I N V E S T I G A C I Ó N

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1 I N V E S T I G A C I Ó N CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCESOS DE OBTENCIÓN, TRANSPORTE, PROCESAMIENTO Y CRIOPRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL, OBTENIDAS DE ENERO DE 2006 A FEBRERO DE 2008 EN EL BANCO DE CÉLULAS STEM DE COLOMBIA Ávila Portillo L.M. 1, Ávila J.P. 1, Martínez C. 2, Rosas S. 3, Jaimes J.E. 4, Becerra A. 1, Gómez C. 1, Madero J.I. 1 RESUMEN La sangre del cordón umbilical (SCU) ha pasado de ser un desecho biológico a fuente potencial de células Stem hematopoyéticas (CSH) con capacidad regenerativa, por lo cual el procesamiento y criopreservación después de su obtención en condiciones que garanticen su utilización es clave en un transplante exitoso. El almacenamiento de CSH de SCU es realizado tanto en bancos de carácter público (donación de SCU) como privado (SCU para uso autólogo). Nuestro objetivo fue realizar un análisis de la experiencia de un Banco de SCU en Colombia en el cual se caracterizaron los procesos de obtención, transporte, procesamiento y criopreservación. 1 Banco de Células Stem de Colombia. 2 Estudiante Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 3 Asesora metodológica Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 4 Asesor Bioestadística externo, Bogotá, Colombia. Se diseñó un estudio de serie de casos; en el que se analizaron 1080 registros de la base de datos del Banco de Células Stem de Colombia S.A. Este análisis evidenció que el tiempo transcurrido antes del procesamiento de las muestras fue menor de 12.7±10.3 horas; el volumen promedio fue 68,2±27,6ml; el recuento inicial de células nucleadas tenía promedio de 1,03 x 10 9 cm/ mm3, con un promedio absoluto de CD34+ criopreservadas de 161,7±199,7cel/µl, el porcentaje de células CD34+ de las muestras fue de 0,228%, el 88,6% de las muestras estudiadas tenían un porcentaje de viabilidad superior al 95%, 21 muestras que corresponden al 1,9% presentaron hemocultivo positivo y el 100% de las pruebas serológicas para enfermedades infectocontagiosas fue negativas. Palabras clave: Células Stem, cordón umbilical, bancos de sangre de cordón umbilical, NETCORD. ABSTRACT Key words: Stem Cells, umbilical blood, banks of umbilical cord blood, NETCORD. 5

2 INTRODUCCIÓN Las células Stem Hematopoyéticas (CSH) provenientes de sangre de cordón umbilical (SCU) se han convertido en una alternativa en muchas enfermedades, tales como Leucemia mieloide aguda (AML) i, enfermedad de Krabbe ii y síndrome de Wiskott Aldrich iii entre otras, por lo cual los Bancos de Sangre de Cordón Umbilical (BSCU) desde sus inicios en el año de 1993 en Nueva York son cada vez más frecuentes iv-v. En Colombia existen tres bancos de criopreservación de SCU. Sin embargo, a pesar de la existencia de estos no hay hasta el momento una ley o norma que los rija en criterios como el transporte, recolección, procesamiento y criopreservación. En cada Banco de SCU estos criterios, se han definido de acuerdo a su modelo de aprendizaje, el cual cambia dependiendo del sitio de entrenamiento de su personal técnico, algunos se han entrenado en bancos de cordón públicos acreditados por NETCORD vi y otros en Bancos de Unidades de Fertilidad. Por lo cual se realizó el análisis de la base de datos del Banco de Células Stem de Colombia, el cual es un banco privado con certificación ISO-9001 dirigido por profesionales entrenados en el Banco público acreditado por NETCORD, se realizó la caracterización de los procesos de calidad que allí se manejan en relación a la recolección, procesamiento y criopreservación de muestras de SCU obtenidas entre los meses de Enero del 2006 a Febrero del MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de datos Se realizó un estudio de Serie de casos, descriptivo y retrospectivo de las muestras de sangre de cordón umbilical. Para la realización de este proyecto se analizaron 1080 registros de la base de datos del Banco de Células Stem de Colombia del periodo comprendido entre Enero del 2006 a Febrero del 2008, estas muestras fueron remitidas de ciudades dentro y fuera de Colombia. Solo se tuvieron en cuenta las muestras de SCU que poseían como mínimo los datos de: volumen de SCU, recuento celular inicial y final, tiempo de procesamiento, CD34, % de CD34, viabilidad, hemocultivos y pruebas de enfermedades infecciosas. La obtención y revisión de la base de datos fué obtenida previa autorización del Banco de Células Stem de Colombia. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para efectos del análisis estadístico se elaboró una base de datos la cual fue procesada con el paquete estadístico S.P.S.S. versión para Windows 39. realizándose un análisis descriptivo univariado construyendo tablas y gráficas, elaboradas con los estadígrafos según el nivel de medición de las variables, de manera que para las variables cualitativas se obtuvo la distribución porcentual de frecuencias mientras que para las variables cuantitativas se calcularon medidas de tendencia central. Posteriormente, se realizó un análisis mediante la prueba de Chi 2 (c 2 ) para valorar la fuerza de asociación. Es importante recalcar que para eliminar los efectos del control de sesgos y expectativas de los investigadores (validez), el procesamiento estadístico fue desarrollado por personal Bioestadística, independiente, del grupo clínico de investigación. Finalmente los datos obtenidos fueron comparados con los requisitos expuestos en la literatura mundial. Consideraciones bioéticas En el desarrollo de esta investigación se respetaron las normas de bioética y normas legales de la investigación clínica aplicada en salud según la legislación nacional e internacional, particularmente la Resolución 84 de 1993 del Ministerio de Salud. RESULTADOS Las muestras analizadas fueron tomadas un 73.3% por cesárea y solo en el 26,7% de los casos correspondió a parto natural. Al realizar el análisis sobre el origen de las muestras procesadas, se pudo determinar que el 60.8% de las muestras pertenecían a Bogotá siendo un 39.2% de las muestras provenientes de fuera de la ciudad. Por lo cual se realizó un análisis sobre el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el inicio del procesamiento en el Banco de Células Stem de Colombia, encontrándose una media de 12.7±10.3 horas, observándose una distribución multimodal asimétrica positiva con respecto a la media; indicando que en la mayoría de las muestras, el tiempo de transporte fue menor de 12.7±10.3 horas. (Gráfica 1). Frecuencia 220,0 200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 12,0 8,0 4,0 0,0 24,0 20,0 16,0 48,0 44,0 40,0 36,0 32,0 28,0 TIEMPO ANTES DEL PROCESAMIENTO Desv. tip. = 10,32 Media = 12,7 N = 1079,00 Gráfica 1. Comportamiento del tiempo antes del procesamiento. 6

3 CARACTERIZACIÓN DEL PROCESAMIENTO Al analizar las muestras recibidas se realizó una caracterización del procesamiento y obtención de células. La variable volumen de muestra en general presentaba un promedio de 68,2±27,6ml con un volumen máximo encontrado de 240ml, que para una mejor evaluación se categorizaron en los niveles A: <40 ml, B: ml, C: ml y D: >80 ml donde se puede observar, que solo un 13.2% se encuentran en la categoría A teniendo un volumen bajo que compromete su utilidad al presentar un volumen menor a 40ml. Por otra parte el 29.5% de las muestras recibidas fueron de un volumen superior a 80 ml (categoría D) consideradas desde éste aspecto como muestras optimas, además se hace notar que el 56.4% superaban en volumen el criterio de 60 ml considerado deseable para su posterior utilidad (Gráfica 2). Es importante señalar que de las 1080 muestras recibidas durante el periodo de observación fue necesario descartar 65 que corresponde al 6,0% de los cálculos relacionados con el número de células. Referente al recuento inicial de células nucleadas se encontró un promedio X 10 7 células totales iníciales, con un mínimo de X10 6 y un máximo de X10 7 antes de la reducción del volumen siendo éste el total de células contenidas en la muestra antes del procedimiento. Por otra parte, se encontró que las células totales finales fueron de 581 x 10 6 en promedio. A partir de