado con máquinas que utilizan los mismos reactivos pero adaptados a la forma de tarjeta con microtubos. Esto lo vemos en la siguiente figura. GRUPO B POSITIVO Resultado positivo Resultado negativo Automatización de la determinación del grupo sanguíneo y Rh. Con tarjeta. Vemos representados los mismos reactivos. Aquí la interpretación positiva, es decir que existe aglutinación sería ver la línea de los hematíes arriba del todo y negativa abajo del todo. En esta figura vemos muy bien reflejadas las aglutinaciones que determinan que sea un B pos. En la parte globular aglutinan los hematíes B por lo tanto hay antígeno B y en la sérica aglutinan los anticuerpos anti A. Por lo tanto sigue el mismo patrón del grupo B. También vemos como aglutina el Rh cuya línea de hematíes está arriba del todo. El resultado final es de un B positivo. Los soportes utilizados en Banco de Sangre para la realización de las pruebas pueden ser: Tarjeta con microtubos Tubo de cristal Placa de opalina o plástico Tarjetas tipo cartulina Los indicadores de la reacción Ag-Ac más utilizados en banco de sangre son la aglutinación que tiene lugar cuando el Ac fijado se une a los hematíes adyacentes formando grumos visibles. 16

17 Aglutinación positiva que determina resultado positivo Aglutinación negativa que determina resultado negativo Los Acs IgM causan aglutinación con facilidad, sin embargo la sensibilización por Acs IgG no produce aglutinación porque la molécula es demasiado pequeña para cubrir la distancia entre hematíe y hematíe. Por ese motivo, para detectar la sensibilización IgG se utiliza la prueba de antiglobulina (prueba de coombs), que se fundamenta en la utilización de un suero antiglobulina humana que formará puentes de unión con las moléculas IgG o complemento ya fijadas a los hematíes actuando como puente y favoreciendo su aglutinación Estudio de la discrepancia sero-hemática Se produce una discrepancia cuando la interpretación de las pruebas de determinación del grupo hemático no coincide con el sérico. En estos casos deben anotarse los resultados discrepantes. La interpretación del grupo ABO debe retrasarse hasta que se resuelva la discrepancia. Si la sangre que se está analizando es una unidad de donante, no puede autorizarse para transfusión hasta resolver la discrepancia de resultados. Cuando la sangre proviene de un posible receptor, el estado clínico del paciente puede hacer necesario administrar hematíes del grupo O con factor Rh compatible antes de finalizar el estudio. Es importante obtener cantidades suficientes de sangre de un paciente antes de la transfusión para que puedan realizarse los estudios adicionales que puedan ser necesarios para resolver la discrepancia. Las discrepancias entre los resultados de las pruebas hemática y sérica pueden deberse: 17

18 Errores técnicos Los problemas técnicos pueden producir discrepancias en las pruebas ABO bien por la obtención de resultados negativos en lugar de positivos o positivos en lugar de negativos. Los problemas técnicos que producen falsos negativos en las pruebas ABO realizadas con hematíes o suero son debidas a: o No añadir suero o antisuero a una prueba. o Identificar la hemólisis como negativa. o Inadecuada relación suero (o antisuero)/hematíes. o Centrifugado incorrecto. o No incubar a temperatura de 20-25ºC o menos. o Uso de reactivos que no funcionen adecuadamente. o No interpretar o registrar los resultados correctamente. Los problemas técnicos que producen falsos positivos en la prueba incluyen: o Sobrecentrifugación o Uso de antisueros, hematíes o solución salina contaminados. o Uso de utensilios de vidrio sucios. o Interpretación o registro incorrecto de los resultados. Factores intrínsecos de los hematíes o o Las muestras obtenidas de pacientes que han recibido recientemente transfusiones o trasplante de médula ósea pueden dar lugar a reacciones inesperadas si contienen una mezcla de hematíes no homogéneos en cuanto a su grupo ABO. Las muestras de sangre de personas que han heredado variantes de genes A o B pueden tener antígenos débilmente expresados. También pueden detectarse antígenos débilmente expresados en los hematíes de algunos individuos con enfermedades como la leucemia. Las muestras de estos pacientes pueden no producir las reacciones esperadas en las pruebas de aglutinación directas con anti-a y anti-b. 18

19 o Las anomalías de naturaleza heredada o adquirida que conducen a lo que se llaman estados poliaglutinables pueden dar lugar a hematíes con membranas modificadas. Los hematíes modificados pueden aglutinarse inesperadamente por reactivos anti A, anti B o ambos. o Las concentraciones anormales de proteínas séricas, la presencia de macromoléculas (en muestras de sangre de cordón, la presencia de gelatina de Wharton), pueden producir agregaciones inespecíficas que simulan la aglutinación si se suspenden los hematíes en su propio suero. o Se ha observado que, en raras ocasiones, las concentraciones elevadas de sustancias del grupo A o B en suero inhiben la actividad de los antisueros de tal manera que se obtienen reacciones negativas inesperadas cuando se utilizan hematíes resuspendidos en suero o plasma. o Los sueros de algunas personas contienen anticuerpos contra los colorantes utilizados para colorear los reactivos anti A y anti B. Estos anticuerpos pueden producir falsos positivos en las reacciones de aglutinación si se suspenden los hematíes en suero o plasma para realizar la prueba. Factores intrínsecos del suero o Frecuentemente, en las pruebas de determinación del grupo ABO que utilizan plasma o suero no totalmente coagulado se producen pequeños coágulos de fibrina. Los coágulos de fibrina pueden interpretarse erróneamente por una aglutinación verdadera. o Los sueros de pacientes con concentraciones séricas anormalmente elevadas de proteínas anómalas, que presentan relación suero/proteínas alterada, o que han recibido expansores del plasma de elevado peso molecular o materiales de contraste intravenoso pueden dar lugar a una agregación inespecífica de los hematíes en las pruebas de determinación del 19

