Kit completo para la determinación del virus de Epsteín-Barr (EBER1) mediante hibridación in situ cromogénica

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1 Avda. Conocimiento, 100 P.T. Ciencias de la Salud Granada Fax: Tlf.: Kit completo para la determinación del virus de Epsteín-Barr (EBER1) mediante hibridación in situ cromogénica DESCRIPCIÓN: Este kit contiene reactivos para llevar a cabo de forma manual o automatizada la técnica de hibridación in situ cromogénica (CISH) sobre secciones de tejidos humanos fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina. Este kit contiene el sistema de revelado basado en el polímero Ultravision Quanto y es suficiente para la realización de 20 determinaciones siguiendo el protocolo recomendado. Presentación : La referencia/presentación general para este Kit es: MAD QK 20 test Esta referencia es para presentación en envases de Polietileno de Baja Densidad (LDPE) con gotero. En caso de que el usuario desee otro tipo de presentaciones (referencias/volúmenes diferentes) deberá contactar con el proveedor. Uso Previsto : Diagnóstico in vitro en la especie humana Condiciones de almacenamiento : Frigorífico entre 2 y 8ºC. Periodo de validez : El envase una vez abierto puede conservarse hasta la fecha de caducidad del reactivo señalada en la etiqueta. Si el reactivo ha sido almacenado en otras condiciones a las señaladas en este documento el usuario deberá chequear previamente su correcto funcionamiento teniendo en cuenta que la garantía del producto ya no es válida. Instrucciones especiales de manipulación: Este reactivo está especialmente diseñado para su manejo en los inmunoteñidores LabVision Autostainer 480 y 780. Advertencias y precauciones: 1) El producto solo debe ser manejado por usuarios entrenados y en laboratorios autorizados. Para su manejo en investigación existen otras presentaciones más idóneas. 2) Téngase en cuenta que la última responsabilidad en la optimización e interpretación de las hibridaciones cromogénicas practicadas corresponde al facultativo responsable y los técnicos que emplean el kit y que, asimismo, este conjunto de reactivos no es más que una herramienta útil para la interpretación de los hallazgos morfológicos de cada caso en conjunción con otros tests diagnósticos y los pertinentes datos clínicos del paciente. 3) El reactivo contiene azida sódica (NaN3) como conservante. Aunque este producto es altamente tóxico y si se mezcla con agua o ácidos, principalmente en presencia de metales, existe peligro de explosión, estos riesgos están minimizados al máximo cuando se emplea a concentraciones inferiores al 0,05% como ocurre en este caso. No obstante para el manejo de este reactivo deben tomarse las siguientes precauciones: a) Uso de guantes y del equipo de protección establecido para las técnicas de hibridación e inmunohistoquímicas del laboratorio así como estricto respeto de las prácticas generales de seguridad existentes en el mismo; b) No almacenar los reactivos en envases metálicos ni emplear utillaje de esta naturaleza para su manejo; c) Almacenar los residuos para su eliminación reglada en contenedores apropiados según la normativa vigente en cada laboratorio. Nunca arrojarlos por el desagüe. ESPECIFICIDAD El virus de Epstein-Barr (EBV), también llamado herpes virus humano de tipo 4, que fue descubierto por Epstein, Achong y Barr en el año 1964 a partir de cultivos celulares de linfoma de Burkitt, es un virus de la familia herpes de entre nm de diámetro compuesto por una doble cadena de ADN de pares de bases que contiene 85 genes. Es uno de los virus con mayor capacidad infectiva en la especie humana en la que una vez incorporado persiste durante toda la vida del individuo con una prevalencia del 90% en adultos. Estructuralmente el genoma viral está incluido en una nucleocápside que a su vez está rodeada por un envoltorio proteico que contiene un componente lipídico y la glicoproteína gp350. Al igual que otros herpes virus el EBV infecta a células que no se encuentran en división activa, en este caso linfocitos B maduros en reposo. Para ello, la gp350 de la envoltura inicia la adhesión del virus a la superficie de la célula huésped Página 1 de 5

