NUEVAS APORTACIONES A LA AUTOMATIZACIÓN ANALÍTICA Y A LA TECNOLOGÍA DE LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS E INDUSTRIAS DERIVADAS

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1 NUEVAS APORTACIONES A LA AUTOMATIZACIÓN ANALÍTICA Y A LA TECNOLOGÍA DE LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS E INDUSTRIAS DERIVADAS Tesis Doctoral José González Rodríguez Córdoba, Julio 2003

2 Universidad de Córdoba Facultad de Ciencias Departamento de Química Analítica NUEVAS APORTACIONES A LA AUTOMATIZACIÓN ANALÍTICA Y A LA TECNOLOGÍA DE LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS E INDUSTRIAS DERIVADAS José González Rodríguez Córdoba, Julio 2003

3 NUEVAS APORTACIONES A LA AUTOMATIZACIÓN ANALÍTICA Y A LA TECNOLOGÍA DE LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS E INDUSTRIAS DERIVADAS por José González Rodríguez Co-directora Co-director Fdo.: María Dolores Luque de Castro, Catedrática del Departamento de Química Analítica, Universidad de Córdoba Fdo.: Pedro Manuel Pérez Juan Doctor por la Universidad de Córdoba Trabajo presentado para optar al grado de Doctor en Ciencias, Sección Químicas Fdo.: José González Rodríguez Licenciado en Ciencias Químicas

4 María Dolores Luque de Castro, Catedrática del Departamento de Química Analítica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Córdoba, en calidad de Directora de la Tesis Doctoral presentada por el Licenciado en Ciencias Químicas José González Rodríguez, con el título Nuevas aportaciones a la automatización analítica y a la tecnología de las bebidas alcohólicas e industrias derivadas Certifica: Que la citada Tesis Doctoral se ha realizado en los laboratorios del Departamento de Química Analítica y Ecología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Córdoba y en los de la Empresa Pérez Barquero, S.A., y que, a su juicio, reúne los requisitos necesarios exigidos en este tipo de trabajos y para que conste y surta los efectos pertinentes, expide el presente certificado en Córdoba a ocho de mayo de dos mil tres. Fdo: María Dolores Luque de Castro

5 A la Prof. Dra. Dª María Dolores Luque de Castro, Directora de este trabajo, por su guía, paciencia y constante afán por mostrarme el buen hacer en el ámbito de la Ciencia y, sobre todo, por darme la oportunidad de cumplir el sueño de realizar mi Tesis en un momento en el que este sueño se alejaba definitivamente. Al Dr. Pedro Manuel Pérez Juan, Director de este trabajo, por su constante apoyo, estímulo y por mostrarme los vericuetos del mundo de la Empresa durante el tiempo que hemos permanecido juntos. Al personal de la Empresa Pérez Barquero S.A., con el que he compartido muchos momentos de trabajo y que me han mostrado con afecto cómo trabajar en una Empresa. A todos los miembros del Departamento de Química Analítica que han recorrido junto a mí todo o parte de este largo camino hacia mi formación científica. Y en especial, a mi familia que durante toda mi vida me ha apoyado en cuantos sueños, locos o no, me he embarcado, tan solo guiada por su amor y confianza en mí. A todos GRACIAS, por que sin vosotros jamás habría recorrido este largo camino.

6 Quisiera mostrar mi reconocimiento especial a las Acciones MIT, del programa PACTI del Plan Nacional de I+D, de Formación de Personal Investigador del Ministerio de Ciencia y Tecnología por la concesión de una Beca para el Intercambio de Personal entre Industrias y Centros Públicos de Investigación, gracias a la cual ha podido realizarse esta Tesis Doctoral.

