EFECTO RADIOSENSIBILIZADOR AL INHIBIR LA REPARACIÓN DEL ADN EN COMBINACION CON BNCT EN UN CARCINOMA DE TIROIDES.

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1 EFECTO RADIOSENSIBILIZADOR AL INHIBIR LA REPARACIÓN DEL ADN EN COMBINACION CON BNCT EN UN CARCINOMA DE TIROIDES. Rodríguez C 1 ; Carpano M 1 ; Thorp S 2, Curotto P 3, Juvenal G 1,4, Pisarev M 1,4, Dagrosa A 1,4. 1 Departamento de Radiobiología (CAC,CNEA), 2 Departamento de Instrumentación y Control (CAE, CNEA), 3 RA-3-Reactores de Investigación y Producción (CAE,CNEA), 4 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). carodrig@cnea.gov.ar Resumen: La terapia de captura neutrónica en boro (BNCT) está basada en la reacción 10 B (n, ) 7 Li y ha sido propuesta para el tratamiento de tumores que no responden a terapias clásicas. El carcinoma pobremente diferenciado de tiroides pierde la capacidad de captar iodo y no responde al tratamiento con iodo radiactivo. Previamente determinamos que luego del tratamiento con BNCT la vía de reparación de lesiones doble cadena (DSB) en el ADN por recombinación homóloga (HR) se activa mientras que la de unión de extremos no homólogos (NHEJ) no. Detectamos que los la enzima Rad51, correspondiente a la vía HR se produce de novo en respuesta al tratamiento y que dicho aumento se corresponde con una reparación del daño en el ADN luego de 24 horas desde el momento de la irradiación. Estos resultados indican que existe una respuesta específica inducida por BNCT y que ciertos mecanismos de rescate celular se ponen en marcha provocando una disminución en el efecto de la terapia. En este contexto y con el fin de disminuir los efectos refractarios a la terapia utilizamos el inhibidor específico de la enzima Rad51, B02 [(E)-3-benzyl-2-(2-(pyridin-3-yl) vinyl) quinazolin-4(3h)-one], molécula que ha demostrado inhibir específicamente la actividad reparadora del ADN de Rad51 disminuyendo así la sobrevida celular en respuesta a diferentes tratamientos. Aun no se han probados su efectos en combinación con la radioterapia. El objetivo de este trabajo fue determinar si la combinación de B02 con BNCT disminuye la sobrevida de células de carcinoma folicular de tiroides respecto al tratamiento solo con BNCT. RADIOSENSITIZING EFFECT OF DNA REPAIR INHIBITION WHEN COMBINING WITH BNCT IN A THYROID CARCINOMA Abstract: Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is based in the nuclear reaction 10 B (n, ) 7 Li and has been proposed as an alternative treatment for tumors which are insensitive to conventional therapies. Poorly differentiated thyroid carcinoma does not uptake radioactive iodine and therefore do not respond to conventional therapy. Previously we determined that after BNCT, DNA double strand breaking repair pathway by Homologous Recombination (HR) is activated while Non Homologous End Joining (NHEJ) pathway is not. Rad51, main enzyme from HR, is synthesized de novo due to the treatment and the increase is consistent with DNA