2 mediante su unión a la molécula CR2 (CD21), lo que facilita la activación de la glicoproteína gp42 que junto a las moléculas HLA de clase II y las proteínas gp25 y gp85 del virus forma el complejo que es utilizado para su penetración en los linfocitos B. Una vez que el virus ha entrado en la célula su cápside se disuelve y el genoma viral es transportado al núcleo donde se inserta por acción de la propia DNA polimerasa de la células huésped. Una vez en el núcleo de las células huéspedes (habitualmente los linfocitos B de memoria), el virus entra en un periodo de latencia durante el que no se producen nuevos viriones y solo se expresa un número limitado de sus genes (en torno a 11) que codifican diversas moléculas, entre las que se encuentran dos tipos de ARN mensajero no codificante, seis proteínas nucleares y dos proteínas de membrana. Esta notable restricción de la expresión proteica en superficie dificulta el reconocimiento por los linfocitos T citóxicos de las células infectadas. El antígeno nuclear de EBV (EBNA) 1 es la proteína que permite al virus mantenerse dentro del linfocito B como un episoma circular de ADN. Por el contrario, el antígeno EBNA 2 regula la expresión de las proteínas latentes de membrana (LMP) de EBV 1 y 2 así como las proteínas que contribuyen al crecimiento y transformación de los linfocitos B. La proteína LMP-1 actúa como un oncogén que remedando la función de la molécula CD40 de la superficie linfocitaria es capaz de unirse a diversos receptores del factor de necrosis tumoral, lo que resulta en la activación de los factores nucleares κb y c-jun y de numerosas moléculas de adhesión celular; en definitiva de este modo el EBV potencia la producción de citocinas y genera una potente señal de proliferación celular. Adicionalmente la proteína LMP-2 de EBV, que previene la reactivación del EBV desde su fase de latencia a través del bloqueo de la fosforilación de las tirosin cinasas, garantiza la permanencia de una población suficiente de células infectadas para asegurar la supervivencia del virus. Los ARN EBER 1 y 2 de EBV, que no codifican proteínas por lo que no pueden ser transcritos, juegan un importante papel en la oncogénesis y en la resistencia de las células infectadas a la muerte programada y la apoptosis. Los genes EBER son transcritos por la polimerasa del ARN viral y constituyen las moléculas de EBV más abundantes en el linfoma de Burkitt y otras células latentes infectadas. Funcionalmente los ARN de tipo EBER actúan como factores de transcripción de la interleuquina 10, quizás el más importante factor de crecimiento autocrino existente en el linfoma de Burkitt. En determinados momentos, o solo en ciertos pacientes desde el principio, el virus puede entrar en fase lítica, o de infección productiva, que resulta en la generación de un gran número de viriones infecciosos. Para ello es necesario que el genoma circular del virus pase a linear y se produzca la activación de numerosos genes tempranos, incluyendo la propia DNA polimerasa viral. Infecciones primarias por EBV ocurren generalmente en la infancia y permanecen asintomáticas o provocan leves síntomas inespecíficos; por el contrario las infecciones de adolescentes y adultos con cierta frecuencia provocan la mononucleosis infecciosa, que ocasionalmente puede provocar importantes complicaciones como anemia hemolítica, trombocitopenia, miocarditis, hepatitis, rotura esplénica, o complicaciones neurológicas como el síndrome de Guillain- Barré o encefalitis. En estos casos el virus se transmite por la saliva e inicialmente infecta las células epiteliales de la orofaringe donde se replica hasta que infecta a los linfocitos B. Además, los linfocitos B infectados en estado latente diseminan por todos los órganos linfopoyéticos, que son la fuente de propagación continua del virus. Aunque normalmente, la infección es controlada por las células T citotóxicas en los pacientes con enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X la infección por EBV puede resultar fatal. La histosonda marcada con digoxigenina que se incluye en este kit es una mezcla de 5 oligonucleotidos complementarios a los ARN EBER de tipo 1 y 2 de EBV y ha sido creada para la detección de la presencia de EBV en las células infectadas en fase latente; no obstante, su