7 Índice

8 Indice Objetivos Introducción Introducción Métodos de análisis para el control de parámetros enológicos Herramientas quimiométricas La técnica de inyección en flujo La pervaporación analítica La extracción con fluidos sobrecalentados Glosario Bibliografía Parte experimental Automatización de métodos analíticos monoparamétricos para su uso en el seguimiento de la elaboración de vinos Capítulo I Uso del análisis por inyección en flujo para la medida durante la vinificación del nitrógeno fácilmente asimilable Capítulo II Determinación mediante inyección en flujo de catequinas totales y procianidinas en vino blanco y tinto

9 José González Rodríguez Tesis Doctoral Capítulo III Determinación de etanol en bebidas mediante inyección en flujo, pervaporación y medidas de densidad Capítulo IV Método semiautomático basado en inyección en flujo para la determinación de la acidez volátil en vinos Automatización de métodos analíticos multiparamétricos para su uso en el seguimiento de la elaboración de vinos Capítulo V Método para la determinación simultánea de los índices de polifenoles totales y antocianos mediante inyección en flujo Capítulo VI Método para el seguimiento de urea y amonio en vino y mosto basado en inyección en flujopervaporación Automatización de métodos analíticos multiparamétricos para su uso en el seguimiento de la elaboración de vinagres Capítulo VII Determinación biparamétrica en vinagre mediante un sistema de inyección en flujo acoplado a un pervaporador Capítulo VIII Determinación de hierro y metanol en vinagre mediante un sistema de inyección en flujo acoplado a un pervaporador

10 Indice Fluidos sobrecalentados para la obtención de extractos de interés en enología sdfd Capítulo IX Extracción de compuestos de la madera utilizando fluidos sobrecalentados Capítulo X Uso de fluidos sobrecalentados para la extracción de compuestos no volátiles de la madera Capítulo XI Utilización de líquidos sobrecalentados para la extracción de compuestos de interés en residuos sólidos procedentes de la vendimia Discusión Conclusiones Anexos Anexo I: Comunicaciones a congresos Anexo II: Solic itud de patente de invención

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12 Objetivos

13 Objetivos Los métodos analíticos, habituales o de referencia, actualmente utilizados en los laboratorios de seguimiento y control de la industria enológica requieren una constante intervención del operador y son lentos; por lo que proporcionan una baja frecuencia de análisis. Por sus características no son apropiados para un potencial seguimiento y control en tiempo real de los procesos enológicos. El Grupo de Investigación en el que se ha desarrollado el trabajo recogido en esta Memoria ha puesto a punto un número significativo de métodos automáticos basados en la técnica de inyección en flujo con aplicación en la industria enológica y en las derivadas. Se plantea la necesidad de completar la gama de los parámetros automatizados y la validación de algunos de los puestos a punto previamente. Por otra parte, los fluidos sobrecalentados han sido ampliamente utilizados por el Grupo para la obtención de extractos de diferente naturaleza. Sin embargo, no se había contemplado el uso de materias primas como la madera de roble o los residuos sólidos de la vinificación. Esta Memoria recoge la investigación realizada con el objetivo genérico de introducir mejoras significativas en la industria enológica y en las derivadas, ampliamente extendidas en la Comunidad Andaluza y que adolecen de una adecuada captación de los recientes avances en Química Analítica (automatización especialmente, pero también técnicas de separación y detección recientes, nuevos reactivos derivatizantes, etc.) y de un aprovechamiento inteligente de los residuos que generan (orujos frescos o fermentados, lías, fangos, e incluso los residuos de la poda), que podrían destinarse a la obtención de productos con elevado valor añadido y de aplicación en otros campos, o para una obtención menos costosa y más racional de productos de aplicación en estas industrias. Por tanto, del objetivo genérico se generan dos objetivos concretos: 1) Desarrollo de métodos analíticos dotados de las características adecuadas para sustituir a los métodos de referencia usuales en los laboratorios de las 19

