Inseminación en piscicultura

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1 Inseminación en piscicultura Los espermatozoides de los peces Morfología de los espermatozoides de los peces La gran diversidad observada entre los espermatozoides de los peces refleja la gran diversidad filogenética de éstos. La mayoría de las especies pertenecen a los teleósteos excepto los esturiones que pertenecen a los condrosteos. Entre los teleósteos, la gran variedad morfológica y fisiológica de los espermatozoides va a estar asociada a la gran diversidad ecológica y de comportamiento de este nivel de clasificación. Los espermatozoides de los esturiones tienen un acrosoma como los mamíferos, los pájaros, los tiburones ó el erizo de mar, mientras que los espermatozoides de teleósteos no tienen acrosomas. Los espermatozoides de salmónidos sólo tienen una mitocondría mientras que los de la carpa o del rodaballo tienen de 8 a 10. Estas diferencias morfológicas y estructurales suponen diferencias en términos de movilidad y de fecundación. Maduración de los espermatozoides En un testículo de pez maduro, la presencia de espermatozoides puede ser exclusiva (salmónidos, ciprínidos) o acompañarse de espermátides (rodaballo). Los espermatozoides testiculares no son siempre aptos para ser activados. En la mayoría de las especies, la maduración de los espermatozoides testiculares puede ser provocada in vivo con una inyección de gonadoliberina o de gonadoestimulina. Entre los salmónidos, ha sido demostrado que esta inyección provoca la secreción del líquido seminal siendo el ph y el contenido en calcio favorables en la maduración de los espermatozoides que normalmente se efectúa en canales deferentes. La maduración de los espermatozoides testiculares de la trucha puede ser obtenida in vitro por una incubación de 2 horas en un diluyente especial que disponemos y se llama: MATUR-FISH. Movilidad de los espermatozoides Los espermatozoides de los peces son normalmente inmóviles en el líquido seminal que representa aproximadamente el 80% del volumen del esperma. De manera general, la movilidad se inicia en presencia de agua dulce (hipotónica) para los peces de agua dulce y en presencia de agua del mar para los peces marinos. La activación de los espermatozoides de salmónidos es posible en medio isotónico privado de potasio y es por eso que fabricamos el diluyente que se llama: ACTI-FISH 300.

2 Esquemáticamente, el movimiento del conjunto de espermatozoides de un semen es sincrónico en condiciones normales. Primero, se puede identificar unos desplazamientos, luego los espermatozoides se giran sobre ellos mismos, la cabeza presenta un movimiento lateral que persiste algún momento antes la inmovilización completa de la célula. Durante todo este movimiento la frecuencia de batir del flagelo, que concierne a toda la longitud al comienzo, después progresivamente únicamente a la base, disminuye. Los espermatozoides de la trucha y del esturión, que sólo tienen de 1 a 2 mitocondrias, presentan niveles de ATP débiles con relación a los de las otras dos especies. Transferidos en un diluyente isotónico especial STOR-FISH, los espermatozoides de estas especies recobran un nivel de ATP similar al nivel inicial y pueden ser activados una segunda vez. La calidad del semen de los peces depende de varios parámetros ligados a la especie, al individuo, al período de reproducción, al medio ambiente y a la técnica de recogida. Este último punto es particularmente importante, pueden existen riesgos de contaminación por la orina. Fecundación artificial de salmónidos A- Materiales necesarios: - ACTI-FISH - OVA-FISH - Recipiente de plástico - Colador B- Lavado de los huevos: - Eliminar el líquido coelómico de la puesta y pesar los huevos. - La solución de limpieza de los huevos OVA-FISH debe ser a la misma temperatura que los huevos. Añadir OVA-FISH a los huevos a razón de 100 ml para 100gr. - Eliminar las eventuales suciedades (sangre, excrementos) con una pinza luego verterlo todo en un colador. - Verter los huevos en un recipiente de plástico limpio. C- Fecundación: - Depositar el esperma sobre los huevos a razón de: - 0,1 ml de esperma fresco para 100 gr de huevos ó 10 pajuelas congeladas para 100 gr de huevos - Añadir el diluyente de fecundación ACTI-FISH a razón de 50 ml para 100 gr

3 de huevos (es absolutamente necesario que el diluyente recubra enteramente los huevos). - Esperar 5 minutos y luego transferir los huevos a los incubadores. Análisis de la movilidad de los espermatozoides de salmónidos A- Materiales necesarios: - ACTI-FISH - STOR-FISH - Microscopio de aumento 10 X 20 - Lámina de vidrio - Tubos de ensayo - Micopipetas 2,20 y 100 µl B- Observaciones: - Poner en suspensión los espermatozoides de la toma, agitando suavemente el tubo de recogida. - Meter 2 µl de esperma en 100 µl de diluyente STOR-FISH. - Depositar 20 µl de diluyente ACTI-FISH sobre una lámina de vidrio posicionada sobre la platina del microscopio. - Tomar 2 µl de la solución de esperma diluido y mezclarlos rápidamente sobre la lámina con el diluyente ACTI-FISH y la ayuda de la pipeta. Observar inmediatamente, cambiando rápidamente de campo óptico. C- Evaluación: - Evaluar el porcentaje de espermatozoides desplazándose en el campo - Anotar la calidad del desplazamiento (rápido, lento, progresivo,...) - Hacer mínimo 2 observaciones por muestra de esperma. Congelación del semen de los peces La congelación del semen constituye una técnica útil para disfrutar de los recursos genéticos: - en caso de patologías graves. - para la selección de nuevos criterios. La selección genética entre los peces está actualmente en pleno desarrollo y supone una necesidad para la crió conservación del esperma de especies interesantes. Permite, en efecto, el almacenamiento ex situ de especies, descendencia seleccionada e individuos que poseen características genéticas interesantes y puede permitir volver a los troncos del origen en caso de que aparezcan caracteres fortuitos indeseables.

4 Sin embargo la calidad del esperma después de la congelación difiere considerablemente de una especie a la otra y hasta de un macho y de un esperma al otro en una misma especie. Esta variabilidad puede ser controlada en una cierta medida por medio de la utilización adecuada de congelación, pero por razones de falta de resistencia de ciertos espermas con la congelación siempre deben ser objetos de investigación intensiva. En el proceso de congelación-descongelación, las células están sumisas a fuertes reacciones mecánicas, osmóticas y metabólicas principalmente ligadas a los fenómenos siguientes: Transición de fase de lípidos: Cuando la temperatura desciende debajo de la temperatura de vida de los animales, los lípidos de las membranas del espermatozoide sufren una transición secuencial de estado líquido (fase llamada "cristal líquido") hacia un estado más rígido ("fase gel"). El choque frío no se observa por debajo del punto de cristalización de la célula, lo que tiene por consecuencia que los problemas ligados al choque frío se encuentran probablemente simultáneos a los ligados a la cristalización. Algunos componentes del diluyente tales como los azúcares, la yema de huevo, la leche desnatada ó la albúmina bovina tienen la función de limitar la brutalidad de la transición de la fase y atenuar los efectos. Cristalización del hielo: Bajo 0º C y a una temperatura dependiente de la composición del diluyente, el medio extracelulario empieza a cristalizar. La formación de los cristales de hielo provoca un aumento de la concentración extracelularia en solución (iones, y otras moléculas presentas en el medio) y provoca una salida de agua de la célula con fin de volver a equilibrar la presión osmótica entre los dos compartimientos (intra y extra). Si la congelación es suficientemente lenta, la célula se va a deshidratar progresivamente, lo cual limita los riesgos de cristalización dentro de la célula. CONGELACIÓN DEL ESPERMA DE TRUCHA ARCO IRIS Pequeños materiales necesarios - ACTI-FISH - CRYO-FISH - DMSO (dimetil sulfóxido) - Yema de huevo (sanofi Pasteur ref ) - Pajillas "industriales" 500 µl con polvo de taponamiento ó pajillas CBS 500 µl, anillo de identificación y syms.

5 - Micropipeta P Hielo si el tiempo de manipulación del esperma es superior a minutos. Diluyentes de recogida/congelación (cantidad para 100 ml de esperma) - CRYO-FISH : 240 ml - DMSO: 30 ml - Yema de huevo: 30ml DMSO para los salmónidos, el rodaballo, la dorada. Dimethylacetamida para el siluro. Nota: El propilenglicol da resultados equivalentes al DMSO para el rodaballo. Recogida - 3 volúmenes de diluyente de recogida/congelación mantenida aproximadamente a 10ºC para los peces de agua fría y 20 ºC para los peces de agua caliente + 1 volumen de esperma directamente recogido sobre el diluyente. - Mantenimiento del esperma diluido sobre hielo hasta la congelación o congelación inmediata (El DMSO es muy tóxico para las células a temperatura ambiente). Congelación - Llenar las pajillas con la mezcla esperma / diluyente de congelación. Para las pajillas industriales sumergir la extremidad sin algodón en el polvo de taponamiento que debe penetrar en la pajilla aproximadamente 1 mm, luego sumergir esta extremidad en el agua algunos segundos. El polvo de taponamiento expuesto al agua polimeriza rápidamente. Para las pajillas CBS, poner el anillo de identificación dentro de la pajilla y ésta en el syms. - Después, dejar las pajillas en el nicool, el minidigit cool o bien horizontalmente sobre la balsa flotante a 3 cm bajo el nitrógeno líquido, luego cerrar el container. Descongelación- Fecundación - Sumergir las pajillas 10 segundos en uno Baño-maría a 37º C para volver a traer el esperma a 4º C. Los diluyentes de congelación tienen diferentes composiciones en sales y en moléculas que taponan el medio, en IMV nuestro diluyente se llama CRYO- FISH y en el momento del pedido hay que especificar la especie para añadir el buen cryoprotector. En efecto por ejemplo el DMSO es mejor para el esperma de trucha, de carpa, de rodaballo, de róbalo y de dorada.. La descongelación debe ser la más rápida posible para limitar el fenómeno de

6 recristalización. Un baño maria siempre es preferible al aire aunque no esté a la temperatura óptima de 37º- 40º C. Fué demostrado que la velocidad de descongelación en un baño de agua a 10º C es de 175º C/mn contra 26º C/mn en un aire a 21º C. La fecundación debe tener lugar lo más pronto posible tras la puesta en contacto directo de los huevos con la mezcla esperma / diluyente de congelación y con adición de un diluyente de activación de los espermatozoides (ACTI-FISH). La cantidad de esperma utilizado tiene que ser muchas veces 10 veces mayor que la utilizada en fresco, pero demasiado esperma congelado no mejora proporcionalmente la fecundación y puede disminuir por causa de las interacciones entre los espermatozoides vivos y los muertos. Máquinas para envasar las pajillas "industriales": Un caja inoxidable con nitrógeno líquido y sobre el cual están alargadas las pajillas, esta máquina es un dispositivo sencillo y que ofrece muy buenos resultados de congelación pero existen también mini-congeladores con buenos resultados para las pequeñas cantidades o bien máquinas más imponentes cuando las cantidades son más importantes. A 3 cm arriba del nitrógeno líquido la velocidad de congelación es lenta hasta - 15º C, después aumenta hasta - 70º C y luego disminuye de nuevo. La temperatura debe alcanzar - 80º C antes que las pajillas sean sumergidas en el nitrógeno líquido. Este perfil de congelación da resultados satisfactorios para numerosas especies como por ejemplo el rodaballo, la dorada, el siluro y la trucha arco iris. Congelación-descongelación del esperma: Numerosos protocolos de congelación diferentes han sido propuestos para el esperma de los peces. Las bolitas ("pellets"), cryotubos y pajillas fueron utilizadas con suceso aunque las pajillas sean más fácil de manipular y de gestionar, las pajillas más corrientes son las de 250 ó 500 µl. Existen 2 tipos de pajillas, las pajillas "industriales" para números muy importantes sin hacer conservación de largo plazo y las pajillas "de alta seguridad" que son fabricadas para bancos de esperma o para la conservación a más o menos largo plazo de los mejores genitores. La pajilla CBSTM está constituida por un tubo hecho a partir de una resina ionomerica que no contiene ningún agente plastificante. Es termosoldable (Tº º C). Se pueden identificar las pajillas CBSTM por los tubos interiores de identificación. El sistema completo de cryoconservación unitaria, el SIMS es la réplica compacta de los grandes sistemas utilizados para los estudios epidemiológicos y las preparaciones de muestras en grandes series. Asocia unidad de envasado estéril, unidad de soldadura térmica y sistema de identificación exclusivo. Si la congelación es muy rápida, el agua intracelularia no tendrá tiempo de salir

7 y se formarán microcristales. Sin embargo, si la descongelación que sigue es demasiado lenta, estos microcristales fundaran al bajar la temperatura y volverán a cristalizarse en grandes cristales que ellos serán extremamente peligrosos para la célula. Es un compromiso de la investigación realizar los estudios sobre las velocidades de congelación-descongelación de las células. Los espermatozoides de la mayoría de los peces domésticos, más particularmente los que no presentan acrosoma, aceptan una amplia gama de velocidades de congelación-descongelación, lo que deja pensar que el fenómeno de cristalización intracelular no es un problema mayor en el estado actual de los métodos empleados. Almacenamiento en nitrógeno : La inocuidad de un almacenamiento prolongado a -196º C es todavía objeto de controversia. A -80º C, la presencia de fracciones no congeladas o vitrificadas puede conducir a una cierta inestabilidad de las células conservadas. Sin embargo, a partir de -130º C, el agua líquida ya no existe y la viscosidad del medio es extrema. A -196º C, la energía térmica es demasiado débil para autorizar cualquier reacción, y las radiaciones ionizantes y los rayos cósmicos son susceptibles de inducir daños al ADN de las células almacenadas, y esto en una escala de varios millares de años. Recogida y manipulación del esperma antes de la congelación: El suceso de la congelación del esperma depende de la obtención de un esperma recogido y manipulado en condiciones óptimas y luego congelado según un protocolo adaptado a la especie. La recogida del esperma debe hacerse limitando al máximo la contaminación por la orina. Cuando el esperma se obtiene por disección de los testículos, la incubación del esperma de ciertas especies en los medios de maduración puede ser necesaria. Es el caso por ejemplo para los salmónidos.

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