20 grupo sérico. Esta agregación es difícil de distinguir de una aglutinación verdadera. o La muestra puede contener anticuerpos distintos a los anti A y anti B que produzcan una aglutinación inesperada de los eritrocitos reactivos A y B. o Podemos obtener resultados falsos positivos si la muestra de la prueba contiene anticuerpos contra los constituyentes químicos de los diluyentes utilizados para conservar los hematíes A y B. La interacción entre los anticuerpos y las sustancias químicas produce reacciones inespecíficas con los hematíes que da lugar a reacciones inesperadas de aglutinación. o Pueden presentarse resultados débiles o negativos inesperados en las pruebas séricas si la muestra que se está analizando proviene de una persona inmunodeficiente debido a una enfermedad o tratamiento y tiene niveles descendidos de inmunoglobulinas. También pueden observarse pruebas ABO séricas débiles en muestras de pacientes ancianos cuyos niveles de anticuerpos han disminuido con la edad, y en muestras de pacientes cuyos anticuerpos se han diluido de manera importante en procedimientos de recambio plasmático (tema que veremos en otro capítulo). o Se observan resultados negativos o débiles en las pruebas séricas si se realizan con muestras de niños de menos de 4-6 meses de edad. Las pruebas séricas no se realizan de manera rutinaria con muestras de recién nacidos ya que los anticuerpos que contienen provienen generalmente de la transferencia in útero de la madre. o En las pruebas séricas, el suero del paciente puede contener anti-a y anti-b inusualmente potentes que fijan el componente C1 del complemento hasta tal punto que éste interfiere con la fijación del anticuerpo y la aglutinación. Este fenómeno ha sido publicado por un laboratorio en pruebas de detección de grupo en suero que utilizaban hematíes suspendidos en diluyentes sin EDTA. 20

21 Factores extrínsecos a la prueba Estarían relacionados con los problemas previos a la realización de la prueba como por ejemplo errores en la extracción del tubo, por no ser el tipo de tubo adecuado o la proporción hematíes anticoagulante. A continuación indicaremos unas pautas a seguir en cuanto a la resolución de discrepancias en función de cuál sea su posible causa Resolución de las discrepancias ABO Como muchas discrepancias son producto de errores técnicos, el primer paso a tener en cuenta para resolver el problema debe ser, simplemente, repetir la prueba con la misma muestra. Si se realizaran las pruebas iniciales con hematíes suspendidos en suero o plasma, la repetición debe incorporar hematíes lavados y resuspendidos en solución salina. Si persisten las discrepancias, pueden incorporarse los procedimientos siguientes a la investigación: Obtener una nueva muestra de sangre de la unidad de donante o del paciente y repetir las pruebas con la nueva muestra. Esto ayudará a identificar las discrepancias debidas a muestras mal etiquetadas o contaminadas. Lavar los hematíes problema para eliminar el suero que puedan producir reacciones positivas inesperadas Analizar los hematíes frente a anti-a, B, anti-a1 o anti-h, según corresponda al problema particular. Analizar el suero frente a hematíes del grupo A2 si se sospechan interferencias debidas a la presencia de anti-a1. Analizar los hematíes de grupo O de adultos, grupo O de cordón umbilical y hematíes autólogos para detectar interferencia de auto o alocrioaglutininas distintas a las anti A y anti B. Incubar los hematíes y suero a temperatura ambiente durante 30 minutos para facilitar la detección de antígenos o anticuerpos 21

22 débiles. Tambien pueden incubarse las pruebas a 4ºC siempre que se incluyan en paralelo los controles adecuados Resolución de discrepancias debidas a la ausencia de antígenos esperados Los hematíes de los grupos A y B normales presentan reacciones de aglutinación potentes en presencia de los anticuerpos reactivos respectivos. La potencia de las reacciones que se obtienen en las pruebas de determinación de grupo que utilizan hematíes o suero indica a menudo la causa de la discrepancia. Por ejemplo, un suero que no aglutina hematíes del grupo A pero aglutina fuertemente del grupo B sugiere que la muestra de la prueba pertenece al grupo A aunque los hematíes correspondientes no reaccionan con anti A y anti B. Como se ha dicho anteriormente, en personas que han heredado alelos variantes se producen discrepancias debidas a formas debilitadas de los antígenos A o B. Estas también se producen en pacientes con enfermedades que han producido una disminución de la actividad antigénica. En estos casos, los antígenos pueden deprimirse de tal manera que no serán detectados en las pruebas de aglutinación directas de rutina. Pueden utilizarse los siguientes procedimientos para facilitar la detección de antígenos débilmente expresados. Analizar los hematíes lavados con anti A y anti B durante 30 minutos a temperatura ambiente o a 4ºC. La prolongación de la incubación a temperatura ambiente o a 4ºC puede facilitar la detección de antígenos A o B débiles por antisueros reactivos. Tratar los hematíes del paciente con enzimas proteolíticos como papaína o bromelina. Estos enzimas potencian las reacciones, haciendo posible de esta manera visualizar más la reacción. Incubar una parte de los hematíes problema a temperatura ambiente con anti A o anti B (según la discrepancia) para adsorber el anticuerpo sobre los antígenos eritrocitarios. Una vez adsorbido lavar bien los hematíes y preparar un eluido. Analizar luego este eluido frente a hematíes de los grupos A, B y O. Si los hematíes 22