14 José González Rodríguez Tesis Doctoral bodegas. El objetivo final era disponer de métodos lo suficientemente rápidos, precisos y sin asistencia de operador, que permitieran un seguimiento más frecuente, si no continuo, de los parámetros en evolución; de forma que, en último término, una respuesta en tiempo real, permitiera una actuación rápida sobre el proceso en el momento preciso. Este objetivo, que también lo fue de una tesis doctoral previamente desarrollada en el Grupo de Investigación, ha pretendido completar el número de métodos automáticos con los que sustituir prácticamente todos los métodos usuales en las bodegas para lo que se considera indispensable una exhaustiva validación que haga posible su aplicación con entera confianza. Para cumplimentar este objetivo se ha hecho uso de la técnica de inyección en flujo automatización, pervaporación técnica de separación reciente y de aquellos sistemas de detección que se han considerado más adecuados en cada caso para el desarrollo de métodos de determinación de uno o varios compuestos o familias de compuestos. Una mínima complejidad de los métodos y equipos para hacerlos asequibles a cualquier operador no cualificado, ha sido otra de las bases de la investigación realizada. 2) Aprovechamiento de residuos y obtención de productos de interés en industrias de bebidas alcohólicas, ambos englobados en un único bloque tecnológico y cuyo objetivo final era el de conseguir mayores beneficios para la industria en cuestión. El denominador común en este caso ha sido la extracción con fluidos sobrecalentados, que se ha utilizado con dos fines: 1) la obtención de extractos de madera con los que aportar aspectos sensoriales distintivos a las bebidas alcohólicas. 2) La extracción de compuestos de interés alimentario, farmacológico y fitosanitario del orujo de uva; tanto tratado de forma global, como con separación previa en fracciones a saber, 20

15 Objetivos pepitas, hollejo y raspón. La investigación correspondiente a este bloque se pretende que sea el punto de partida para una más amplia y exhaustiva que, tras un desarrollo a escala de planta piloto, se extrapole a escala industrial. 21

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17 Introducción

18 Introducción 1. Introducción La elaboración del vino, así como la de los vinagres y brandies, presenta una elevada complejidad físico-química, tanto por la composición de la materia prima como por la gran variedad de compuestos que en mayor o menor grado participan en las características organolépticas del producto final. Tecnológicamente se desarrolla en diferentes etapas que incluyen tratamientos, procesos de control de los productos de entrada, salida de éstos y mezcla con diversos aditivos y coadyuvantes tecnológicos. Bajo cualquiera de los puntos de vista físico-químico y tecnológico es preciso establecer intervalos cuantitativos de una serie de parámetros analíticos básicos que permitan un seguimiento y control óptimo del proceso. Desde un enfoque muy general, y con las diferencias propias de la vinificación en blanco y en tinto, el diagrama de flujo del proceso (Fig. I.1) consta de una serie de etapas como son la recepción de la uva, la prefermentación, la fermentación, la postfermentación y las operaciones de acabado Recepción de la uva En el proceso de recepción de la uva se realizan los controles previos en los que, básicamente, se analiza su estado sanitario y su grado alcohólico potencial. Con respecto a la recogida y al transporte, la uva debe llegar al lagar con la mayor integridad física posible para evitar maceraciones incontroladas, oxidaciones e incluso inicio de la fermentación Prefermentación En esta etapa se incluyen los tratamientos físico-químicos aplicados a la uva desde su recolección hasta el comienzo de la fermentación alcohólica. Los objetivos perseguidos en esta etapa son: la descomposición de la integridad del racimo y la 25

19 José González Rodríguez Tesis Doctoral extracción del mosto del interior de la uva para, según el caso, limitar o favorecer el contacto del mosto con las partes sólidas de la vendimia. En el caso de vinificación en blanco la clarificación del mosto es más o menos intensa, con la posible adición de determinados coadyuvantes tecnológicos (enzimas o distintos clarificantes) y una posterior corrección química del mosto, que permite obtener un sustrato idóneo para el desarrollo óptimo de la fermentación y una composición del mismo compatible con el objetivo enológico establecido previamente. Se pueden distinguir las siguientes subetapas: el tratamiento mecánico de la uva, el desfangado en el caso de la vinificación en blanco y las correcciones (incluida la adición de sulfuroso) Tratamiento mecánico de la uva El tratamiento mecánico de la uva incluye no sólo las posibles operaciones físicas realizadas en la bodega (despalillado, estrujado, escurrido, prensado y bombeo), sino también todas las que se llevan a cabo en la uva desde el momento del corte del racimo: la posible recolección mecanizada, el transporte y la recepción en el lagar Desfangado de los mostos El desfangado es una operación de prefermentación exclusiva de la vinificación en blanco y consiste básicamente en retirar del mosto recién obtenido una gran cantidad de partículas en suspensión de diferente naturaleza y tamaño: fragmentos vegetales procedentes de las partes sólidas del racimo, restos de tierra, microorganismos y polímeros orgánicos de gran tamaño. Su realización supone unas ganancias cualitativas potenciales muy grandes ya que la turbidez influye negativamente en el aroma, el color, la astringencia y la susceptibilidad a la oxidación de los vinos blancos. Sin embargo, una excesiva limpidez en los mostos tampoco es aconsejable debido a tres razones fundamentales: originan finales de fermentación difíciles, el aroma varietal puede enmascararse por un exceso de ésteres producidos durante la 26