lo anterior se pudo analizar que en el procedimiento de reducción de volumen se perdieron en promedio 455.0X10 6 células mononucleares (cmn) oscilando entre un mínimo de 246X10 4 y un máximo de 356X 10 7, con una pérdida en general del %. CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYETICAS (CD34+) Los resultados referentes al número de células CD34 positivas se puede observar en la Tabla 1, donde se muestra un promedio absoluto de 161,7 ±199,7cel/µl con un porcentaje promedio de 0,228% aún cuando osciló entre un mínimo 0,06% y un máximo de 4,79%. Con base en esto se procedió a categorizar el porcentaje de CD34+ obtenido utilizando los criterios recomendados por la literatura 5-6 con lo cual se construyó la Gráfica 3, donde se puede observar como el 70.7% de las muestras tiene un porcentaje superior al 0.1% de CD34+. A % CD34 < 40 ml D >=-80 ml 29,5% 13,2% >0.3% 18,1% 29,3% <0.1% 29,4% ml C ml 27,9% B % 52,6% Gráfica 2. Categorización del volumen de la muestra. Gráfica 3. Distribución por categorías del porcentaje de CD34+ de la muestra. Tabla 1. Células CD34+. N Válidos Media Mediana Desv. típ. Mínimo Máximo CD34 ABSOLUTO , , , ,00 TOTAL CD , , , % CD ,22752,100,292409,006 4,790 VIABILIDAD ,129 99,360 3, ,6 100,0 7

4 Respecto a la viabilidad, se puede afirmar que en el 88,6% de las muestras estudiadas se obtuvo un porcentaje de viabilidad superior a 95%. Finalmente, se analizaron los resultados de pruebas infecciosas (VIH1-2, VHB, VHC, VDRL) y de contaminación (Hemocultivo), donde se encontró que 21 muestras que corresponden al 1,9% presentaron hemocultivo positivo todas ellas tomadas en parto natural y que fueron informadas y descartadas inmediatamente. Respecto a las pruebas infecciosas el 100% de los casos fue negativo. ANÁLISIS DE ASOCIACIONES Con base en la descripción anterior se practicaron los cruces de variables dirigidos a dar respuesta a las relaciones sugeridas. Al evaluar la relación entre el volumen de la muestra y el recuento de células totales iniciales se encontró asociación significativa con base en la prueba de Chi cuadrado con p<0.05 como se puede ver en la Gráfica 4. Recuento <40 ml ml Gráfica 5. Porcentaje de CD34 en relación al volumen de la muestra. Se puede observar como a mayor volumen de la muestra el porcentaje de CD34+ aumenta ml >=-80 ml % CD34 >0.3% % <0.1% DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Recuento <40 ml ml ml >=-80 ml >8.0 xe x xE8.0 <4.0 E.80 Se puede ver que la proporción de células iniciales < 4x10 8 disminuye a medida que se incrementa el volumen de las muestras, generando una mejor calidad de las muestras almacenadas. Finalmente como se puede apreciar en la Gráfica 5 en lo referente al porcentaje de CD34+ se encontró asociación significativa con p<0.001; pudiéndose afirmar que la probabilidad de obtención de células CD 34+ es directamente proporcional al volumen de la muestra CÉL.TOT.IN. Gráfica 4. Volumen en correlación con el recuento celular. Las muestras del Banco de Células Stem de Colombia obtenidas inmediatamente después del nacimiento con la placenta in útero por personal previamente capacitado, fueron procesadas manualmente en un sistema cerrado de bolsa estéril, utilizando como criopreservante el DMSO/DEXTRAN; la criopreservación fue realizada mediante una curva de congelación controlada y las cuales posteriormente almacenadas en nitrógeno liquido a -196 C vii. El conteo de CD34 y la viabilidad fueron realizados por técnica de citometría de flujo. En el análisis realizado se determinó un tiempo transcurrido antes del procesamiento, fue de _10.3 horas, que está dentro del parámetro de 48 horas sugerido por la norma NETCORD FACT viii, lo cual se corroboró en un estudio reportado por el Banco de Células Stem de Colombia, en el cual la viabilidad disminuye un % después de las 48 horas de tomada la muestra. En la reducción de volumen manual utilizando una bolsa tansfer freezing bag con sistema cerrado, disminuye un % la recuperación de la muestra, datos similares fueron reportados en comunicación personal con instituciones que procesan manualmente. El CordMx quien procesa bajo un sistema de separación y concentración celular automatizado (Sepax-Biosafe), reportó en el año 2005 un porcentaje de recuperación de 80% ix, disminuyendo la pérdida celular por lo cual este sistema es el recomendado por la red internacional NETCORD FACT x. 8