2 repair after 24 hours of the irradiation. These results indicate that there is a specific response to BNCT and that cellular rescue mechanisms are activated causing a decrease in the efficacy of the therapy. In this context and in order to diminish the refractory effect to the therapy we used the specific Rad51 inhibitor, B02 [(E)-3- benzyl-2-(2-(pyridin-3-yl) vinyl) quinazolin-4(3h)-one]. It has been demonstrated that this molecule specifically inhibited Rad51 repairing activity and in consequence decreases tumor cell survival after different kind of treatments. Its effect combined with radiotherapy has not been tested. The aim of this work was to determine if the combination of B02 with BNCT decreases cell survival in a follicular thyroid carcinoma more than BNCT alone. Introducción: La terapia por captura neutrónica en boro (BNCT) es un tipo de radioterapia para el tratamiento del cáncer que ha sido propuesta como una alternativa para tratar tumores no susceptibles a terapias clásicas (1). Se basa en la administración de 10 B ligado a algún compuesto capaz de ser captado preferencialmente por las células tumorales. La borofenilalanina (BPA) es el compuesto más ampliamente utilizado hasta el momento (1). Al ser un aminoácido esencial es captado por todas las células y en mayor medida por las células tumorales debido a su ritmo metabólico exacerbado. Una vez incorporado el 10 B, se irradia con un haz de neutrones térmicos lo que provoca la reacción de captura 10 B (n, ) 7 Li (1). Las partículas resultantes, ambas de alto LET, depositan gran cantidad de energía en su corta trayectoria provocándole daño a la célula que las contiene sin dañar al tejido sano periférico. El ADN es uno de los blancos más susceptibles dentro del núcleo celular. La radiación ionizante provoca lesiones en el ADN. De estas lesiones las que afectan a ambas cadenas son las más peligrosas ya que pueden llevar a la formación de rearreglos cromosómicos o pérdida de información genética pudiendo ser letales para la célula (2). Durante una terapia oncológica, este es el efecto deseado en las células malignas que se desean erradicar. Sin embargo estas muchas veces logran recuperarse disminuyendo la eficacia de la terapia. Cuando el ADN sufre una lesión de este tipo inmediatamente se produce la fosforilación de la histona H2AX lo cual provoca la descondensación de la cromatina y el reclutamiento de la maquinaria de reparación de lesiones doble cadena en el ADN (3). La reparación por Recombinación Homóloga (HRR) y la reparación por Unión de Extremos no Homólogos (NHEJ) son las vías principales por las cuales se lleva a cabo en células de mamíferos(4,5). En este trabajo evaluamos el efecto del inhibidor de Rad51 en células de cáncer de tiroides y en melanoma. Los cánceres indiferenciado y el pobremente diferenciado de tiroides pierden la capacidad de captar iodo conforme aumenta su grado de indiferenciación volviéndolos resistentes al tratamiento con iodo radiactivo (6). El melanoma por su parte es un tumor muy agresivo que de ser

3 diagnosticado a tiempo puede ser controlado con terapias convencionales. Sin embargo, en etapas muy avanzadas la efectividad de estas terapias es pobre (7). Esta característica en ambos tipos de tumores los vuelve potenciales candidatos para el tratamiento con BNCT. El objetivo de este trabajo es estudiar en células tumorales de tiroides y piel tratadas por BNCT el efecto del inhibidor específico de la enzima Rad51, B02 [(E)- 3-benzyl-2-(2-(pyridin-3-yl) vinyl) quinazolin-4(3h)-one](8). Procedimiento Cultivos celulares Para estos estudios se utilizaron células de la línea humana de cáncer folicular de tiroides WRO, cedidas amablemente por el Dr. G. Juillard (UCLA,USA) y células de melanoma humano MelJ cedidas amablemente por el Dr. José Mordoh (Instituto de Investigaciones Bioquímicas Leloir). Las células WRO fueron crecidas en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 154 mg/l de piruvato de sodio, 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 100 mg/l de estreptomicina, UI/L de penicilina y suero fetal bovino (SFB) al 10%. Las células MelJ fueron crecidas en DMEM High Glucosa suplementado con 3,7 g/l de bicarbonato de sodio, 5 mg/l de insulina, 100 mg/l de estreptomicina, UI/L de penicilina, suero fetal bovino (SFB) al 10% y L-glutamina. Se mantuvieron en estufa a 37ºC en una atmósfera con 5% de dióxido de carbono (CO 2 ) y humedad a saturación. Solución de BPA La BPA [BoronBiologicals Inc., Raleigh, USA] se preparó en una concentración de 30 mg/ml (0,14 M). Este compuesto de boro (Lfenilalaninaenriquecido con 95% de átomos de 10 B) fue combinado en PBS 1X con fructosa en una relación 1:1 y llevado a ph 9,5-10 con hidróxido de sodio 10N hasta su disolución y finalmente reajustado a 7,4 con ácido clorhídrico 6N. Citotoxicidad Se definió la dosis óptima no tóxica a utilizar en los tratamientos determinando la cantidad de proteínas totales como una medida relativa de la cantidad de células presentes en el cultivo. Para ello se sembraron ~ células de la línea de carcinoma folicular de tiroides humano (WRO) en placas de 24 wells. Una vez adheridas se añadió B02 al medio de cultivo a fin de obtener