20 Introducción fermentación alcohólica y, finalmente, en estas condiciones algunas cepas de levaduras generan cantidades anormalmente elevadas de acidez volátil. Por tanto, los mostos deben poseer un grado óptimo de limpidez, que establezca un equilibrio entre los componentes positivos y los negativos antes descritos. RECEPCIÓN DE LA UVA Aditivos y coadyuvantes PREFERMENTACIÓN FERMENTACIÓN POSTFERMENTACIÓN RESIDUOS VINO BRANDY VINAGRE Fig.I.1. Operaciones básicas en la producción de vinos y derivados. 27

21 José González Rodríguez Tesis Doctoral El desfangado puede llevarse a cabo por métodos físicos exclusivamente o por su combinación con diferentes coadyuvantes tecnológicos de acción clarificante de origen orgánico (gelatina) o inorgánico (bentonita o sol de sílice). También es cada vez más frecuente la adición de enzimas de acción pectolítica que facilitan y aceleran este proceso Correcciones Con frecuencia, el mosto presenta desequilibrios en algunos de sus componentes que afectan directamente a la calidad del producto que se quiere elaborar. Las alteraciones más generales y significativas se refieren a los contenidos en azúcares y acidez, y están relacionados con el grado de madurez. Unas condiciones de maduración deficiente dan lugar a alta acidez y bajo contenido en azúcares; las de sobremaduración a baja acidez y alta concentración en azúcares. En climas frescos, donde la maduración se ve limitada, las correcciones aplicadas son la chaptalización y la desacidificación; mientras que en climas cálidos, donde el azúcar está asegurado, pero la acidez puede caer hasta valores inferiores a 3 g/l y el ph elevarse hasta 3.9, es indispensable una corrección con ácido tartárico hasta niveles óptimos (3,3). Otra deficiencia bastante general en mosto es la del nitrógeno fácilmente asimilable, que puede limitar de forma drástica el progreso de la fermentación alcohólica. La corrección se lleva a cabo por la adición de activantes, cuya composición más frecuente es una mezcla de sales amónicas y tiamina, a la que se le añaden levaduras inertes. En el apartado de las correcciones del mosto puede considerarse el sulfitado. La adición de este antioxidante en vinificación tiene cuatro efectos fundamentales: - La protección frente a las oxidaciones. El sulfuroso, por sus características reductoras y de inhibición de las oxidasas, protege a la uva estrujada, al mosto y al 28

22 Introducción vino de las oxidaciones químicas y de las enzimáticas. Estas funciones antioxidantes las realiza la forma bisulfito. - La acción antiséptica selectiva frente a los microorganismos. Los más sensibles a este efecto son las bacterias, los mohos y las levaduras de bajo potencial alcohólico. Las levaduras más interesantes en vinificación S. Cerevisiae y S. Bayanus son resistentes a esta acción. El efecto antiséptico del sulfuroso corresponde a la forma molecular, cuya concentración depende de la de sulfuroso libre, del ph y del grado alcohólico. - El poder disolvente de la materia colorante de las uvas. En dosis normales esta propiedad está más relacionada con la inhibición de las oxidasas que con una verdadera extracción del color. - La acción coadyuvante para el desfangado de mostos en la vinificación en blanco. Este efecto se debe realmente a la acción antiséptica antes descrita, ya que con ella se produce un retraso en el inicio de la fermentación y, con ello, se facilitan la caída de los turbios y los procesos de floculación Fermentación Dentro del apartado de la fermentación se incluyen tanto la fermentación alcohólica como la maloláctica. La primera se lleva a cabo por levaduras y la segunda por bacterias lácticas. Según se trate de la vinificación en blanco o en tinto, la fermentación alcohólica se lleva a cabo en ausencia o en presencia, respectivamente, de componentes sólidos de la vendimia (hollejos, pulpa y pepitas). Por tanto, en este último caso, además del consumo de azúcares que caracteriza a este proceso fermentativo, tiene lugar un proceso de maceración que da lugar a un enriquecimiento del medio en compuestos fenólicos. Factores tales como el tiempo 29