uso también producirá señales de hibridación en tejidos con infecciones líticas por EBV. APLICACIONES DIAGNÓSTICAS: El virus EBV está directamente asociado a diversas neoplasias humanas de origen epitelial, mesenquimal y sobre todo linfoide en el interior de cuyas células puede ser identificado. Algunos ejemplos clásicos de neoplasias linfoides relacionadas con este agente viral, en muchas de las cuales la determinación del ARN EBER1 del EBV tiene valor diagnóstico, son la enfermedad de Hodgkin de tipo clásico, el linfoma de Burkitt de tipo endémico, el linfoma plasmablástico, algunos linfomas de células NK y T y los trastornos linfoproliferativos que aparecen en pacientes transplantados e inmunodeprimidos como es el caso de las personas infectadas por el virus VIH. Aunque el carcinoma nasofaríngeo es la típica neoplasia epitelial asociada a infección por EBV, otros tipos de carcinomas como el carcinoma linfoepitelial gástrico, también conocido como carcinoma rico en estroma linfoide, el carcinoma medular del páncreas y otros tipos de carcinomas, en general con morfología linfoepitelial, y varias localizaciones anatómicas pueden estar asociados a una infección por EBV. Otras enfermedades neoplásicas o asociadas a infección por EBV se recogen en la tabla siguiente. Neoplasias epiteliales Carcinoma nasofaríngeo Carcinoma gástrico Carcinoma medular del páncreas Carcinomas linfoepiteliales (glándulas salivares, timo, pulmón, mama etc.) Neoplasias mesenquimales Sarcoma de células dendríticas foliculares Página 2 de 5

3 Leiomiomas/leiomiosarcomas en pacientes inmunodeprimidos Linfomas Linfoma de Hodgkin de tipo clásico Linfoma de Burkitt endémico Granulomatosis linfomatoide Linfoma asociado a piotórax Linfoma primario de cavidades Linfoma NK/T periférico de tipo nasal Algunos linfomas difusos B de células grandes Linfoma B rico en linfocitos T Linfoma angioinmunoblástico T Trastornos linfoproliferativos en pacientes inmunodeprimidos Asociados a inmunodeficiencias primarias Asociados a infecciones por VIH Linfomas post-trasplante Linfomas Inducidos por Metotrexato Linfomas B de células grandes del anciano CALIBRADORES Y CONTROLES Patrón de Inmunotinción: Nuclear Control Positivo: Sección tisular procedente de linfoma de Hodgkin de tipo clásico o carcinoma nasofaríngeo positivos para EBV. Control Negativo: Preparación homóloga a la muestra problema incubada con un marn no específico para EBV. LIMITACIONES DEL REACTIVO El uso sobre tejido congelado no ha sido evaluado. TIPOS DE MUESTRA Secciones de 4 micras de espesor montadas sobre portaobjetos especiales para inmunohistoquímica y obtenidas de tejidos incluidos en parafina, preferiblemente fijados en formalina tamponada. PRINCIPIO DEL MÉTODO ANALÍTICO (hibridación in situ) La hibridación in situ (ISH) permite la detección de secuencias especificas de DNA o RNA en muestras histológicas y citológicas, sin perder los detalles morfológicos. El fundamento de la ISH está basado en la hibridación entre una secuencia de DNA o RNA marcado específicamente (sonda) y una secuencia de DNA o RNA presente en la muestra. En caso de existir complementariedad entre las secuencias se produce la hibridación, que tiene como resultado un producto hibrido. Los híbridos pueden ser fácilmente visualizados por un procedimiento de tinción inmunohistoquímica cromogénica (CISH) dirigida hacia el marcador específico de la sonda empleada. La técnica ISH es altamente sensible, específica y fácil de realizar; además, no contiene productos radioactivos. Los reactivos suministrados en este kit están perfectamente adaptados entre sí y por lo tanto, el kit constituye una herramienta de fácil uso para la realización de CISH. COMPONENTES Y REACTIVOS SUBMINISTRADOS EN EL KIT: Proteinasa K 20 tests Sonda PNA para virus de Epstein-Barr (EBER) marcada con Digoxigenina 20 tests Anticuerpo Anti-Digoxigenina 20 tests Bloqueante de la Peroxidasa Endógena 20 tests Ultrabloqueante Quanto 20 tests Amplificador del Polímero Quanto 20 tests Polímero Ultravision Quanto 20 tests Cromógeno: Tampón substrato + DAB 20 tests EQUIPAMIENTO Y MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO EN EL KIT Página 3 de 5