4 concentraciones finales de 0, 1, 3, 5 y 10 M. Se incubaron en estufa a 37 C durante 24, 48 y 72 horas. Pasados estos tiempos, el medio de cultivo fue removido y a cada well se le añadieron 100 l de NaOH 0,3 M. Se dejaron ON para permitir el lisado total del cultivo y se midieron las proteínas por la técnica de Lowry. La curva de calibración se realizó con seroalbúmina bovina (BSA). Se midió la absorbancia a 720 nm. Cada valor obtenido fue relativizado al valor de absorbancia obtenido a 0 M. Ensayo de sobrevida Para evaluar la sobrevida luego de los tratamientos se sembraron 2000 células de las líneas WRO y Mel J en placas de 96 wells. Se sembraron 8 wells por tratamiento. Una vez adheridas se añadió al medio BPA (10 μg 10 B/ml, 10 ppm de 10 B) 16 horas antes de la irradiación (tiempo de incubación fue seleccionado basándose en estudios previos de captación de boro en los cuales se observó un pico en la concentración de BPA en el tumor) y/o B02 5 M según correspondiese. Luego de la irradiación el medio fue removido y reemplazado por medio fresco suplementado con B02 según correspondiese. Pasadas las 72 horas de incubación 50 l de MTT 1 mg/ml en PBS 1X fueron añadidos al medio de cultivo el cual se dejó incubar durante 1 hora. Finalmente en cada well se utilizaron 100 l de DMSO para liberar y disolver el producto coloreado. Se midió la absorbancia en un lector de placas a 595 nm. Los valores obtenidos fueron normalizados a los controles sin irradiar con o sin BPA y con o sin B02 y expresados en mediadas relativas de DO. Irradiación y controles: Los grupos establecidos fueron los siguientes: Control Control + B02 Control + BPA Control + B02+ BPA Haz de neutrones (N) Haz de neutrones + B02 (N+B02) BNCT BNCT+B02 Las células fueron irradiadas en la facilidad de la columna térmica del reactor RA-3 del Centro Atómico Ezeiza (flujo n/cm 2 sec) a dosis de 1, 3 y 5 Gy (±10%). Luego de la irradiación las placas se mantuvieron en estufa de cultivo a 37 C durante 2 horas y el medio fue reemplazado por medio fresco a fin de

5 remover la BPA. Se volvió a agregar B02 en los wells correspondientes y se dejó en incubación durante 72 horas. Dosimetría Los cálculos correspondientes a la dosimetría de la irradiación fueron realizados en la facilidad del RA-3 por la Lic. Silvia Thorp (del Departamento de Instrumentación y Microdosimetría). Todas las irradiaciones en este reactor fueron realizadas a una potencia de 8 MW. El flujo neutrónico térmico se determinó usando un detector autoenergizado en base a rodio, el cual fue calibrado usando hojuelas de cobalto. Las determinaciones del flujo neutrónico epitérmico y rápido se realizaron con hojuelas de activación bajo cadmio y una hojuela de indio bajo cadmio y esfera de boro respectivamente. Los resultados de estas mediciones mostraron ser varios órdenes de magnitud menores a las obtenidas para el flujo térmico, motivo por cual no fueron tenidas en cuenta para el cálculo de la dosis. Finalmente, para la medición de la dosis presente en el haz neutrónico se utilizó una cámara de ionización de grafito, blindada con un capuchón de litio. Resultados Determinación de la dosis no tóxica de la droga B02 Figura 1: efecto de dosis crecientes de B02 en el crecimiento celular a 24, 48 y 72 horas en células de carcinoma folicular de tiroides (WRO).

6 La cantidad de proteínas totales de un cultivo celular es proporcional a la cantidad de células presentes. Pudimos ver que la concentración de 5 M no produce una disminución en la cantidad de células a partir de las 48 horas mientras que a la dosis de 10 M disminuye considerablemente a los tres tiempos de incubación evaluados. A las 24 horas el crecimiento celular no se modificado a ninguna de las dosis evaluadas. Elegimos la dosis de 5 M y el tiempo de 72 horas para el resto de los ensayos ya que es la dosis más elevada a la cual la droga no provoca un efecto por si sola y a su vez el tiempo de incubación permite al cultivo realizar varios ciclos de replicación. * Sobrevida celular Figura 2: efecto de B02 en la sobrevida celular luego de la irradiación. Células WRO en fase exponencial de crecimiento incubadas con o sin B02 y con o sin BPA e irradiadas con un haz de neutrones. * p < 0.05, 5 Gy BNCT+B02 Control+BPA+B02. ** Se observa una disminución en la sobrevida celular en todos los grupos. Puede observarse que la disminución es mayor en los grupos donde las células fueron incubadas con B02 antes de la irradiación tanto en el grupo N+B02 como en el grupo BNCT+B02 en comparación con los controles sin irradiar y con los grupos N y BNCT, sin B02. A su vez puede verse que la sobrevida decrece con la dosis. Luego del tratamiento BNCT+B02 a 5 Gy la disminución de la sobrevida es significativa en comparación con el control sin irradiar y en presencia de B02.