23 José González Rodríguez Tesis Doctoral de maceración y la temperatura influyen de forma determinante en este proceso de extracción. Aunque el mecanismo químico de la fermentación alcohólica es muy complejo, se puede definir de forma muy simplificada como la transformación exotérmica del azúcar en alcohol, anhídrido carbónico y una serie de productos secundarios como glicerina, ácido succínico, ácido acético, ácido láctico, butilenglicol, acetaldehído, ácido pirúvico, alcoholes superiores y un gran número de sustancias diversas presentes en cantidades mínimas. Este proceso debe ser rápido y efectivo, evitándose toda parada de la fermentación que facilitaría el ataque bacteriano de los azúcares. La estabilidad biológica del vino no se alcanza totalmente, aunque sí en gran medida, por el consumo de la práctica totalidad de los azúcares presentes. En la fase final de la fermentación alcohólica, o después de ésta, puede desarrollarse un segundo proceso microbiano: la fermentación maloláctica. Esta transformación constituye una verdadera desacidificación biológica del vino, que provoca no sólo un incremento del ph, sino también un cambio en la calidad sensorial del vino, ya que tiene lugar una transformación de un ácido más fuerte y de sabor pronunciado como es el ácido L-málico, en otro más débil y de sabor más suave: el ácido L- láctico. Los factores físic os, tales como la temperatura ambiente, y los químicos como el ph, la concentración de sulfuroso o la de nutrientes, entre otros, condicionan de forma significativa la actividad de los microorganismos participantes en los dos procesos antes indicados y, como consecuencia, condicionan la composición final de los vinos y sus propiedades organolépticas. También tienen un papel determinante las decisiones tomadas por el enólogo de facilitar o condicionar, según el tipo de vino de que se trate, los diferentes procesos que tienen lugar. Así, puede detenerse la fermentación alcohólica para la obtención de un vino con un resto 30

24 Introducción de azúcar, o limitar la fermentación maloláctica de los vinos blancos jóvenes producidos en zonas cálidas. Destaca en este sentido el papel que juega la temperatura a la que se realiza la fermentación alcohólica. Las altas temperaturas no sólo favorecen el picado láctico, que se acusaría en el caso extremo de la parada del proceso, sino que provoca también una pérdida considerable de la fracció n aromática del vino. Las bajas temperaturas, en el caso de la vinificación en tinto, no favorecen los procesos de extracción sólido-líquido que tienen lugar simultáneamente con la fermentación. Por tanto, hay que elegir un valor óptimo de esta variable compatible con la calidad organoléptica y el tipo de vino de que se trate. El proceso de fermentación es una etapa en la que puede tener lugar la entrada de componentes externos. Así, con respecto a la microbiota del proceso, se utilizan usualmente levaduras y bacterias lácticas seleccionadas que determinan las características del producto acabado. Los aditivos y coadyuvantes se añaden en función del objetivo enológico y las características de la materia prima: adición de enzimas y tanino en la vinificación en tinto, y la de caseína y/o bentonita en la elaboración en blanco Postfermentación Se agrupan en este apartado todas las operaciones que se realizan después del proceso de la fermentación y que, como es el caso de la clarificación y la filtración, tienen el mismo fundamento tecnológico. Presenta diferencias cualitativas y cuantitativas según el tipo de vino obtenido y el destino que se le dé (almacenamiento temporal, envejecimiento y/o salida inmediata al mercado). Estas operaciones son los trasiegos, la clarificación, la filtración y la estabilización. Para su desarrollo se utilizan distintos aditivos y coadyuvantes tecnológicos (clarificantes 31