4 Cámara húmeda de incubación Portaobjetos tratados con silano o tratados eléctricamente Cubreobjetos Placa térmica o estufa (37ºC) Batería de desparafinado-hidratación (Xileno, etanol absoluto y a concentraciones del 80% y 70%) Tampón TBS Micropipetas Hematoxilina de contraste Microscopio óptico PROTOCOLO TÉCNICO PARA CISH EBER1 SOBRE TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA UTILIZANDO EL KIT DE DETECCIÓN DE MASTER DIAGNÓSTICA Este protocolo está recomendado para la realización de CISH sobre secciones de tejido fijado en formalina tamponada e incluido en parafina. 1. Desparafinado a. Incubar los portaobjetos con las secciones de tejido parafinado en la estufa a 60ºC toda la noche. b. Desparafinar: - Xilol 2x 10 min - Etanol absoluto 2x 5 min - Etanol 80% 5 min - Etanol 70% 5 min - Agua destilada (10 min) 2. Digestión enzimática a. Diluir 5 µl de Proteinasa K concentrada en 2 ml de Tampón TBS. b. Aplicar la solución resultante sobre el tejido e incubar 8 min a temperatura ambiente (TA). c. Lavar 3 veces con Tampón TBS a TA 3. Hibridación a. Aplicar 20 µl de sonda sobre el tejido. b. Colocar un cubreobjetos sobre la sección. c. Colocar el portaobjetos en una camera húmeda e incubar 1 hora a 37ºC. 4. Detección y revelado (manual o automático) a. Retirar el cubreobjetos y lavar 3 veces en Tampón TBS a TA b. Aplicar sobre el tejido 200 µl del bloqueante de la Peroxidasa e incubar 10 min a TA c. Lavar 3 veces en tampón TBS. d. Aplicar sobre el tejido 200 µl del Ultrabloqueante Quanto e incubar 8 min a TA. e. Desechar sin lavar. f. Aplicar sobre el tejido 200 µl del anticuerpo anti-digoxigenina e incubar 10 min a TA. g. Lavar 3 veces en tampón TBS. h. Aplicar sobre el tejido 200 µl del Amplificador del Polímero e incubar 10 min a TA. i. Lavar 3 veces en tampón TBS. j. Aplicar sobre el tejido 200 µl del Polímero Ultravision Quanto y incubar 10 min a TA. k. Lavar 3 veces en Agua Destilada l. Mezclar una gota del cromógeno DAB en 1 ml de Substrato del DAB y aplicar la solución resultante sobre el tejido; incubar 5 min a TA m. Lavar 3 veces en Agua destilada. 5. Tinción de Contraste y montaje Página 4 de 5

5 a. Teñir con Hematoxilina de Contraste. b. Azular en agua del grifo. c. Deshidratar y aclarar en alcoholes de concentraciones crecientes y xileno. d. Montar y interpretar los resultados al microscopio. INCIDENCIAS Y RECLAMACIONES Se recomienda seguir exhaustivamente todas las indicaciones contenidas en estas instrucciones técnicas. En caso de que se produzcan resultados atípicos o no esperados se ruega contacten con el delegado comercial de la zona representante de Vitro S.A. En su defecto, pueden dirigirse a Master Diagnóstica en la dirección comercial, telefónica o electrónica arriba indicada. LIMITACIONES DEL REACTIVO Si se han cumplido todas las condiciones de almacenamiento y manejo en el laboratorio, este reactivo está garantizado durante todo su tiempo de caducidad. Master Diagnóstica no es responsable de los daños, lesiones personales o pérdidas económicas en que este reactivo pueda encontrarse implicado. BIBLIOGRAFÍA: 1. Dunleavy K, Roschewski M, Wilson WH. Lymphomatoid granulomatosis and other Epstein-Barr virus associated lymphoproliferative processes. Curr Hematol Malig Rep Sep;7(3): Maeda E, Akahane M, Kiryu S, Kato N, Yoshikawa T, Hayashi N, Aoki S, Minami M, Uozaki H, Fukayama M, Ohtomo K. Spectrum of Epstein-Barr virus-related diseases: a pictorial review. Jpn J Radiol Jan;27(1): Rezk SA, Weiss LM. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorders. Hum Pathol Sep;38(9): Moore Dalal K, Antonescu CR, Dematteo RP, Maki RG. EBV-Associated Smooth Muscle Neoplasms: Solid Tumors Arising in the Presence of Immunosuppression and Autoimmune Diseases. Sarcoma. 2008;2008: Deyrup AT. Epstein-Barr virus-associated epithelial and mesenchymal neoplasms. Hum Pathol Apr;39(4): Young LS, Rickinson AB. Epstein-Barr virus: 40 years on. Nat Rev Cancer Oct;4(10): Kekis PB, Murtin C, Künzli BM, Kappler A, Buchholz B, Büchler MW, Zimmermann A, Friess H. Epstein-Barr virus-associated lymphoepithelial carcinoma in the pancreas. Pancreas Jan;28(1): Jin L, Lloyd RV. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 1997;11(1): Qian X, Lloyd RV. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol Mar;12(1):1-13 Página 5 de 5