7 Figura 3: efecto de B02 en la sobrevida celular luego de la irradiación. Células Mel J en fase exponencial de crecimiento incubadas con o sin B02 y con o sin BPA e irradiadas con un haz de neutrones. ** p < 0.01, 3 Gy BNCT vs 0 Gy+BPA, ** p < 0.01, 5 Gy BNCT vs 0 Gy+BPA, ** p < 0.01, 3 Gy BNCT+B02 vs 0 Gy+BPA+B02, 5 Gy BNCT+B02 vs 0 Gy+BPA+B02. En términos generales puede observarse el mismo patrón de disminución de la sobrevida celular que en WRO. La sobrevida disminuye con la dosis y con la adición de B02 al medio de cultivo antes de la irradiación y más aún en presencia de BPA. Tanto en el grupo BNCT como en el grupo BNCT+B02 luego de la irradiación a 5 Gy la sobrevida disminuye significativamente respecto a sus controles sin irradiar en presencia de BPA y de BPA+B02 y a su vez la diferencia entre el tratamiento BNCT vs BNCT+B02 es significativa (*** p<0.001).

8 Conclusiones Las proteínas reparadoras de ADN han sido propuestas como blanco terapéutico a través de la sensibilización de células cancerosas a la radio y la quimioterapia. En trabajos anteriores observamos que la expresión de Rad51, la principal enzima de la vía de reparación por recombinación homóloga, es elevada en células de la línea de carcinoma folicular de tiroides WRO y la línea de melanoma humano MelJ. Este hecho está directamente relacionado con una recuperación de las células tumorales tratadas con BNCT evidenciada por una persistencia de focos de daño luego de las irradiaciones y recurrencia de los tumores en modelos in vivo. En base a estos hallazgos nos propusimos bloquear esta vía Incorporando a nuestros tratamiento al inhibidor específico de Rad51, B02. Pudimos determinar que al incorporar B02 en una concentración de 5 M no había evidencias de toxicidad celular luego de 72 horas. Estas fueron las condiciones elegidas para los tratamientos. Cuando incorporamos B02 al medio de cultivo en conjunto con la BPA 16 horas antes de la irradiación con neutrones pudimos observar que la sobrevida de las células WRO disminuyó significativamente luego del tratamiento a 5 Gy en comparación a los grupos sin irradiar mientras que no se observó lo mismo a dosis más bajas donde las diferencias no fueron significativas entre ninguno de los tratamientos. En paralelo evaluamos el efecto de la droga en la línea de melanoma MelJ y no solo observamos el mismo patrón sino que las diferencias entre tratamientos y la disminución de la sobrevida a 5 Gy en presencia de B02 fueron más evidentes que en WRO. Si bien pudimos observar una tendencia a mejorar los resultados obtenidos con BNCT incorporando B02 al medio y que se observaron diferencias significativas entre algunos de los tratamientos creemos que no son suficientes. Más pruebas son necesarias para optimizar el BNCT en el tratamiento de ambos cánceres ya sea regulando la dosis de radiación, las ppm de BPA y su combinación con B02 a fin de optimizar la terapia disminuyendo los efectos tóxicos de la droga y la radiación.

9 Referencias 1) Coderre JA, Morris GM. Radiat. Res. 1999; 151: ) Sandeep Burman, Benjamin p. Chen, Michael Murphy, Akihiro Kurimasa y David J. Chen. The Journal of Biological Chemistry 2001, Vol 276, Nº45, pp ) Irene Ibañez, Candelaria Bracalante, Beatriz Molinari, Monica A. Palmieri, Lucía Policastro, Andrés J. Kreiner, Alejandro A. Burlon, Alejandro Valda, Daniela Navalesi, Jorge Davidson, Miguel Davidson, Mónica Vazquez, Mabel Ozafrán y Hebe Durán. Int. J Radiat. Oncol. Phys Vol 74, Nº4, pp ) Olive PL. Radiat Res. 1998; 150: ) Stefan Sigurdsson, Stephen Van Komen, Galina Petukhova and Patrick Sung. The Journal of Biological Chemistry 2002, Vol 277, Nº45, pp ) Dagrosa MA, Viaggi M, Kreimann E, Garavaglia R, Farías S, Agote M, Cabrini Rl, Juvenal G, Pisarev MA. Thyroid 12 (1): 7-12; ) Menéndez, P.R. et al, Applied Radiation and Isotopes 67,S50 S53. 8) Fei Huang, Nuzhat A. Motlekar, Chelsea M. Burgwin, Andrew D. Napper, Scott L. Diamond, and Alexander V. Mazin. ACS Chem Biol (6): doi: /cb100428c.