25 José González Rodríguez Tesis Doctoral de origen proteico, inorgánico, sustratos para la filtración, distintas sustancias estabilizantes, etc.) que en ocasiones pueden modificar sustancialmente las características sensoriales de los vinos producidos. Mediante los trasiegos se eliminan tanto los depósitos de lías de fermentación, como aquéllos que aparecen durante la clarificación espontánea de los vinos jóvenes, y que son consecuencia de las reacciones que se desarrollan hasta que se alcanza el equilibrio químico entre sus componentes. La clarificación permite alcanzar un elevado grado de limpidez en el vino, cuya intensidad dependerá de su destino inmediato: conservación, envejecimiento o salida al mercado. Las técnicas de clarificación son de dos tipos: la clarificación química o encolado y la clarificación física. Estas operaciones se aplican normalmente de forma secuencial, ya que una correcta clarificación química acelera y disminuye los costes de los procesos físicos posteriores. En el encolado se añade al vino una sustancia coloidal, normalmente de naturaleza proteica, que provoca la floculación y precipitación de las partículas en suspensión. En la clarificación física, la eliminación de estas partículas se lleva a cabo mediante filtración o centrifugación. Las prácticas de estabilización físicas (tratamiento por frío y pasteurización) o químicas (adición de diversos compuestos estabilizantes como el ácido cítrico, ácido m-tartárico, goma arábiga, etc.) tienen como objetivo mantener en el tiempo, especialmente cuando el vino se encuentre en el mercado, la limpidez alcanzada con los procesos de clarificación. Entre todas las operaciones postfermentativas que puede sufrir un vino, destaca el envejecimiento, debido a su radical influencia en las características físicoquímicas y sensoriales del vino. Se puede establecer una clasificación del envejecimiento en función de la causa que lo provoca: envejecimiento biológico, crianza biológica o crianza bajo velo de flor, que tiene su origen en la acción de 32

26 Introducción determinadas levaduras del género Saccharomyces en la superficie del vino y el envejecimiento físico-químico, debido exclusivamente a reacciones redox entre las sustancias presentes en el vino. Además, y debido a que normalmente el envejecimiento se realiza en envases de madera, durante su desarrollo se produce una extracción por el vino de sustancias de distinta naturaleza química que contribuyen, no sólo a las cualidades sensoriales del vino, sino también a su estabilidad físico-química y evolución posterior. Lógicamente, son determinantes del proceso el tipo de madera utilizada, el tratamiento recibido previo a su uso (tostado) y las condiciones ambientales en las que se lleva a cabo (temperatura y humedad ambientales) Productos derivados El vino en cualquier momento de la etapa de postfermentación puede convertirse en la materia prima de dos productos derivados de gran interés comercial: el vinagre de vino y el brandy. El vinagre se obtiene por la acción de diferentes géneros de bacterias acéticas sobre el vino que transforman el etanol en ácido acético y que proporcionan unas características físico-químicas y sensoriales definidas. El proceso de acetificación puede ir acompañado, simultáneamente o de forma secuencial, de un envejecimiento en recipientes de madera; lo que le confiere unas características especiales y un alto valor añadido [1]. El brandy es una bebida espirituosa de elevado grado alcohólico elaborada a partir de productos derivados de la destilación de los vinos (holandas, aguardientes y alcohol destilado), que puede ser susceptible de aromatización, edulcoración y coloración con aditivos autorizados, pero que debe su particularidad al proceso de envejecimiento al que se somete en envases de madera de roble [2]. 33

27 José González Rodríguez Tesis Doctoral 1.6. Residuos de la vendimia Los residuos procedentes del proceso de la vinificación son los orujos frescos (vinificación en blanco) o fermentados (vinificación en tinto); los raspones, que pueden ir solos o acompañando a cualquiera de los anteriores; los turbios de desfangado; las lías o heces de la fermentación y los tartratos. El raspón en sí no tiene mucha utilidad, y se usa como combustible, una vez seco, o como abono. Los orujos frescos tradicionalmente se venden a industrias que extraen de ellos bitartrato potásico, tartrato cálcico, ácido tartárico y alcohol, principalmente, aunque en algunos casos se aprovechan para la obtención de taninos y la pepita para la obtención de aceite. El resto de los subproductos de vendimia se destinan a la extracción de alcohol, tartratos y levaduras de consumo animal, principalmente [3]. 2. Métodos de análisis para el seguimiento de parámetros enológicos Desde que la uva entra en la bodega hasta que sale de ella en forma de vino o como materia prima para otros productos derivados, sufre una serie de procesos y transformaciones durante los cuales la información de la composición o el progreso es de vital importancia para conocer en todo momento cómo y cuándo actuar. Existe una serie de parámetros analíticos básicos que permiten el seguimiento de estos procesos y el conocimiento de la composición del producto en cada una de las etapas. A continuación se enumeran los más significativos, que, en función de los métodos para la determinación de cada uno de los parámetros elegidos para su estudio, se pueden clasificar en dos apartados: Métodos habituales y métodos oficiales, que se refieren, respectivamente, a los utilizados tradicionalmente en las bodegas y a los seleccionados por las entidades supranacionales del Sector para su ordenación normativa o legislativa: Oficina de la Viña y del Vino (OIV), AOAC y la Unión 34

28 Introducción Europea. Entre los métodos oficiales se encuentran tanto métodos de referencia como métodos usuales. Los métodos de la bibliografía reciente, que corresponden a los publicados en los últimos diez años. A su vez, estos últimos se pueden dividir en métodos continuos y métodos discontinuos Grado alcohólico El grado alcohólico se define como el número de litros de etanol contenidos en 100 litros de muestra medidos ambos volúmenes a 20ºC. Por la propia naturaleza de los vinos, vinagres y brandies, el grado alcohólico es uno de los parámetros más característicos de su composició n, tanto desde el punto de vista del seguimiento y del control del proceso de elaboración, como de su valoración organoléptica y legal Métodos habituales y oficiales La mayoría de los métodos habituales y oficiales presentan dos etapas sucesivas: la obtención de una mezcla hidroalcohólica con un contenido en etanol equivalente al de la muestra objeto de análisis que se lleva a cabo por una destilación simple o por arrastre con vapor y la medida de la concentración del analito en dicha mezcla. El método oficial de referencia requiere la obtención del destilado por arrastre con vapor y la determinación posterior por picnometría [4]. La repetitividad y la reproducibilidad de este método son de ±0.1% (v/v) y ±0.19% (v/v), respectivamente. Para el resto de los métodos habituales y oficiales, independientemente de que utilicen cualquiera de las dos vías de obtención del destilado, emplean distintas técnicas analíticas de determinación del contenido en alcohol de la mezcla hidroalcohólica: areometría [5], con una precisión de ±0.1% (v/v); densimetría con balanza hidrostática [6]; refractometría [6], con un error en el cálculo de la densidad menor de 2x10-5 ; volumetría previa oxidación del etanol con 35

29 José González Rodríguez Tesis Doctoral dicromato [7], con precisión en el rango ±( ) % (v/v); cromatografía de gases [8], con una precisión de ±0.2% (v/v) y enzimología [8], mediante el uso de las enzimas alcohol deshidrogenasa o alcohol oxidasa y que se utiliza en disoluciones alcohólicas con un grado menor al 1% (v/v) ya que estos métodos son muy sensibles. Otros métodos, actualmente en desuso, permiten determinar el alcohol en la muestra sin destilación previa. Pueden estar basados en la medida del descenso del punto de ebullición de las mezclas alcohol-agua [9], o ser métodos semicuantitativos basados en separación de fases medida del cambio de volumen que sufre una fase orgánica inmiscible con el agua cuando el etanol presente en el vino se extrae con un disolvente orgánico [8] Métodos de la bibliografía reciente En la bibliografía reciente se pueden encontrar tanto métodos continuos como discontinuos para la determinación de etanol y que se presentan como alternativas a los métodos habituales y de referencia con el fin de superar sus características analíticas y conseguir unos mejores resultados. Métodos discontinuos. En la Tabla I.1 se recogen las características analíticas de estos métodos. La mayoría de ellos están basados en el uso de sensores, tanto químicos como bioquímicos, o en el de reacciones de derivatización del etanol para su posterior determinación mediante distintas técnicas instrumentales. Los sensores químicos permiten la determinación in situ del etanol y son dispositivos simples y que presentan una respuesta rápida. Son, generalmente, sensores amperométricos y no requieren una previa derivatización del analito [10, 11]. En algunos casos se trata de optrodos, en donde el transductor está constituido por una o varias fibras ópticas y en los que se emplea trifluoroacetona como reactivo 36

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