23 tienen el antígeno A, el eluido aglutinará los hematíes A, pero no los B u O. Analizar la presencia en saliva de sustancias A o B y H con el método para las pruebas de hemaglutinación-inhibición de antígenos salivares. La condición de secretor se refiere a la presencia o no de antígenos A B y H en las secreciones glandulares. Las personas Bombay tienen genes normales A y B pero no pueden producir sustancia H, precursora tanto del antígeno A como del B. En consecuencia, los eritrocitos Bombay no pueden producir antígeno A ni B de modo que su fenotipo aparente es O Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con anti A y anti B En algunos casos, se obtienen reacciones positivas inesperadas en las pruebas de determinación de grupo que utilizan hematíes. Por ejemplo, los hematíes de una muestra se aglutinan débilmente en pruebas con anti A aunque el suero correspondiente produjera las reacciones esperadas de un grupo B u O normal. Situaciones como esta pueden producirse por la herencia de un alelo variente en el locus ABO, o por otros problemas sin relación con las acciones de los genes ABO. A continuación haremos una breve descripción de aquellos casos que pueden conducir a la aparición de reacciones inesperadas en las pruebas de determinación de grupo y los pasos que pueden darse para identificar sus causas Fenotipo B adquirido El estado B adquirido debe considerarse cuando el suero de un paciente contiene anti B y sus hematíes parecen pertenecer al grupo AB con antígeno B débil. El fenotipo B adquirido se produce por modificación del antígeno A debida a la acción de enzimas microbianas denominadas desacetilasas. Los enzimas modifican los azúcares celulares A inmunodominantes (GalNAc) transformándolos en unidades más parecidas al azúcar B (Gal). 23

24 Los hematíes A son el único grupo que muestra in vivo actividad B adquirida. Cuando se encuentran presentes en número suficiente, los antígenos B adquiridos reaccionan con anti B humano en pruebas de aglutinación directas. Aunque muchos ejemplos de hematíes con antígenos B adquiridos reaccionan débilmente con anti B, pueden encontrarse algunos ejemplos que aglutinan con una gran intensidad. Para confirmar que los hematíes A tienen estructura de B adquirida debemos: Comprobar el diagnóstico del paciente. Los antígenos B adquiridos tienen tendencia a asociarse con el carcinoma de colón o recto, infección con microorganismos gramnegativos y obstrucciones intestinales. Analizar el suero del paciente frente a sus propios hematíes. El anti B en el suero del paciente no aglutinará sus propios hematíes si éstos tienen determinante B adquirido. Analizar los hematíes reactivo anti B monoclonal. Algunos reactivos monoclonales, a diferencia de los anticuerpos de origen humano, no reaccionan con el fenotipo B adquirido. Analizar los hematíes con suero anti B humano acidificado ya que los estos sueros no reaccionan con el receptor B adquirido. Si el paciente es un secretor, analizar la presencia de sustancias A y B en su saliva. Los pacientes con eritrocitos que tienen estructuras B adquiridas tendrán sustancia A, pero no B, en su saliva Antígenos A-like adquiridos Las discrepancias ABO se asocian a veces a poliaglutinación Tn. Los hematíes Tn-activados tienen glucoproteínas que incorporan oligosacáridos incorrectamente formados. Estas estructuras aparecen en caso de alteración genética en una célula madre hematopoyética que da lugar a la carencia de una glucosiltransferasa particular. Cuando se analizan hematíes Tn de los grupos O,B,Tn, pueden comportarse como si hubieran adquirido un antígeno de estructura parecida a la del antígeno 24

25 A que reacciona con reactivos anti A. El antígeno A-like de los hematíes Tn puede diferenciarse del A que se origina por la acción de una transferasa genética A si los hematíes se tratan con enzima proteolíticos antes de realizar la prueba. Los antígenos A-like de los hematíes Tn son destruidos por enzimas. Existen otras formas de poliaglutinación que pueden interferir con las pruebas de determinación del grupo ABO pero que debido a su complejidad y su baja frecuencia no es significativo comentarlas Aglutinación en campo mixto En algunos casos, se encuentran muestras que contienen dos poblaciones distintas y separables de hematíes. Normalmente se produce una mezcla cuando se transfunden hematíes O a un paciente de grupo A (o B). Las mezclas de hematíes también se producen en una condición que recibe el nombre de quimerismo. Una quimera es una muestra de sangre que contiene más de una población de hematíes. Hay quimeras naturales que son el resultado del intercambio intraútero del tejido eritropoyético entre gemelos vitelinos. Menos frecuentemente, se presenta cuando un paciente ha recibido un trasplante de médula ósea de un grupo ABO distinto del suyo propio. En estos casos, las pruebas para la determinación del grupo hemático pueden dar un patrón de aglutinación mixto. Las reacciones en campo mixto producidas por quimerismo pueden mantenerse durante todo la vida del donante. En caso de trasplante de médula ósea, la reacción mixta desaparecerá cuando se hayan eliminado de la circulación los hematíes propios del paciente. La aglutinación en campo mixto también puede observarse con hematíes que tienen antígenos A debilitados por enfermedades como la leucemia, o con hematíes Tn Hematíes recubiertos de anticuerpo Los hematíes de niños con enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), o de adultos afectos de anemia hemolítica autoinmune(ahai) o 25

26 reacciones hemolíticas post-transfusionales pueden estar recubiertos de moléculas de anticuerpo tipo IgG. Estos hematíes se aglutinan a menudo espontáneamente en presencia de reactivos ABO con un alto contenido en proteínas como el reactivo anti D dando aglutinaciones con falsos positivos. Deberemos utilizar técnicas de adsorción y elución para eliminar estos anticuerpos de los hematíes para que puedan analizarse de manera fiable con anti A y anti B. Los hematíes recubiertos de crioaglutininas IgM se aglutinarán espontáneamente en las pruebas realizadas con soluciones salinas. Si se lavan los hematíes varias veces con solución salina calentada a 37ºC, pueden eluirse los anticuerpos de las membranas eritrocitarias. Si la aglutinación por IgM no se anula mediante esta técnica, podemos utilizar otras soluciones como por ejemplo el DTT Resolución de las discrepancias por reacciones séricas inesperadas Ausencia de las reacciones séricas esperadas Los pacientes con enfermedades inmunodeficientes pueden no producir niveles detectables de anti A y anti B. Estos anticuerpos se encuentran también ausentes en el suero de los recién nacidos y de muchos pacientes ancianos. En estos casos, puede inferirse el grupo ABO sólo con las pruebas hemáticas Anti A1 El anti A1 en el suero de personas pertenecientes a los subgrupos A2, u otros puede aglutinar hematíes A1 en pruebas de determinación de grupo sérico. Para identificar el anti A1 como causa de la discrepancia haremos: Analizar el suero frente a varios ejemplos de hematíes A1, A2 y O (preferible 3 muestras de cada uno). El anticuerpo es anti A1, si solo aglutina todas las muestras de hematíes A1 y ninguna de las A2 y O. 26

27 Analizar los hematíes del portador del anticuerpo precedente con anti A1. El anti A1 puede hacer que las pruebas de compatibilidad con unidades A1 den resultados de incompatibilidad. En la mayoría de los casos estos anticuerpos sólo reaccionan a temperaturas inferiores a los 30ºC y se consideran clínicamente no significativos. Sin embargo, se han hallado casos que reaccionan a 37ºC. Los anticuerpos activos a esta temperatura deben considerarse clínicamente significativos. En estos casos sólo deben utilizarse para transfusiones los hematíes A2 u O Autoanticuerpos fríos Cuando crioaglutininas tienen potencia suficiente, pueden aglutinar hematíes de todos los adultos, incluyendo aquellos utilizados para preparar hematíes reactivos. Con pocas excepciones, la aglutinación producida por crioaglutininas es más débil que la producida por anti A o anti B. Pueden seguirse los pasos siguientes cuando la reactividad de las autoaglutininas interfiere hasta el punto de dificultar la interpretación: Calentar el suero y los hematíes reactivos a 37ºC antes de mezclarlos y realizar la prueba. Adsorber las crioaglutininas del suero mediante métodos de auto adsorción en frío, así el suero adsorbido puede analizarse frente a los hematíes reactivos A1 y B. Tratar el suero con DTT y analizarlo frente a hematíes reactivos A1 y B. Como el DTT destruye la actividad aglutinante de los anticuerpos IgM, las pruebas de determinación de grupo sérico que utilizan suero tratdo con DTT deben convertirse en pruebas AHG en las que detectaremos la presencia de anticuerpos de la forma IgG Aloanticuerpos inesperados Los aloanticuerpos inesperados reaccionan a temperatura ambiente y pueden aglutinar los hematíes reactivos utilizados en las pruebas de 27

28 detección de grupo sérico que tengan el antígeno correspondiente. Para determinar el grupo ABO correcto de los sueros que contengan otros aloanticuerpos fríos: Identificar el aloanticuerpo, tal como describiremos más adelante. Analizar los hematíes reactivos A y B para determinar qué reactivo tiene el antígeno correspondiente. Analizar el suero frente a hematíes A y B que no tengan el antígeno correspondiente. Por ejemplo, si tenemos identificado como aloanticuerpo un anti M, analizar el suero frente a hematíes A,M- y hematíes B,M-, es decir que ni los hematíes A ni B tengan el antígeno M, para resolver la discrepancia Rouleaux El suero de pacientes con concentraciones anormalmente elevadas de proteínas séricas, que presenta una alteración de la relación suero/proteínas o han recibido expansores de plasma de peso molecular elevado, pueden dar lugar a que los hematíes parezcan aglutinados. Algunas de estas muestras producen Rouleaux. Su formación puede reconocerse fácilmente al microscopio si los hematíes están agregados formando las llamadas pilas de monedas. Más frecuentemente, estos sueros producen agregados que se manifiestan como masas de formas irregulares muy parecidas a las masas aglutinadas por la acción de anticuerpos. Los resultados de las pruebas de determinación del grupo sérico pueden a menudo corregirse si se sigue el procedimiento siguiente: Diluir el suero para anular sus propiedades agregantes. Hacer una dilución ¼ del suero y analizar la dilución frente a hematíes autólogos. Si no se observa agregación, analizar el suero diluido frente a los hematíes reactivos. En la mayoría de los casos, aunque no en todos, los aloanticuerpos anti A y anti B reaccionarán a esta dilución. 28

29 5. La prueba cruzada y la investigación de anticuerpos irregulares Todas las pruebas pretransfusionales tienen como objetivo seleccionar para cada receptor potencial los componentes sanguíneos adecuados de forma que una vez transfundidos tengan una supervivencia óptima. Estas pruebas tienen su fundamento en que el organismo está dotado de un sistema inmunológico que reconoce los antígenos extraños y los distingue de los antígenos propios, desencadenando una respuesta inmune específica para dicho antígeno. Las premisas generales y que nunca debemos de pasar por alto son las siguientes: Asegurar siempre la compatibilidad ABO. Hablaremos de isogrupo si transfundimos el mismo grupo que el del receptor y compatible si no es el mismo grupo pero si compatible. Utilizar sangre del mismo grupo Rh, sobre todo en mujeres con edad fértil. En varones con escrutinio de anticuerpos irregulares negativo y sin antecedentes de anticuerpos anti Rh, según las disponibilidades del banco de sangre de tener sangre Rh- podremos transfundir distinto Rh, siempre bajo la supervisión hematológica. Cuando el donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y Rh, la transfusión es compatible el 98% de los casos. Para asegurar la compatibilidad en el 2% restante, son fundamentales : o El estudio de anticuerpos irregulares clínicamente importantes en el suero del receptor. o La prueba de compatibilidad directa entre el suero del receptor y los hematíes del donante. No debe olvidarse que la identificación inequívoca de las muestras de sangre, tanto del receptor potencial como del componente o los componentes a transfundir, es un aspecto fundamental, dado que la mayor parte de las reacciones hemolíticas tienen su origen en errores de identificación de muestras. La base de la compatibilidad es la identificación correcta del grupo ABO y Rh tanto en el donante como en el receptor. 29

30 5.1. Grupo ABO y Rh El grupo ABO y Rh debe realizarse en cada muestra recibida, y el resultado compararse con los registrados en estudios previos. Toda discrepancia entre la prueba sérica y hemática en el estudio del grupo ABO debe resolverse antes de realizar la transfusión. Si en el paciente se dan circunstancias que indican la transfusión con urgencia extrema, se transfundirán hematíes del grupo O y Rh Prueba cruzada La prueba cruzada tiene doble finalidad: Detectar incompatibilidad ABO entre bolsa y receptor Detectar incompatibilidad de anticuerpos entre bolsa y receptor. A menos que la situación sea urgente, generalmente se analiza el suero o plasma del receptor con hematíes del donante antes de administrar los hematíes; esto significa que se realiza una prueba cruzada mayor. La muestra debe obtenerse y etiquetarse de forma inequívoca y los hematíes del donante deben proceder de un segmento de tubo originario de la bolsa. Los métodos utilizados deben incluir aquéllos que demostraran incompatibilidad ABO y detectarán anticuerpos irregulares clínicamente significativos, y por lo tanto deben incluir también una prueba de antiglobulina o prueba coombs. No obstante, cuando no se detectan anticuerpos clínicamente significativos en las pruebas de escrutinio de anticuerpos, y siempre que el paciente no tenga historia de anticuerpos positivos, no es imprescindible la fase de antiglobulina en las pruebas de compatibilidad o prueba cruzada. Es raro detectar un anticuerpo clínicamente significativo en la fase de antiglobulina de las pruebas cruzadas cuando la prueba de detección de anticuerpos es negativa. La decisión de omitir la fase de antiglobulina de las pruebas de compatibilidad en pacientes que cumplen estos criterios debe ser establecida por criterio médico. Si se detectan anticuerpos cínicamente significativos en el procedimiento de escrutinio, es necesario realizar la fase de antiglobulina en la pruba cruzada. 30

31 Para detectar la presencia de Acs contra Ags eritrocitarios, en una primera fase de sensibilización se incuba el suero del paciente con los hematíes correspondientes para favorecer la unión Ag-Ac. En esta fase se puede aumentar la sensibilización de la técnica y disminuir los tiempos de incubación añadiendo distintos potenciadores (medio potencial iónico bajo ) o albúmina. Las pruebas para demostrar incompatibilidad ABO son siempre necesarias. El motivo más importante para realizar las pruebas cruzadas es que sirven como comprobación final de la compatibilidad del grupo sanguíneo ABO. No es necesario analizar los hematíes del receptor con el suero o plasma del donante, es decir realizar la prueba cruzada menor. Esta prueba no se utiliza en banco. Ya se han efectuado previamente pruebas de detección de anticuerpos en muestras de aquellos donantes con escrutinio de anticuerpos irregulares positivo. La mayoría de las muestras analizadas presentan un escrutinio de anticuerpos negativo, en estos casos la práctica habitual de la prueba cruzada recibe el nombre de salina inmediata, enfrentando suero del paciente con hematíes del receptor a temperatura ambiente con un tiempo corto de unos 5 minutos. El soporte para realizar la prueba cruzada puede ser en tubo o tarjeta coombs. En el soporte tubo se lleva a cabo la prueba cruzada en salina, es decir no incubamos el suero a 37ºC. Esta determinación en salina que es más rápida y sólo está indicada en receptores en los que no tenemos problemas de discrepancia con el grupo sanguíneo ni tenemos presencia de anticuerpos irregulares. Cuando tenemos un receptor con anticuerpos irregulares positivos la prueba cruzada se llevara a cabo en un medio de coombs a 37ºC ya sea en tubo o tarjeta para potenciar esta fijación del antígeno anticuerpo. Cuando se detecta e identifica un anticuerpo con significado clínico, se deben encontrar unidades negativas para ese antígeno para cruzarlas con el suero del paciente. 31

32 En enfermos previamente transfundidos, y sobre todo en los politransfundidos, debe recordarse la posibilidad de que una nueva transfusión genere una respuesta inmune secundaria y reacción hemolítica retardada; en ellos reviste especial importancia la relización de la prueba cruzada con suero obtenido en los horas antes, e idealmente en las 24 horas previas. Si la transfusión precedente fue incompatible en un enfermo sensibilizado con aloanticuerpos de bajo título, éstos pueden ser indetectables tanto en la prueba de escrutinio como en la prueba cruzada directa, y probablemente es más resolutivo realizar una prueba de antiglobulina directa en las pruebas pretransfusionales siguientes. Si se han identificado aloanticuerpos en el receptor, la sangre seleccionada para la prueba cruzada debe ser negativa para el antígeno correspondiente. No debe olvidarse que, además de la aglutinación, la hemólisis es un signo de incompatibilidad Escrutinio de anticuerpos Implica la investigación en el suero o en el plasma del receptor de anticuerpos frente a antígenos eritrocitarios (diferentes de las aglutininas naturales anti A y anti B), utilizando para ello tres suspensiones distintas de hematíes O, que deben poseer los antígenos eritrocitarios necesarios para detectar anticuerpos clínicamente importantes desde el punto de vista transfusional, es decir, capaces de inducir reacción hemolítica con acortamiento de la vida media de los hematíes transfundidos. 32

33 5.4. Identificación anticuerpos irregulares Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular en las pruebas, debe determinarse su especificidad y su significación clínica. Los aloanticuerpos irregulares son anticuerpos distintos de los anticuerpos naturales anti A y anti B. Estos aloanticuerpos se encuentran presentes aproximadamente en un 0,3-2% de la población, según el grupo de pacientes o donantes estudiados y la sensibilidad de los métodos utilizados. Algunos anticuerpos producen la destrucción de los hematíes en pocas horas o incluso minutos, mientras que otros acortan la supervivencia prevista en sólo unos pocos días. La determinación de la especificidad de los anticuerpos detectados en los análisis pretranfusionales es importante para valorar la necesidad de seleccionar para la transfusión sangre antígeno negativa. Los pacientes con anticuerpos clínicamente significativos deben recibir, siempre que sea posible, sangre que carezca del antígeno contra el que han hecho anticuerpos. Cuando se habla de identificación de anticuerpos irregulares, en Banco de sangre nos referimos a la realización de un panel. Este consiste en enfrentar el suero problema con hematíes, en este caso de 11 células más un autocontrol. Esta tabla la tenemos representada en la tabla siguiente. Estos paneles de hematíes pueden adquirirse en casas comerciales. En cada panel comercial se facilita una lista que recoge de forma detallada, el fenotipo de cada muestra de hematíes. Para que sea eficaz un panel de hematíes reactivos debe permitir identificar con confianza aquellos aloanticuerpos clínicamente significativos que se detectan con mayor frecuencia, como anti D, anti E, anti K y anti Fya. Es importante también conocer cómo reacciona el suero problema con los hematíes autólogos. Esto ayuda a determinar si están presentes aloanticuerpos, autoanticuerpos o ambos. A continuación presentamos una tabla con los diferentes sistemas antígenos distintos del ABO con su importancia clínica: 33

34 Sistema antigénico Aloanticuerpo Importancia clínica Rh (D, C/c, E/e) IgG HTR - EHRN Lewis (Lea/Leb) IgG-IgM Rara HTR Kell (Kell/k ) IgG HTR - EHRN Duffy (Fya/Fyb) IgG HTR - EHRN Kidd (Jka/Jkb) IgG HTR (a menudo tardía) EHRN (leve) I / i IgM Ninguna MN,Ss,U IgG/IgM EHRN rara anti-m; HDN-anti-S, anti-s HTR, reacción transfusional hemolítica; EHRN, enfermedad hemolítica del recién nacido. La identificación de anticuerpos irregulares la llevaremos a cabo en dos medios Medio de coombs con hematíes sin papainizar y con tarjeta coombs. Es un medio que se lleva a 37ºC. Medio enzimático utilizando hematíes papainizados con tarjeta neutra. Las técnicas enzimáticas más adecuadamente en las pruebas de identificación de anticuerpos que en las pruebas pre-transfusionales. Son especialmente útiles en los casos en los que se desea un aumento de la sensibilidad, como en el estudio de las reacciones posttransfusionales hemolíticas retardadas en las que ciertos anticuerpos pueden no ser detectados por otros métodos. No obstante, si se utiliza rutinariamente para la detección de anticuerpos un método enzimático, nunca debe ser la única técnica utilizada debido a que habitualmente se destruyen los antígenos M, N, S, Fya, Fyb y no se detectarían los anticuerpos contra estos antígenos. Todos los resultados obtenidos tanto positivos como negativos los registraremos en el folleto adjunto marcando la intensidad de los resultados positivos. La interpretación de estos resultados podríamos decir que consiste en ver el patrón de resultados con que patrón antigénico coincide, esto es en líneas 34

35 generales sin embargo hay que hacer una secuencia de pasos para resolver la identificación de estos aloanticuerpos. Estas secuencias las describimos a continuación: Autocontrol. Evaluar las reacciones de autocontrol. Si son negativas, se excluye la presencia de autoanticuerpos. Si son positivas, considerar la presencia de autoanticuerpos o aloanticuerpos producidos en respuesta a una transfusión previa reciente. Hematíes reactivos. No considerar inicialmente los antígenos presentes en las muestras no reactivas. Es decir no considerar inicialmente los resultados negativos. Hematíes autólogos. No considerar los anticuerpos contra antígenos presentes en los hematíes autólogos. Hematíes tratados con enzimas. Examinar los fenotipos de las muestras que reaccionan con los hematíes no tratados, pero no son reactivas (o más débiles) frente a hematíes tratados con enzimas. Patrón de reacción. Examinar los patrones de reacción en cada fase de la prueba, recordar las posibles especificaciones implicadas y considerar posibles especificaciones e relación a la fase de la prueba y el tipo de reactividad. Pruebas adicionales. Analizar un número suficiente de muestras de hematíes de fenotipo adecuado. Analizar el suero frente a hematíes con dosis doble de los antígenos contra los cuales el suero puede contener anticuerpos, si éstos no se encontraban presentes en las muestras anteriormente no reactivas. 6. Reacciones de sensibilización, aglutinación y prueba de la antiglobulina humana 6.1. Reacción antígeno-anticuerpo en inmunohematología: La interacción antígeno-anticuerpo puede ser detectada por diversas técnicas serológicas. Los métodos utilizados con mayor frecuencia en el banco de sangre tienen como resultado la hemólisis o la aglutinación de los hematíes. 35

36 La hemólisis de los hematíes se produce si se activa la secuencia completa del complemento después de la interacción antígeno- anticuerpo. Muchos anticuerpos activan el complemento, pero la secuencia se interrumpe a menudo a nivel de C3; por ello la lisis in vitro raras veces se produce. La aglutinación de los hematíes es el indicador de la reacción antígenoanticuerpo más comúnmente usado. Los anticuerpos aglutinan a los eritrocitos en 2 etapas: 1. La primera es la sensibilización, mediante la cual el anticuerpo se une físicamente al antígeno en la superficie del hematíe. 2. La segunda es la aglutinación. En ésta los hematíes, a los cuales los anticuerpos se unieron, aglutinan formando puentes entre ellos para crear una estructura de enrejado. Para que la sensibilización produzca aglutinación visible, es preciso que la porción Fab del anticuerpo pueda unirse a los hematíes adyacentes, para lo cual éstos deberán estar suficientemente próximos. 36

37 En algunas reacciones antígeno-anticuerpo las 2 etapas ocurren casi simultáneamente, mientras que en otras sólo ocurre la primera etapa de la reacción, es decir, hay sensibilización de los eritrocitos por anticuerpos no aglutinantes. La sensibilización por IgG no produce aglutinación debido a que la molécula de anticuerpo es demasiado pequeña para cubrir la distancia entre hematíe y hematíe. Por lo contrario, la molécula de IgM puede causar la aglutinación con facilidad. Para que tenga lugar la aglutinación deben ser vencidas las fuerzas de repulsión que normalmente mantienen separados los hematíes Teoría del potencial Zeta En inmunohematología eritrocitaria, el fenómeno de aglutinación de los glóbulos rojos producido por la reacción entre anticuerpos y antígenos de grupos sanguíneos, constituye la base de casi todas las técnicas aplicadas en la serologia de los grupos sanguíneos. 37

38 Existen varias teorías para explicar por qué los hematíes no aglutinan en condiciones normales. La teoría del potencial Zeta, es la más aceptada. Para la comprensión de los fenómenos de hemoaglutinación, necesitamos de un modelo más complejo, con base en procesos físico-químicos, donde el factor más importante a ser considerado es la distancia media que separa los glóbulos en suspensión. Esta distancia puede ser disminuida por la adición de anticuerpos u otras substancias al medio, hasta un punto crítico en que la aglutinación ocurre. Los glóbulos rojos se comportan como partículas electronegativas. Los grupos carboxílicos de las sialo-glucoproteínas (ácido siálico ) de la membrana eritrocitaria son los mayores responsables de esta electronegatividad. En medio salino (NaCl al 0,85%), los iones positivos de sodio (Na+) son atraídos por las cargas negativas de los glóbulos rojos, creando una nube de cargas positivas, que genera una fuerte repulsión interglobular. La nube de iones positivos que involucra cada glóbulo, se vuelve menos densa mientras se aleja del glóbulo. La diferencia de potencial eléctrico creada entre la nube de iones positivos (Na+) cerca del glóbulo y el medio con iones de sodio y cloruro en equilibrio (neutro), se llama Potencial Zeta. La fuerza de repulsión entre los glóbulos rojos, en medio salino, depende del valor del potencial zeta. 38

39 Considerando la carga eléctrica del glóbulo rojo, la fuerza iónica del medio de la suspensión ( ) y la constante dieléctrica del medio, Pollack desarrolló la siguiente expresión del potencial zeta (Z): Z = f, o sea, la diferencia del potencial zeta es una función que varia directamente con la electronegatividad de la membrana eritrocitaria e inversamente con la constante dieléctrica del medio de suspensión (D) y con la raíz cuadrada de su fuerza iónica ( u). Desde el punto de vista físico-químico, la aglutinación ocurre por la agregación de los glóbulos rojos (aglutinados), cuando la distancia media entre ellos se reduce hasta un valor mínimo. Esta distancia depende de los valores de dos fuerzas antagónicas: la tensión interfacial (fuerza de cohesión), que tiende a agregar los glóbulos rojos y la fuerza de repulsión, debida a los escudos de cargas positivas creados alrededor de los glóbulos (cargas iguales se repelen). En la ausencia de agentes aglutinantes, la fuerza de repulsión predomina y mantienen la suspensión globular estable en medio salino. El potencial Zeta de un sistema puede ser cambiado de dos maneras: Por la reducción de la carga eléctrica de la membrana eritrocitaria: Se incluye en esta categoría, los efectos debidos al tratamiento de los glóbulos rojos con enzimas proteolíticas, que sacan fragmentos de glucoproteínas de la membrana, reduciendo su electronegatividad y al efecto de la fijación de anticuerpos sobre la membrana eritrocitaria. Cambios en la composición del medio: 39

40 Los efectos debidos a los cambios de la fuerza iónica y de la constante dieléctrica del sistema. La aglutinabilidad de un sistema es más alta mientras más bajo sea el valor del potencial Zeta. Los cambios indicados pueden afectar a la sensibilización y a la aglutinación. Si se disminuye la densidad de la nube de cationes, los anticuerpos pueden acercarse más fácilmente a la superficie de los hematíes, favoreciendo así a la sensibilización de los mismos. La reducción del potencial Zeta permite un mayor acercamiento entre los hematíes, con lo cual se facilita la aglutinación. 40

41 6.3. Factores que influyen sobre la sensibilización de los hematíes Proporción relativa del antígeno y del anticuerpo La velocidad de formación del complejo antígeno-anticuerpo varía con el número de moléculas de anticuerpo presentes en el medio y con el número de sitios antigénicos presentes en cada célula. Al aumentar la cantidad de anticuerpos en el medio puede aumentar la sensibilidad de la prueba, asimismo, al aumentar la proporción de suero (que contiene el anticuerpo) en relación con los hematíes (que contienen el antígeno) se proveen más anticuerpos por zonas antigénicas ph del medio donde se produce la reacción El punto isoeléctrico de la mayoría de los anticuerpos es aproximadamente 7,5. A un ph inferior al punto isoeléctrico el anticuerpo tiene carga positiva. Esto facilita su unión con los eritrocitos (carga negativa). Anticuerpos como los anti-m reaccionan mejor a ph bajo, y para los anti-d se reporta el ph óptimo entre 6,5 y 7,0. Por esta razón el ph óptimo para la sensibilización está entre 6,5 y 7, Temperatura La mayoría de los anticuerpos de grupos sanguíneos reaccionan en un rango restringido de temperatura. Las reacciones antígeno anticuerpo son exotérmicas; por lo tanto, a temperaturas más bajas la velocidad de reacción disminuye y existe menor grado de fijación de anticuerpo. Los anticuerpos de la clase IgM son más reactivos a bajas temperaturas (4-27 C), mientras que los de la clase IgG lo son a 37 C. Por este motivo, las técnicas de detección de anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de C ó C. La temperatura también puede afectar la accesibilidad del antígeno situado en la membrana del glóbulo rojo. Algunos anticuerpos del tipo IgM se fijan a sus correspondientes antígenos a temperaturas inferiores a 37 ºC. Dichos anticuerpos se denominan anticuerpos fríos. 41

42 Esta influencia de la temperatura se explica porque dependiendo de la misma, se producen cambios de configuración en el antígeno. Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de 37 C, no se consideran clínicamente significativos y rara vez destruyen eritrocitos transfundidos. Algunos anticuerpos de la clase IgM pueden activar el complemento a temperaturas por debajo de 30 C, pero sólo acortan de forma mínima la supervivencia de eritrocitos incompatibles transfundidos. Los anticuerpos clínicamente significativos son aquellos que tienen actividad in vivo que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 C. Anticuerpos fríos Potencial iónico del medio En una solución salina normal, los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de las moléculas de antígeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas opuestas. Cuando los hematíes están en suspensión salina de bajo potencial iónico, la nube de cationes que rodea a los hematíes es menos densa. La concentración disminuida de cationes alrededor de los glóbulos rojos permite a las moléculas de anticuerpo tener más fácil acceso a los lugares antigénicos de la membrana eritrocitaria, aumentando así la tasa de sensibilización Factores que influyen sobre la aglutinación de los hematíes. La aglutinación se produce cuando los hematíes están lo bastante próximos para permitir a una molécula de anticuerpo hacer de puente entre células adyacentes. Este proceso puede estar afectado por varios factores entre los que 42

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