5 Los criterios de aceptación utilizados en el Banco de Células Stem de Colombia, entre los que se encuentra un volumen mínimo de 40ml también fueron analizados, encontrándose un volumen de muestra promedio de 68,2±27,6 ml con un máximo de 240 ml. Al realizar una clasificación de las muestras se pudo determinar que un 13.2% se encuentran con un volumen bajo y un 29.5% de las muestras recibidas tenían un volumen superior o igual a 80 ml, consideradas desde este aspecto como muestras óptimas; cabe anotar que el 56.4% superaban en volumen el criterio de 60 ml considerado deseable para su posterior utilidad; CordMx maneja un volumen mínimo para procesamiento de 80 ml (10), el contraste de volumen se da por que en los bancos públicos, la muestra es de donación y la decisión de criopreservarla o no es exclusiva de los criterios de inclusión del Banco, en el caso de las muestras criopreservadas en bancos privados la decisión se da por los dueños de la muestra que previa información de las probabilidades de utilización firman un consentimiento informado. El segundo criterio de aceptación utilizado es el recuento inicial de células nucleadas siendo éste de 400 millones. Se encontró un promedio de x 10 7 cmn/ mm 3 teniendo como valores mínimos y máximos x10 6 y x10 7 respectivamente, siendo éste el total de células contenidas en la muestra antes del procesamiento; por otra parte, se encontró que al analizar el recuento final de células nucleadas el promedio fué de ,6±13.207,6 cmn /mm 3 con lo que se llegó a calcular que las células totales finales fueron de 581 x10 6 en promedio; en el procedimiento de reducción de volumen se perdieron en promedio 455.0x10 6 cmn oscilando entre un mínimo de 246 x10 4 y un máximo de 356 x10 7, con una pérdida en general del %, de forma importante el número de CD34+ criopreservadas en el Banco de Células Stem de Colombia (cuyo análisis se realiza en la plataforma de citometría de flujo estandarizada por la Sociedad Internacional de Ingeniería de Tejidos Hematopoyéticos ISHAGE xi ) arrojando un promedio de 3.23 x 10 similar a los reportados por CordMx de 2.68 x10 (10). 2. María L. Escolar, M.D., Michele D. Poe, Ph.D., James M. Provenzale, M., et al. Transplantation of umbilical-cord blood in babies with infantile Krabbe s disease N Engl J Med; 352: Slatter MA, Gennery AR. Umbilical cord Stem cell transplantation for primary immunodeficiencies. Expert Opin Biol Ther 2006; 6: (11). 4. RUBINSTEIN P,. ADAMSON JW AND STEVENS C. The Placental/Umbilical Cord Blood Program of the New York Blood Center A Progress Report Ann N Y Acad Sci. 872: García J., Amat LI., Querol S. Los Bancos de Sangre de Cordón Umbilical: una nueva contribución al tratamiento de las enfermedades hematológicas. Asociación Española de Científicos. [serial online] [6 pantallas] es/escaparate/verpagina.cgi?idpagina=1499&refcompra= 6. Net Cord Virtual Oficce. Home page. org/index.html. [On line]. [ ]. 7. Ávila L.M., Madero J.I., López C., León MF, Acosta L., Gómez C., et al. Fundamentos de criopreservación. Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología 2006; 57: NetCord-FACT. International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection, and Release. [serial online] December [citado el 10 feb 2008]; Third Edition [85 pantallas] tokyo.ac.jp/cell_processing_and_transfusión/netcord- FACT%20standard3rd.pdf 9. Calderón-Garcidueñas E.D. Evaluación del programa nacional de sangre placentaria CordMX.Logros y expectativas. Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2005; 43 (Supl 1): Sutherland DR, Anderson L., Keeney M., Nayar R., Chin- Yee I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J. Hematother Jun; 5(3): BIBLIOGRAFÍA 1. Takahashi S, Unrelated Cord Blood transplantation for adult patients with de novo acute myeloid leukemia. Blood 2004; 103: