INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA ÁREA DE ALIMENTOS

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA ÁREA DE ALIMENTOS EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR Y DE LOS PIGMENTOS OBTENIDOS DE LA MICROALGA Haematococcus pluvialis (CHLOROPHYTA:VOLVOCALES) ALES) CULTIVADA EN DIFERENTES MEDIOS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORA EN TECNOLOGÍA AVANZADA PRESENTA: Alumna: M. en C. Alicia Soledad Martínez Silva Director de tesis: Dr. Eduardo San Martín Martínez MEXICO, D. F. enero, 2010

2 Alicia Soledad Martínez Silva i

3 Alicia Soledad Martínez Silva ii

4 El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología de Microalgas, en el Laboratorio de Investigación de Química y Biología de la Universidad del Mar Campus Puerto Ángel y en el Laboratorio de Apoyo Analítico del Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada (CICATA) del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Legaria, bajo la dirección de Doctor Eduardo San Martín Martínez. Alicia Soledad Martínez Silva iii

5 Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), el apoyo económico otorgado durante el desarrollo de la tesis; mediante la beca otorgada. Alicia Soledad Martínez Silva iv

6 ÍNDICE Página INTRODUCCIÓN 1 CAPÍTULO. 1 ANTECEDENTES Pigmentos Definición Clasificación Pigmentos Naturales Carotenoides Estructura química de los carotenoides Propiedades físicas y químicas de los carotenóides Biosíntesis de carotenóides Funciones de los carotenóides Fuentes de carotenoides Generalidades de la Asraxantina Microalgas Algunas características de las microalgas Aspectos de crecimiento de las mmicroalgas Producción de compuestos de interés Haematococcus pluvialis Descripción de la especie H. pluvialis Morfología, estructura y fisiologia Presencia y distribución Composición química Aplicaciones Medios de cultivo 34 CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN 37 CAPÍTULO 3 OBJETIVOS 39 CAPÍTULO 4 MATERIALES Y MÉTODOS Organismo Pruebas preliminares Condiciones de cultivo Recuento celular Densidad celular Parámetros Poblacionales 4.5 Cosecha y secado de la biomasa 4.6 Análisis Químico Proximal 4.7 Extracción Biomasa Humeda Biomasa Seca Método HCl 4N-Acetona Método Acetona 100% Método DMSO 4.8 Determinación de Pigmentos 4.9 Evaluación del almacenamiento y estabilidad de la biomasa seca y extractos totales. Alicia Soledad Martínez Silva v

7 4.10 Separación e identificación de los pigmentos Cromatografía em capa fina Cromatografía em columna Cromatografía de alta resolución 4.11 Bioensayo Antimicrobiano Prueba de Susceptibilidad Categorias de Susceptibilidad Medios de cultivo Microorganismos de referencia Reactivación, mantenimiento y conservación de las cepas Viabilidad de las cepas Preparación de los inóculos Bacterias Hongo levaduriforme Selección del Antibiótico (Control Positivo) Control negativo Preparación de las concentraciones de los extractos Determinación de la Actividad Antimicrobiana Concentración mínima Bactericida (MBC) CAPÍTULO 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Características morfológicas de Haematococcus pluvialis 5.2 Análisis Químico Proximal 5.3 Condiciones de cultivo y parámetros poblacionales de Haematococcus pluvialis Densidad celular Comportamiento del ph y de la conductividad eléctrica con relación al crecimiento de H. pluvialis Divisiones por dia Tasa de crecimiento específico Tiempo de generación Producción diaria 5.4 Extracción y Determinación de pigmentos 5.5 Separación e identificación de los pigmentos 5.6 Bioensayo de Actividad Antimicrobiana Controles positivos Actividad Antimicrobiana de los extractos crudos CONCLUSIONES 49 RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51 Alicia Soledad Martínez Silva vi

8 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1 Estructura química de algunos Carotenoides: Carotenos. Página 6 2 Estructura química de algunos Carotenoides: Xantofilas. 8 3 Ruta resumida de la biosíntesis de los Carotenoides Isómeros configuracionales de la astaxantina (3S,3 S), astaxantina (3R,3 S) y de la (3R,3 R) astaxantina. 5 Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y marinas. 6 Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo abierto. (b) Bolsas. (c) Garrafones. (d) Estanques. (e) Fotobioreatores. (f) Carboy. 7 Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Célula vegetativa falgelada. b. Célula vegetativa sin flagelos. c. Palmella. d. y f. Aplanóspora. 8 Haematococcus pluvialis. (a) Depósito de agua estancada en los Montes Pirineos, España. (b) Pileta con agua estancada. 9 Conservación de H. pluvialis. (a) en agar y (b) en medio líquido. 10 Determinación de la actividad antimicrobiana por el método de difusión en placa (Kirby-Bauer). El perfil de acción se mide por la formación de halos de inhibición. 11 Diagrama de flujo de la curva de crecimiento microbiano de los microrganismos de referencia. 12 Micrografía H. pluvialis (40X) en forma de quiste tomada con un microscopio óptico. 13 Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar). 14 Variación del ph de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días Alicia Soledad Martínez Silva vii

9 15 Conductividad eléctrica de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días. 16 Divisiones por día de H. pluvialis en los medios f/2 y QF (fertilizante foliar) en 30 días de cultivo. 17 Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días. 18 Tiempo de generación de H. pluvialis en 30 días de cultivo en los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar). 19 Producción diaria de la microalga H. pluvialis en los diferentes medios de cultivo Alicia Soledad Martínez Silva viii

10 ÍNDICE DE TABLAS No. Tabla Página 1. Fuentes naturales de Carotenoides Principales organismos productores de Astaxantina. 3. Clasificación Taxonómica de Haematococcus pluvialis Compuestos comúnmente presentes en H. pluvialis Perfil de aminoácidos en H. pluvialis Ácidos grasos encontrados en la microalga H. pluvialis Parámetros para las diferentes condiciones preliminares de los cultivos de la microalga. 8. Condiciones iniciales de los medios de cultivo de H. pluvialis. 9. Composición química de diferentes medios de cultivo utilizados en el crecimiento de H. pluvialis. 10. Microorganismos utilizados en el ensayo antimicrobiano. 11. Antibióticos probados para definir los controles positivos Halos de inibición de los controles positivos. 64 Alicia Soledad Martínez Silva ix

11 Resumen La obtención de carotenoides de microalgas es un tema de gran importancia científica y en la industria alimenticia y acuicultura. La microalga Haematococcusp pluvialis representa una fuente natural de carotenoides como la astaxantina. Este pigmento tiene una función de un poderoso antioxidante biológico. Debido a su particular color, puede ser usado para pigmentar los salmónidos y la trucha arco iris. El objetivo de este trabajo fue estudio comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los cambios en el crecimiento celular y el contenido de pigmento en esta microalga. Se utilizaron células de H. pluvialis en forma de quiste y el f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un fertilizante foliar (QF) como medios de cultivo. La irradiancia fluctuó entre 4541,03 y 3766,26 lux. La agitación fue manual y la temperatura fue de 28 o C. La densidad celular se estimó por células directo. El ph estuvo entre 8,37 a 8,42 y la conductividad eléctrica de 135,3 a 142,1 mv. Para la extracción de los pigmentos húmedos en la biomasa húmeda se utilizó acetona 100% y para la biomasa seca se utilizó DMSO, HCl 4N y acetona 100%. La clorofila a, b, la astaxantina y los carotenoides totales se midieron mediante espectrofotómetro UV-visible. Los experimentos se llevaron a cabo 5replicas. H. pluvialis se adapto en menos tiempo en el medio QF que en el f/2. El contenido de clorofila a y b en el f/2 fue inferior a la QF. Sin embargo, el contenido de astaxantina obtenido fue mayor en el medio f/2 que en el medio QF. Los resultados que se obtuvieron no están reportados en la literatura, pero algunos autores informan que se puede obtener hasta el 7% de astaxantina en otros medios. Alicia Soledad Martínez Silva x

12 Abstract Obtaining carotenoids from microalgae is a subject of great scientific importance and within the food industry and aquaculture. The microalgae Haematococcus pluvialis represents a natural source of carotenoids such as astaxanthin. This pigment acts as functions as a powerful biological antioxidant. Due to its particular color, it can be used to pigment salmonids and the rainbow trout. The objective of this work was a comparative study between two growth mediums to assess changes in cell growth and the pigment content in this microalgae. We used cells from H. pluvialis in cyst form for cultivation in the f/2 (Guillard and Ryther, 1962) medium and in Foliar Fertilizer (QF) medium. The irradiance fluctuated between and lux. The agitation was manual and the temperature was 28 o C. The cell density was estimated by cell counts direct. The ph was between 8.37 to 8.42 and the conductivity of to mv. For the extraction of wet pigments we used 100% acetone and for dry biomass we used DMSO, HCl 4N and 100% acetone. Chlorophyll a, b, astaxanthin and total carotenoids were measured using UV-Visible spectrophotometer. Experiments were carried repeated replicated five times. H. pluvialis adapted in less time in the QF medium than in the f/2. The content of chlorophyll a and b in the f/2 was lower than QF. However, the content of astaxanthin obtained was greater for the f/2 media than for the QF medium. The results using these culture media are not reported in the literature but some authors reported up to 7% of astaxanthin in other mediums. Alicia Soledad Martínez Silva xi

13 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN En la actualidad, uno de los principales intereses en Ciencia y Tecnología de Alimentos es la extracción y caracterización de nuevos ingredientes funcionales de origen natural. Estos ingredientes biológicamente activos pueden ser utilizados no sólo como conservadores naturales contra la degradación de los alimentos, sino también se pueden añadir a los alimentos como ingredientes capaces de promover nuestra salud (Guarner y Azpiroz, 2005) Entre los compuestos activos se encuentran algunos pigmentos naturales como los carotenoides que son los responsables de los colores naturales de color amarillo, naranja y rojo, utilizado en la industria alimentaria, farmacéutica, cosmética y dietética. Más allá de su uso extensivo como colorante y el enriquecimiento de los alimentos, también se utilizan debido a su actividad pro- vitamínica A, y sus propiedades que se traducen en posibles funciones biológicas benéficas para la salud, tales como el fortalecimiento del sistema inmunológico y disminución del riesgo de enfermedades degenerativas (ciertos tipos de cáncer, las enfermedades cardiovasculares, degeneración macular y las cataratas) (Niizu, 2003). Una de las fuentes naturales de pigmentos carotenoides más apreciadas en las últimas décadas por su diversidad y propiedades terapéuticas son las microalgas. Estos organismos son una fuente natural muy interesante de nuevos compuestos (Plaza et al., 2008). Varias especies de microalgas se cultivan comercialmente en algunos países y la biomasa producida ha sido utilizada como una fuente de productos para su aplicación en la industria alimentaria. Según Pulz y Gross (2004), el mercado de alimentos funcionales, utiliza microalgas en pastas, pan, yogur, bebidas y muestra un rápido desarrollo en los países como Francia, Estados Unidos, China y Tailandia. Las principales microalgas que se cultivan comercialmente son de los géneros Chlorella Beyerinck (Chlorophyceae) y Arthrospira Stizenberger, (Cyanophyceae); para alimentos naturales ("Health food"); Dunaliella salina Teodoresco, (Chlorophyceae) para la obtención de Alicia Soledad Martínez Silva 1

14 INTRODUCCIÓN betacaroteno y Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la obtención del pigmento astaxantina (Becker, 2004). Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) es una microalga verde unicelular de agua dulce que ya ha sido estudiado por su capacidad para acumular el pigmento astaxantina bajo condiciones de estrés. La astaxantina es un carotenoide rojo-naranja con fuertes propiedades antioxidantes (Yuan y Chen, 1998). Además, como ya ha sido demostrado en otros organismos y en algunas microalgas (Borowitzka, 1999; Mendes et al., 2003; Cohen, 1999; Molina Grima et al., 2003), que junto con la astaxantina, existen diferentes compuestos con propiedades antibacterianas, antivirales y/o actividad antifúngica que se pueden esperar que se encuentren también en esta microalga. Por lo tanto, H. pluvialis puede ser considerada como una fuente natural potencial de pigmentos naturales que podrían utilizarse como ingredientes para la preparación de alimentos funcionales. Sin embargo esta microalga no es de fácil cultivo y presenta ciertas dificultades al obtener los pigmentos en unas cantidades apreciables lo que debilita sus posibilidades de uso como fuente natural dichos compuestos. Actualmente se están desarrollando medios de cultivo óptimos para su crecimiento así como una adecuada tecnología de cultivo que incrementara la producción de biomasa hasta niveles relevantes para la producción de estos compuestos. No obstante, el uso de los medios de cultivo sintéticos ha incrementado sustancialmente el valor económico para la producción de la biomasa de este microorganismo (González et al., 1999). Por lo que recientemente se ha ensayado el uso de sustratos alternativos y no convencionales (González et al., 1999, Romero et al., 2001, Vigna et al., 2002 y Vera et al., 2002). Se destaca que a partir de estos medios innovadores se han obtenido resultados comparables y superiores a los correspondientes a los medios sintéticos. En este trabajo se presenta un estudio comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los cambios en el crecimiento, el contenido pigmentos fotosintéticos y la actividad antimicrobiana de Haematococcus pluviales cultivada en medio f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un Fertilizante foliar. Alicia Soledad Martínez Silva 2

15 ANTECEDENTES CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES 1.1. Pigmentos Los pigmentos son generalmente colores que se pueden observar durante toda la vida. Están presentes en todos los organismos del mundo, siendo las plantas los principales productores. Los pigmentos naturales o sintéticos son utilizados en medicamentos, alimentos, ropa, cosméticos, decoración y en varios otros sectores Definición Los pigmentos son compuestos químicos que absorben luz en el intervalo de longitud de onda de la región visible. La producción del color se debe a la estructura específica del compuesto (cromóforo), esta estructura capta la energía y la excitación que es producida por un electrón de una órbita exterior a una órbita mayor, la energía no absorbida es refleja y/o refractada para ser capturada por el ojo, y los impulsos neuronales generados serán transmitidos al cerebro, donde puede ser interpretados como color (Delgado- Vargas, et al, 2000) Clasificación Los pigmentos pueden ser clasificados tomando en cuenta algunas de las características como origen (naturales, sintéticos o inorgánicos), estructura del cromóforo (pueden tener sistemas conjugados como los carotenoides, las antocianidas y las betalaínas), estructura de los pigmentos naturales (como los derivados del tetrapirrol, derivados de los isoprenoides, etc.) y como aditivos alimentarios (pueden ser certificados y no certificados, según la FDA) Pigmentos Naturales Hoy en día, las ventajas de los pigmentos naturales sobre los sintéticos han aumentado debido a las propiedades biológicas de los pigmentos naturales que se han ido descubierto. Además, algunos productos tienen un gran valor en el mercado sólo la utilización de tintes naturales. Sin embargo, es necesario Alicia Soledad Martínez Silva 3

16 ANTECEDENTES señalar que las ventajas de los colorantes sintéticos son muy conocidas como el alto poder de pigmentación, la estabilidad, el almacenamiento, la facilidad del proceso de obtención y, además, son más baratos y están disponibles en cantidades ilimitadas (Wissgot y Bortlik, 1996). Los pigmentos naturales presentan otra función además de embellecer el medio ambiente. Es a través de ellos, que produce el proceso de fotosíntesis, lo cual sería imposible sin la presencia de la clorofila y de los carotenoides. Asimismo, se ha reportado en la literatura, la acción antioxidante, la fotoprotección (Teramura y Middleton, 1993), los mecanismos de defensa de plantas (Snyder y Nicholson, 1990), y la participación en los procesos sexuales de las plantas y los animales. Actualmente se sabe que además de pigmento, el color y tienen diferentes funciones en el cuerpo donde estos compuestos se encuentran, estos compuestos pueden tener efectos farmacológicos beneficiosos para el consumo. Cuatro grupos principales de pigmentos son responsables de la coloración en mamíferos, aves, peces e invertebrados de importancia económica. Estos son las porfirinas, piridinas, melaninas y carotenoides (Hudon, 1994). Las porfirinas son de importancia primordial en la coloración de la cáscara de huevos de especies aviares (Lang et al., 1987). Las piridinas son responsables por muchos de los amarillos y rojos brillantes en peces, anfibios y reptiles (Nixon, 1985); estos pigmentos son solubles en agua y son de producción endógena (Hudon, 1994). Las melaninas dan lugar a los negros, grises y marrones de vertebrados y muchos invertebrados, así como también de sus rojos y amarillos. Las melaninas son polímeros heterogéneos compuestos de metabolitos de tirosina (Hudon, 1994). Los pigmentos carotenoides, obtenidos por los animales de sus dietas, confieren la mayoría de los brillantes colores rojo, amarillo y naranja, muy apreciados no sólo en acuicultura, sino también en la industria avícola (Toyomizu et al., 2001) Carotenoides Los carotenoides son pigmentos naturales responsables de los colores amarillo, naranja y rojo en muchos alimentos tales como frutas, verduras, yema de huevo, algunos pescados como el salmón, la trucha y los mariscos Alicia Soledad Martínez Silva 4

17 ANTECEDENTES (Maldonade et al., 2007). En las industrias de alimentos, los carotenoides se utilizan principalmente como colorantes, con el objetivo de restablecer el color perdido durante el procesamiento y almacenamiento así como estandarizar el color de algunos productos alimenticios. Recientemente, con el creciente interés en la salud, los carotenoides también se han añadido a los alimentos por presentar actividades biológicas que enriquecen los productos alimenticios. También son importantes precursores de muchos compuestos químicos responsables del aroma de algunos alimentos, de algunos olores florales (Sánchez-Contreras et al., 2000), de color específico y fotoprotección (Marasco y Schmidt-Dannert, 2003). Además de color, los carotenoides tienen importantes actividades biológicas como la inhibición de las enfermedades que ocasionan los radicales libres presentes, tales como la arteriosclerosis, cataratas, degeneración muscular, la esclerosis múltiple, el cáncer, las enfermedades degenerativas y cardiovasculares (Maldonade et al.,2007; Bhosale, 2004; Aksu y Eren, 2007). Industrialmente los carotenoides como el b-caroteno y la astaxantina son utilizados como colorantes naturales para alimentos o adicionados en las dietas en acuicultura (Aksu y Eren, 2007). La astaxantina es un pigmento encontrado en los animales acuáticos, tales como la langosta, el cangrejo y el camarón. Este pigmento protege contra los radicales libres, la peroxidación lipídica, el daño oxidativo del colesterol LDL, la oxidación de ácidos grasos esenciales poliinsaturados y la protección contra los efectos de la luz ultravioleta, las membranas celulares, las células y los tejidos (Hu et al., 2006). Debido a la alta tasa de insaturación, factores tales como el calor, la luz y los ácidos ocasionan isomerización de los carotenoides trans, que es la forma más estable en la naturaleza, a forma cis, promoviendo una ligera pérdida del color y de la actividad pro-vitaminíca. Los carotenoides son también susceptibles a las oxidaciones enzimáticas o no enzimáticas, que dependen de la estructura de los carotenoides, la disponibilidad de oxígeno, la presencia de enzimas, metales, pro-oxidantes y antioxidantes, la alta temperatura y la exposición a la luz (Schroeder y Johnson, 1995). Los pigmentos pueden absorber la luz sobre todo en la región ultravioleta (UV) y del espectro visible, el resto es transmitido o reflejado, y Alicia Soledad Martínez Silva 5

18 ANTECEDENTES representa el color. La estructura responsable de la absorción de la luz es el grupo cromóforo, por la que los carotenoides se caracterizan por dobles enlaces conjugados. Cada carotenoide es caracterizado por un espectro de absorción electrónica. Por lo tanto, la espectroscopia de absorción es una técnica importante en el análisis de los carotenoides (Gross, 1991). La producción comercial de los carotenoides a partir de microorganismos compite principalmente con la producción sintética por procedimientos químicos. Actualmente, los carotenoides utilizados industrialmente se obtienen por vía química o por extracción de plantas y/o las microalgas. Sin embargo, debido a la preocupación por el uso de aditivos químicos en los alimento, existe un creciente interés por los carotenoides obtenidos naturalmente por procesos biotecnológicos. Comercialmente, los carotenoides son utilizados como colorantes alimentarios y como suplementos nutricionales, con un mercado mundial estimado en US$ 935 millones/año, siendo que solamente la astaxantina representa cerca de unos US$ 150 millones en el año 2000 y, con un valor de US$ 2000/kg (Fraser y Bramley, 2004). Según Silva (2004), la producción biotecnológica de carotenoides ha aumentado debido a factores tales como la posibilidad de utilizar sustratos de bajo costo para la bioproducción; la denominación de sustancias naturales; pequeño espacio de producción, no está sujeta a las condiciones ambientales como el clima, la temporada o la composición de los suelos, y el control de las condiciones de cultivo Estructura química de los carotenoides Los carotenoides son en su mayoría compuestos tetraterpenoides formados por ocho unidades isoprenoides, siendo el esqueleto de la molécula un largo sistema central de enlaces dobles alternados (Britton, 1995). Los hidrocarburos correspondientes a la fórmula empírica C 40 H 56 son conocidos como carotenos (Figura 1) y los derivados conteniendo una o más funciones oxigenadas (aldehido, ácido caboxílico, epoxi, hidroxi, ceto, metoxi) se conocen como xantofilas, como se muestra en la Figura 2 (Schmidt et al., 1994). Los carotenoides pueden también ser acíclicos o poseer un anillo de seis miembros (ocasionalmente de cinco miembros), a uno o ambos extremos del Alicia Soledad Martínez Silva 6

19 ANTECEDENTES esqueleto molecular (Schmidt et al., 1994). Pueden también estar presentes en forma libre, así como en forma de ésteres, glicósidos, sulfatos y carotenoproteínas (Matsuno y Hirao, 1989). Figura 1. Estructura química de algunos Carotenoides: Carotenos Propiedades físicas y químicas de los carotenoides Las propiedades físicas y químicas de los carotenoides son consecuencia de su estructura química. El sistema de dobles enlaces conjugados, su más notable característica, es el cromóforo absorbente de luz que confiere a estos pigmentos su atractivo color. La mayoría de los carotenoides absorbe luz en el intervalo de nm, exhibiendo su máximo a tres longitudes de onda que resultan en un espectro de tres bandas. A mayor número de dobles enlaces conjugados, mayor el valor de l máxima. Sin embargo, la ciclación de la molécula resulta en cambio hipsocrómico (desplazamiento del l máxima hacia una más baja longitud de onda), efecto Alicia Soledad Martínez Silva 7

20 ANTECEDENTES hipocrómico (descenso en absorbancia) y pérdida de estructura fina (espectro con picos menos definidos). Figura 2. Estructura química de algunos Carotenoides: Xantofilas. El licopeno (Fig. 1), un carotenoide acíclico insaturado, es rojo y presenta l máxima a 444, 470 y 502 nm; el b-caroteno bicíclico, si bien contiene el mismo número de dobles enlaces conjugados como el licopeno, es amarillo-naranja y tiene un l máxima a 450 y 477 nm y una mera inflexión a 425 nm. El g-caroteno monocíclico es rojo anaranjado y exhibe un l máxima y espectro intermedio entre los del licopeno y b-caroteno. Otros carotenoides, en Alicia Soledad Martínez Silva 8

21 ANTECEDENTES lugar de exhibir un espectro de tres picos, presentan un espectro que consiste en una banda única, ancha y simétrica. Este es el caso de los cetocarotenoides, tales como la astaxantina, cantaxantina y equinona. Tanto, la longitud de onda de máxima absorción (l max) y la forma del espectro (estructura espectral fina) son características del cromóforo de la molécula que proveen valiosa información para identificar carotenoides (Britton, 1995) Aparte de sus propiedades de absorción de luz, la cadena polieno también confiere a los carotenoides su distintiva reactividad química, de ser muy susceptible a la oxidación e isomerización. Un gran número de isómeros geométricos pueden existir; sin embargo, los carotenoides son naturalmente de la forma trans (E), si bien la presencia de isómeros cis (Z), usualmente en pequeñas cantidades, deberá ser siempre considerada (Schmidt et al., 1994). La inestabilidad de los carotenoides respecto a la oxidación, es una característica importante de la molécula en relación a la química de los radicales libres (Britton, 1995) En lo que respecta a su solubilidad, los carotenoides son como otros compuestos isopropenoides superiores, siendo los carotenos típicos hidrocarburos no polares y las xantofilas más polares, pero insolubles en agua (Schmidt et al., 1994). Su comportamiento lipofílico hace de ellos propensos a acumularse en compartimientos lipofílicos como las membranas o lipoproteínas. La tendencia lipofílica de estos compuestos influencia también en su absorción, transporte y excreción en el organismo (Stahl et al., 1993). Sólo combinados con proteínas (caroteno-proteínas), los carotenoides son solubles en una fase acuosa. La presencia de caroteno-proteínas se observa en crustáceos tales como langosta, cangrejo y langostino (Shahidi et al., 1998). Es de gran importancia entender las propiedades físicas y químicas de los carotenoides, tales como su tamaño, forma, polaridad, siendo estas determinantes para su habilidad de encajar correctamente en su medioambiente molecular y permitirles su óptimo funcionamiento (Britton, 1995) Biosíntesis de carotenoides La biosínteis de carotenoides se produce a través de la ruta de los isoprenoides o terpenoides. El primer paso importante en la biosíntesis de carotenoides (Figura 3) es un acoplamiento cabeza con cabeza de dos Alicia Soledad Martínez Silva 9

22 ANTECEDENTES moléculas del C 20 geranil-geranil difosfato (GGPP) que da lugar al incoloro fitoeno. En los siguientes pasos, la introducción de dobles enlaces crea las propiedades absorbentes de luz, que determinan el color de los carotenoides. Finalmente, ocurren diversas variaciones estructurales, que según Britton, (1998) resultan en los cientos de carotenoides. Figura 3. Ruta resumida de la biosíntesis de los carotenoides Funciones de los carotenoides Las funciones de los carotenoides pueden ser divididas en dos grupos: (1) fenológicas y (2) fisiológicas (Latscha, 1991). En la naturaleza, el rol más evidente de los carotenoides es el de conferir la diversidad de colores observados en plantas, frutos, flores y en el reino animal. En plantas superiores, los carotenoides no sólo confieren coloración, sino también características de sabor y fragancia (tabaco, flores y frutas), a través de metabolitos de carotenoides (Enzell, 1985). Las funciones fisiológicas Alicia Soledad Martínez Silva 10

23 ANTECEDENTES de los carotenoides en plantas se relacionan con su rol en el proceso fotosintético. En la fotoprotección, los carotenoides disipan la energía lumínica usada en la fotosíntesis e inhiben la formación de especies de oxígeno reactivo (ROS), siendo ambos mecanismos de defensa contra la excesiva energía solar. Además los carotenoides participan en la colección de luz y la transferencia de energía a la clorofila, para la función de fotosíntesis (Deming-Adams et al., 1996). En animales, una de las más importantes funciones de los carotenoides es como precursores de vitamina A (Krinsky et al., 1993). Este campo ha sido extensamente estudiado debido a la importancia fisiológica de la vitamina A en el crecimiento, la visión y la reproducción. No todos los carotenoides son precursores de vitamina A; sólo 60 han sido mencionados como precursores de retinoides (Pfander, 1987). Los más importantes precursores son: a-caroteno, g-caroteno, b-criptoxantina, equinona, b-apo-12 -carotenal y por supuesto b- caroteno. Desde el punto de vista estructural, los precursores de retinoides deberán tener por lo menos un anillo b no sustituído Sin embargo, se ha encontrado que ciertas xantofilas, tales como cantaxantina, astaxantina, zeaxantina, luteína y tunaxantina, son también precursores de retinoides en peces y ratas (Matsuno, 1991). Los carotenoides participan en los mecanismos de protección contra la oxidación, atrapando dos de las moléculas ROS (Sies, 1986; Halliwell, 1996): ( 1 O 2 ) un estado excitado de una forma parcialmente reducida de oxígeno, inestable y altamente reactiva, y radicales peroxil, generados en el proceso de oxidación de lípidos (Stahl y Sie, 2003). En general, los carotenoides son considerados antioxidantes, previniendo enfermedades causadas por estrés oxidativo (Chew y Park, 2004). Los carotenoides también participan en la mejora del crecimiento (Inborr y Lignell, 1997), en la función inmune y resistencia a enfermedades en animales superiores y el hombre (Jyounchi et al., 1993; Chew y Park, 2004), en la función reproductiva, además de participar en señales sexuales, se ha observado la mejora del desempeño reproductivo de vacunos alimentados con dietas suplementadas con b-caroteno. Alicia Soledad Martínez Silva 11

24 ANTECEDENTES Fuentes de carotenoides Entre el grupo de carotenoides sintéticos, la astaxantina es el principal pigmento usado en acuicultura a nivel mundial (Higuera-Ciapara et al., 2006), siendo la cantaxantina la fuente predominante en salmónidos (Torrissen, 1986; Choubert et al., 1994; Metusalach et al., 1996). Sin embargo, ya que la astaxantina es el carotenoide presente naturalmente en el músculo de los salmónidos, la astaxantina sintética es el pigmento preferido ya que produce el verdadero color observado en estas especies. En cuanto a la cantaxantina, esta le confiere al filete una coloración más amarillo-anaranjada (Johnson, 1992). El alto costo de los carotenoides sintéticos y la creciente demanda por una pigmentación natural, ha estimulado el uso de fuentes naturales de carotenoides (Tabla 1) con potencial de industrialización. Sin embargo, estos productos participan a la fecha de sólo una pequeña fracción del mercado, debido a su limitada producción (McCoy, 1999). Es este el caso de algunos microorganismos tales como microalgas, bacterias y levaduras que se ha informado sintetizan astaxantina (Johnson y Schroeder, 1995; Amstrong, 1997) y otros carotenoides de interés. La microalga de agua dulce Hematococcus pluvialis tiene la habilidad de acumular grandes cantidades de astaxantina, a nivel de 1.5 a 5.0% w/w en base seca (Johnson y Schroeder, 1995; Krishna y Mohanty, 1998). Otra microalga que también ha dado resultados positivos en pigmentación de peces es Chlorella vulgaris (Gouveia et al., 1996; 2002); mientras que la microalga Chlorococcum sp parece ser una fuente promisoria de astaxantina, cantaxantina y adonixantina (Higuera-Ciapara et al., 2006). Es preciso señalar que además de conferir coloración apropiada, las microalgas tendrían un efecto positivo en el crecimiento, como fue mostrado en un estudio con larvas de Penaeus monodon (Darachai et al., 1999). En el campo de las levaduras, Phaffia rhodozyma es probablemente la más importante, ya que contiene astaxantina como su principal carotenoide (Andrewes y Starr, 1976), constituyendo aproximadamente 83 a 87% del total de pigmentos (Shahidi et al., 1998). El isómero óptico (3R,3 R) de astaxantina predomina en las levaduras rojas, opuesta a la configuración normal (3S,3 S) presente en otras fuentes (Andrewes y Starr, 1976). Los isómeros ópticos Alicia Soledad Martínez Silva 12

25 ANTECEDENTES tienen el mismo grado de utilización y su configuración óptica es mantenida después de su deposición en el músculo de la trucha arco iris (Foss et al., 1984). Johnson et al., (1980) han informado que Phaffia rhodozyma también es una buena fuente de proteínas y lípidos. La inclusión de esta fuente de carotenoides, aparte de su efecto positivo en la pigmentación de peces, mejora la función hepática y el potencial defensivo contra el estrés oxidativo (Nakano et al., 1995; 1999) Tabla 1. Fuentes naturales de Carotenoides. Fuente (mg/kg) Harina de flor de cempasúchil (Tagetes erecta) Harina de chile (Capsicum annuum) Microalga Chlorella sp Harina de alfalfa (Medicago sativa) Harina de glúten de maíz (Zea mais) 330 Páprika española 274 Achiote (Bixa Orellana) 265 Maíz amarillo (Zea mais) Fuente: Cuca et al., 1990 Los desechos del procesamiento de crustáceos (camarón, krill, cangrejo y langostino) tienen también potencial como fuentes de carotenoides. En vista del hecho que cerca de 70% del peso bruto de la captura constituyen desechos de procesamiento (Simpson y Haard, 1985), la necesidad de reducir los problemas medioambientales causados por el gran volumen de estos desechos (Torrissen y Naevdal, 1984; Sahidi, 1995) y su contenido de carotenoides, hacen de los desechos de crustáceos un material atractivo para su industrialización, siendo la astaxantina el carotenoide predominante (Shahidi et al., 1994; Higuera-Ciapara et al., 2006). Por lo general, este material está compuesto de sales minerales (15-35%), proteínas (25-50%), quitina (25-35%), de acuerdo con Lee y Peniston, (1982). Los subproductos de crustáceos han sido utilizados en la coloración de tegumentos y músculos de especies de importancia económica, con buenos Alicia Soledad Martínez Silva 13

26 ANTECEDENTES resultados (Torrissen et al., 1989; Coral, 1997). Desventajas de esta fuente de carotenoides son la variabilidad en la concentración de pigmento y los elevados contenidos de ceniza y quitina, que reduce significativamente su digestibilidad por los peces y limita grandemente el nivel de inclusión en la formulación de dietas. Las plantas también muestran potencial como fuentes de carotenoides, como los ensayos con pimentón rojo han dado buenos resultados, si bien se observó una más baja eficacia en comparación con astaxantina disponible comercialmente (Carter et al., 1994; Yanar et al., 1997). Además, los pigmentos de la óleo resina de páprika confieren una coloración menos deseable a la trucha arco iris, en comparación con la cantaxantina (Katar et al., 1999). En un estudio llevado a cabo con Sparus aurata (la dorada) alimentada con una dieta conteniendo harina de gluten (rica en zeaxantina) la coloración de la frente y el opérculo alcanzaron el amarillo característico de sus contrapartes silvestres (Robaina et al., 1997). Es de interés continuar investigando otras probables fuentes vegetales de carotenoides para peces. El calendula (marigold), rico en luteína, puede ser una alternativa interesante, dado su eficaz uso en la avicultura para la coloración de la yema del huevo y de la piel Generalidades de la astaxantina. La astaxantina (3,3 -dihidroxi-b,b-caroteno-4,4 -diona) es un oxicarotenoide como se observa en la Figura 4 y pertenece al grupo de las xantofilas. La astaxantina producida industrialmente presenta una molécula idéntica a aquella presente en organismos vivos, siendo una mezcla de los isómeros (3S, 3S), (3R, 3S) y (3R, 3R) en proporciones 1:2:1, respectivamente (Fig. 4). Al igual que otros carotenoides, este pigmento está formado por ocho unidades de isopreno que por condensación dan estructuras carbonadas de cuarenta átomos, llamados tetraterpenos. La fórmula molecular de este carotenoide es C 40 H 52 O 4 y posee un peso molecular aproximado de Este pigmento fue identificado químicamente por Kühn y Sorenson, (1983) y presenta formas de cristales de color violeta Alicia Soledad Martínez Silva 14

27 ANTECEDENTES oscuro, su punto de fusión es de aproximadamente 224 o C. Es insoluble en soluciones acuosas, pero soluble en diclorometano (30 g/l), en cloroformo (10 g/l), acetona (0.2 g/l), dimetilsulfóxido (0.5 g/l) y otros disolventes polares. Es sensible a la luz, a la temperatura, a los ácidos, al oxígeno y a la presencia de álcalis. En condiciones de saponificación sufre una conversión a astaceno. La astaxantina presenta dos carbonos asimétricos en la posición 3 y 3 (Fig. 4) y puede existir en cuatro configuraciones, incluyendo los enantiómeros idénticos (3S,3 S; 3R,3 R) y formas meso (3R,3 S; 3 R,3S) (Müller et al., 1980). Figura. 4. Isómeros configuracionales de la astaxantina (3S,3 S) astaxantina, (3R,3 S) astaxantina; (3R,3 R) astaxantina. El isómero configuracional 3S,3 S, se encuentra presente en los huevos de la langosta (Homarus gamarus), al igual que en la microalga H. pluvialis, hecho que causó controversia y frenó el desarrollo comercial de la producción de astaxantina, utilizando como fuente natural a P. rhodozyma, por las restricciones que pudiera imponer la FDA al considerar que el isómero 3R,3 R no se encontraba en la naturaleza por lo que fue prohibido el uso de astaxantina como aditivo para alimento de peces. Estudios posteriores demostraron que los isómeros meso y sus enantiómeros se encuentran en huevos de langosta, camarón, salmón en el zooplancton y el krill del Atlántico. Alicia Soledad Martínez Silva 15

28 ANTECEDENTES Por lo tanto, el isómero de astaxantina que ingiere el salmón carece de relevancia biológica (Johnson et al., 1980). Tabla 2. Principales organismos productores de Astaxantina. Especie Contenido total de Astaxantina (mg/100g) Astaxantina esterificada Principal isómero Salmón Sockeye 26 a 37 Libre y esterificada** 3S-3 S Salmón Coho 9 a 21 Libre y esterificada** 3S-3 S Salmón Chun 3 a 8 Libre y esterificada** 3S-3 S Salmón Chinook 8 a 9 Libre y esterificada** 3S-3 S Salmón rosa 4 a 6 Libre y esterificada** 3S-3 S Salmón Atlántico 3 a 11 Libre y esterificada** 3S-3 S Trucha arcoiris 1 a 3 Libre y esterificada** 3S-3 S Huevos de salmón 0 a 14 Esterificada** * N. D. Besugo rojo 2 a 14 Esterificada** * N. D. Huevos de besugo 3 a 8 N. D. N. D. Langosta Libre y esterificada** N. D. Copépodos Esterificada** * 3R-3 R Langostilla Esterificada** * 3R-3 R Aceite de langosta 72.7 Esterificada** * N. D Harina de cangrejo 13.7 Esterificada** * 3S-3 S Camarón del Ártico Esterificada** * 3R-3 R Phaffia f. (levadura) Esterificada** * 3R-3 R Astaxantina sintética 800 Libre 3R-3 S H. pluvialis Esterificada** * 3R-3 S *Los crustáceos en donde se encontraron mayormente los isómeros 3S -3 S. **Dependiendo del tejido, la astaxantina se puede encontrar libre o esterificada. ***También contienen pequeñas cantidades de astaxantina libre. N.D. No detectado. Fuente: Christiansen y Torrissen, Alicia Soledad Martínez Silva 16

29 ANTECEDENTES La astaxantina es un pigmento carotenoide presente en animales marinos tales como los salmones y los crustáceos, ya que estos animales no pueden sintetizar astaxantina por sí solos la toman en sus alimentos naturales la cual es adicionada a la alimentación de los salmones, trucha y camarones cultivados para intensificar su color. En la tabla 2 se describe el contenido total de astaxantina en varios organismos. La astaxantina posee una actividad antioxidante más alta que el b-caroteno y el a-tocoferol (Yamane et al., 1997). La función principal de este colorante es realizar una fotoprotección pasiva (como filtro), reduciendo la cantidad de luz disponible al complejo colector de luz del fotosistema II, minimizando el riesgo de fotoinhibición en cloroplastos (Linden, 1999). La astaxantina es usada para la pigmentación de la piel y la carne de peces, sobre todo salmónidos, aunque también en cultivos de crustáceos, dorada, rodaballo y peces ornamentales (Johnson y An, 1991; Lorenz y Cysewski, 2000). En los últimos años el interés por este pigmento ha ido incrementándose a medida que nuevos estudios le confieren nuevas propiedades y no sólo la capacidad de pigmentación. La astaxantina tiene un elevado potencial como antioxidante, inmunoregulador, anti-inflamatorio y agente anticarcinogénico (Guerin et al., 2003; Shahidi et al., 1998). Influye también en la reproducción en animales: en salmónidos es movilizada desde el músculo a los ovarios antes de la puesta (Nakano et al., 1999; Bell et al., 2000). La carencia de este pigmento en la dieta de las larvas de peces puede llevar a problemas en el desarrollo larvario como sucede en larvas de halibut produciéndose una migración anormal del ojo y una mala pigmentación (Rønnestad et al., 1998; Hamre et al., 2002) Microalgas Algunas características de microalgas Las algas son organismos pertenecientes al reino vegetal, que comprenden un grupo muy diverso de organismos fotosintetizadores (Sur y Whittick, 1987). Se clasifican como talófitas, es decir, plantas inferiores, por presentar una estructura simple no vascularizada con ausencia de raíz, tallo y hojas. Sus Alicia Soledad Martínez Silva 17

30 ANTECEDENTES estructuras reproductivas están desprotegidas (Critogamia), productoras de esporas y desprovistas de semillas y flores (Lee, 1989). Las microalgas tienen similitudes en muchos aspectos comunes con las plantas superiores, como por ejemplo la composición de sus carbohidratos de reservas, proteínas y pigmentos fotosintéticos. Tienen la clorofila "a" como sus pigmentos fotosintéticos primario (Van Den Hoek et al., 1989). Otros tipos de pigmentos, como los carotenoides (b-caroteno y fucoxantina), la ficocianina y ficoeritrina presentan una distribución más limitada en las algas, que funcionan como pigmentos accesorios (Sur y Whittick, 1987). Las microalgas presentan una amplia distribución geográfica, se pueden encontrar en prácticamente todas las condiciones ambientales de la Tierra, desde los suelos fértiles hasta los desiertos fríos y calientes. Sin embargo, son en los ambientes acuáticos, tanto marino y en aguas continentales, donde se encuentra mayor prevalencia de microalgas (Lee, 1989). El término microlaga no tiene ningún valor taxonómico, incluye microorganismos algales con clorofila a y otros pigmentos fotosintéticos, son capaces de realizar fotosíntesis oxígénica y, que para su caracterización (sistemática) implica la consideración de una serie de criterios (Hoek et al., 1995; Raven et al., 2001). Como lo indica Tomasello (2004), las microalgas han sido tradicionalmente clasificadas tomando en cuenta diversos criterios, tales como los tipos de pigmentos, la naturaleza química de los productos de reserva y los compuestos de la pared celular. Asimismo, otros aspectos han sido considerados como criterios morfológicos y citológicos, como la aparición de las células flageladas, la estructura de los flagelos, los procesos de formación del núcleo en la división celular, la presencia y caracterización de envoltorio del cloroplasto y la posible relación entre el retículo endoplasmático y la membrana nuclear. Además de los criterios anteriormente mencionados, las técnicas de biología molecular actuales se han utilizado para la clasificación de las microalgas (Hu, 2004). Bajo el nombre de microalgas se incluyen organismos con dos tipos de estructura celular: 1. Microalgas que presentan una estructura celular procariota, representan la división Cyanophyta (cianobacterias) y Prochlorophyta; Alicia Soledad Martínez Silva 18

31 ANTECEDENTES 2. Microalgas que presentan una estructura celular eucariota, representan la División Chlorophyta Euglenophyta, Rhodophyta, Prymnesiophyta (Haptophyta, según Teixeira, 2002), Heterokontophyta (Bacillariophyceae, Chrysophyceae, Xanthophyceae, etc), Cryptophyta y Dinophyta de acuerdo a la clasificación de Hoek, Mann y Jahns (1995). A pesar de las diferencias estructurales y morfológicas (Figura 5) entre los representantes de cada división, son similares fisiológicamente y tienen un metabolismo análogo al de las plantas (Abalde et al., 1995) Figura 5. Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y marinas. Las microalgas se encuentran principalmente en el medio marino, en agua dulce y el suelo. Estos organismos son responsables de al menos el 60% de la producción primaria de la Tierra (Chisti, 2004). De acuerdo con Arredondo-Vega (1995), las microalgas (productores primarios) almacenan la energía solar, convirtiéndola en energía biológica, siendo la biomasa microalgal la base de muchas cadenas tróficas en los ambientes acuáticos. Los constituyentes de este nivel trófico sintetizan nuevos materiales orgánicos a partir de sustratos inorgánicos, tales como sales (nutrientes), CO 2 y agua, y Alicia Soledad Martínez Silva 19

32 ANTECEDENTES esta energía biológica se utiliza en su parte como alimento para organismos que constituyen el segundo nivel trófico (consumidores primarios), dando continuidad a las cadenas tróficas acuáticas. En los ambientes acuáticos, las microalgas son, al menos en parte del ciclo de vida, el alimento principal de los animales fitófagos como algunas especies de peces, moluscos (filtradores) y de crustáceos, por ejemplo. Además, todos los organismos vivos (acuáticos y terrestres) dependen directa o indirectamente, del oxígeno proveniente de la fotosíntesis realizada por las microalgas para su respiración (Shelef y Soede, 1980). Según Borowitzka (1999), las microalgas pueden ser cultivadas en diferentes sistemas de cultivo, con volúmenes que van desde unos pocos litros hasta miles de millones de litros. En general, los sistemas de producción son poco sofisticados (Figura 6), ya que muchas empresas desarrollan sus cultivos en sistemas de tanques abiertos con fondo de tierra y con escaso o nulo control de los parámetros ambientales. (b) (a) (c) (d) (e) (f) Figura 6. Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo abierto. (b) Bolsas. (c) Garrafones. (d) Estanques. (e) Fotobioreatores. (f) Carboy. Recientemente, algunos cultivos se han desarrollado en los equipos específicos, llamados fotobioreatores donde se pueden controlar los Alicia Soledad Martínez Silva 20

33 ANTECEDENTES parámetros ambientales y esto implica un aumento de la productividad, que permite la producción de compuestos de alto valor comercial (Tredici, 2004). Muchas de las sustancias sintetizadas y acumuladas por las microalgas se encuentran también en las plantas, quienes evolucionaron a partir de las microalgas verdes o Chlorophyceae (Raven et al., 2001). Sin embargo, según Cohen (1986) y Richmond (1990a), la producción de microalgas puede ser justificada por presentar diversas ventajas, dentro de las cuales pueden destacarse las siguientes: r Un cultivo de microalgas es un sistema biológico eficiente en el aprovechamiento de la energía solar para la producción de materia orgánica, donde muchas especies crecen más rápido que la plantas terrestres, lo que facilita mayores rendimientos biomasa (mayor productividad). r Su naturaleza unicelular asegura una biomasa con la misma composición bioquímica, como ocurre en las plantas terrestres, que proporcionan compuestos localizados en partes específicas: en frutas, hojas, semillas o raíces. r Mediante la manipulación de las condiciones ambientales de cultivo (por ejemplo luz, temperatura, nutrientes) muchas especies pueden ser inducidas a sintetizar y acumular grandes concentraciones de proteínas, carbohidratos, lípidos, etc. Estos compuestos tienen un alto valor comercial, principalmente porque son productos naturales. r Puede crecer bien en regiones con condiciones climáticas extremas. Los cultivos se pueden desarrollar con agua marina o de estuarios, los cuales pueden ser no convencionales empleado cultivos de plantas con poco valor a la agricultura, o con el agua proveniente de diversos procesos de producción (agrícola, industrial y de residuos domésticos, por ejemplo). r El ciclo de vida de la mayoría de las microalgas se completa en pocas horas, lo que favorece la selección de cepas y al mejoramiento genético de especies. El número exacto de especies de microalgas aún se desconoce, actualmente se encuentra información que puede haber entre 200,000 y varios Alicia Soledad Martínez Silva 21

34 ANTECEDENTES millones de individuos de este grupo. Esta diversidad también se refleja en la composición bioquímica y, por tanto, las microalgas son una fuente de una cantidad ilimitada de productos, como ácidos grasos poliinsaturados, colorantes, enzimas etc. (Norton et al., 1996; Pulz y Bruto, 2004) Aspectos de crecimiento de las microalgas Tanto en el medio ambiente natural como en los cultivos, el crecimiento de una población de microalgas es el resultado de la interacción entre los factores biológicos, físicos y químicos (Raven, 1988). Los factores biológicos están relacionados con su propio metabolismo de las especies cultivadas, así como la posible influencia de otros organismos en el desarrollo microalgal. En cuanto a los factores físico-químicos que afectan el crecimiento de las microalgas, son principalmente reportados los estudios sobre la luz, la temperatura, la salinidad y la disponibilidad de nutrientes (Lourenço et al., 2002). Según Gladue (1991), la mayoría de las especies microalgales son fotoautotróficas, es decir, a través de la fotosíntesis obtiene energía de la luz para fijar el carbono, necesario para la construcción de la biomasa. Así mismo, la relación entre la síntesis del material orgánico como reflejo de la producción fotosintética puede ser expresada principalmente por el aumento de la población microalgal (Balech, 1977). La condición de la luz, que debe ser considerada en términos de fotoperíodo (tiempo de exposición a la luz, o fotoperíodo), la intensidad y la calidad (longitud de onda), es de fundamental importancia para las microalgas (Dubinsky, 1990; Sánchez-Saavedra y Voltolini, 1994). El hecho de que la luz varíe tanto en el espacio (profundidad y latitud) y en el tiempo (diario y estacional), implica ser un factor condicionante para el crecimiento planctónico. Los pigmentos fotosintetisantes microalgales pueden ser clasificados en tres grupos: la clorofila, los carotenoides y las ficobilinas, siendo que, cada uno difiere en su composición química y presenta diferente capacidad de absorción de la luz en una determinada longitud de onda (Ronda, 1983). En cultivos fotoautotróficos, la cantidad energía luminosa recibida por el sistema fotosintético afectará la cantidad de carbono que puede ser fijado, Alicia Soledad Martínez Silva 22

35 ANTECEDENTES determinando la producción de biomasa y la tasa de crecimiento de los cultivos microalgales (Tzovenis et al., 2003). Del mismo modo, otros diversos aspectos del metabolismo de las microalgas son también influenciados por las condiciones luminosas. Según Gunkel (1970), la cantidad, la calidad y la movilidad de los pigmentos fotosintéticos, la distribución horizontal y vertical del fitoplancton en las masas de agua y el tamaño y la morfología de las células, entre otros, están correlacionan con las condiciones de luz, tanto cuantitativamente como cualitativamente. En cuanto a la nutrición, para un crecimiento óptimo, las microalgas tienen la necesidad de una serie de nutrientes. Entre las especies, ocurren muchas variaciones relacionadas principalmente con la cantidad de nutrientes en el medio. Sin embargo, estas necesidades nutricionales dependen de distintas condiciones ambientales (Abalde et al., 1995). En cuanto a los nutrientes, las microalgas requieren C, N, O, H y P, además de Ca, Mg, S y K. Como micronutrientes, por lo general requieren Fe, Mn, Cu, Mo y Co, mientras que algunas microalgas también requieren bajas concentraciones de vitaminas en el medio de cultivo (Guillard, 1975). Se sabe que ciertas microalgas tienen necesidades específicas. Además de los factores descritos anteriormente, otros pueden influir en el desarrollo de los cultivos como el tamaño y la forma de los depósitos, el tamaño de las células (volumen celular), la aireación de los cultivos, el ph, etc (Richmond, 1990) Producción de compuestos de interés Varias microalgas han sido estudiadas y algunas especies han sido ampliamente utilizados en la acuicultura, en la alimentación humana y animal, en la agricultura, en el tratamiento de aguas residuales, en la reducción de dióxido de carbono de la atmósfera, en la sustitución de los combustibles fósiles y en la obtención de muchos compuestos (Borowitzka, 1994; Molina Grima et al., 1995, Shale, 2000, Richmond, 2004). Además de la consolidada producción de microalgas para la obtención de biomasa, las investigaciones relacionadas con el cultivo de microalgas aumentaran las perspectivas para la producción de nuevos combustibles, biopolímeros, biofertilizantes, plaguicidas, ácidos grasos y pigmentos, así como muchos otros compuestos bioactivos que Alicia Soledad Martínez Silva 23

36 ANTECEDENTES pueder ser utilizados en alimentos funcionales (Skulberg, 2000; Skulberg, 2004). Las proteínas son los componentes esenciales de las microalgas y su valor nutricional está determinado por el contenido y disponibilidad de los aminoácidos que la constituyen. Los lípidos típicos de las microalgas son los ésteres de glicerol y los ácidos grasos que contengan un intervalo de carbono entre C 12 y C 20 (Romero, 1999). Otro hecho que despierta el interés en estos microorganismos son las altas tazas de crecimiento, que establecen ventajas tecnológicas y comerciales en comparación con las técnicas convencionales de producción de nutrientes (Dufossé et al., 2005). La fracción lipídica de las microalgas puede contener cantidades significativas de constituyentes de composición semejante a la de aceites vegetales. El potencial de aplicación de los aceites extráidos de estos microorganismos es muy amplio, pudiendo ser utilizados en la extracción de ácidos grasos esenciales para la alimentación humana y para la industria en la manufactura de surfactantes y cosméticos (Borowitzka y Borowitzka, 1988). Es reconocido que las microalgas tienen la capacidad de sintetizar compuestos nutracéuticos, como los ácidos grasos poli-insaturados (ácido araquidónico - ARA, ácido eicosapentaenoico -EPA y ácido docosahexaenoico -DHA, por ejemplo) y pigmentos carotenoides (astaxantina, b-caroteno, luteína y cantaxantina, etc.) que presentan propiedades terapéuticas (Gill y Valivety, 1997; Ohshima, 1998; Tripathi et al., 1999). Actualmente, las microalgas son comercializadas como alimentos naturales ("health food") o como suplementos alimenticios y son encontradas en polvo ("sun dried" o "spray-dried ), en forma de tabletas, cápsulas o extractos. Las microalgas, son incorporadas en pastas, bocadillos, dulces, bebidas, etc., tanto como suplemento nutricional y como colorante natural (Becker, 2004; Coll et al., 2004; Pulz y Bruto, 2004) Haematococcus pluvialis Descripción de la especie H. pluvialis Haematococcus pluvialis, también es conocido como Haematococcus lacustris o Sphaerella lacustris. Es una microalga verde, unicelular, de agua Alicia Soledad Martínez Silva 24

37 ANTECEDENTES dulce, que en su clasificación taxonómica pertenece al Phylum Chlorophyta, como se muestra en la Tabla 3 (Bold y Wynne, 1985). El Phylum Chlorophyta incluye todas las algas con plástidos rodeados por dos membranas, que contienen los pigmentos fotosintéticos clorofila a y b y que forman estados flagelados de esporas o gametos. El principal producto de almacenamiento de carbohidratos es el almidón (a-1,4-glucano) depositado dentro del plástido. Tabla 3. Clasificación Taxonómica de Haematococcus pluvialis. PHYLLUM CLASE ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE CHLOROPHYTA CHLOROPHYCEAE VOLVOCALES Haematococcaceae Haematococcus pluvialis Las clorofitas, o algas verdes forman un grupo muy extenso, que se considera como el más evolucionado entre las algas. Tienen características que las distingue de las demás algas, y las acerca a los briofitos y las plantas vasculares, como por ejemplo la composición de los polisacáridos que producen, o la presencia de las clorofilas a y b. El Phylum engloba varias clases, subdivididas en unos 500 géneros y 8000 especies. Sus características principales son las siguientes: 1. Aunque algunas son macroscópicas, la mayoría son microscópicas. Muchas son planctónicas, y viven suspendidas en el medio como organismos unicelulares aislados o agrupados en colonias, o en forma unicelular. Otras son bentónicas, y pueden ser epilíticas o perifíticas. 2. Las células pueden realizar movimientos fototácticos, mediante secreción de mucílagos o por la presencia de flagelos (zoidios). Las células flageladas son isocontas, esto es, tienen los flagelos con estructuras iguales pero que difieren en su longitud. Normalmente hay dos flagelos por cada célula. 3. En los cloroplastos coexisten varios pigmentos, además de las clorofilas, Alicia Soledad Martínez Silva 25

38 ANTECEDENTES xantofilas, luteína y zeaxantina. Pero estos pigmentos no enmascaran a la clorofila, por lo que el color predominante es el que les da el nombre de algas verdes. 4. En algunos casos las células tiene pirenoides, que se encuentran dentro del cloroplasto, y a menudo penetrados por los tilacoides. 5. Las reservas de polisacáridos de las células están en forma de gránulos que pueden encontrarse alrededor del pirenoide, cuando lo hay, o dispersos en el estroma del cloroplasto, pero no libres en el citoplasma como ocurre en las demás algas. 6. Su pared celular está compuesta, principalmente, de celulosa. 7. La mayoría son de agua dulce, pero las hay también terrestres y marinas Morfología, estructura y fisiología de H. pluvialis Como se muestra en la Figura 7 el ciclo de vida típico de H. pluvialis. En condiciones favorables, los cultivos de esta microalga se componen generalmente de células vegetativas flageladas junto con células vegetativas en reposo. Las células flageladas son esféricas o elipsoidales con dos flagelos de igual longitud que salen de un extremo anterior. Las células contienen un único cloroplasto en forma de copa con varios pirenoides. En los cultivos líquidos, las células biflageladas (zooesporas) poseen un pared delgada, separada de la plasmalema por un gran espacio, que es atravesado por finas hebras citoplasmáticas que puede verse seccionadas longitudinalmente, transversalmente u oblicuamente (Santos y Mesquita, 1984). En este estado, las células persisten y poseen clorofila a, b y los carotenoides primarios que normalmente se encuentran en las Clorofitas y en los cloroplastos de las plantas superiores, tales como b-caroteno, luteína, violaxantina, neoxantina y zeaxantina (Harker et al., 1996). Las células flageladas móviles dejan de dividirse después de unas cinco duplicaciones celulares. Poco después las zooesporas dejan de dividirse, ocurre la fusión celular, y dentro de las próximas 50 horas, el contenido de ADN de la mayoría de las células se duplica (Lee y Ding, 1994). A continuación, las células pierden sus flagelos y se convierten en una forma esférica no móvil. Alicia Soledad Martínez Silva 26

39 ANTECEDENTES Las células no móviles muestran una pared celular gruesa, debajo de esta pared, un espacio pequeño periplásmico, con una electro-densidad variable y limitado internamente por una plasmalema bastante sinuosa. Las otras características ultra-estructurales del protoplasma son similares a las células móviles, pero no hay estigma ni vacuolas contráctiles (Santos y Mesquita, 1984). Cuando las condiciones ambientales llegan a ser adversas (privación de nutrientes, alta irradiancia de luz o alta salinidad) las células sufren cambios morfológicos, fisiológicos y en las características fotosintéticas, resultando así la formación de grandes aplanósporas rojas resistentes a las condiciones ambientales extremas (Boussia y Vonshak, 1991). Durante la transformación, las células microalgales (ligeramente redondeadas), pierden sus flagelos, haciéndose células enquistadas inmóviles. A continuación, se forma una vaina trilaminar resistente a la acetólisis y se genera una pared secundaria de este material base y engrosada, coincidiendo con una expansión del volumen celular (Montsant et al., 2001; Hagen et al., 2002). Entonces se comienza a producir carotenoides secundarios tales como cantaxantina, echinenone y en particular, del pigmento rojo astaxantina seguido de una disminución de clorofilas y carotenoides primarios (Harker et al., 1996). Los microscopios de luz y electrónicos han revelado que, en las células móviles, aparecen las primeras esferas pequeñas de inclusiones de astaxantina (limitadas cada una de ellas con una biomembrana no verdadera) en el citoplasma perinuclear, los gránulos del pigmento no se encuentran dentro de ningún orgánelo o vesícula (Santos y Mesquita, 1984). En los quistes que están madurando el número de depósitos de pigmento aumenta y toman una variedad de formas. La unión de los gránulos globulares depende del incremento de las cantidades de astaxantina formada y de las edades de las células. En las células maduras enquistadas el citoplasma están casi uniformemente rojas con reducidas cantidades de pigmentos en los cloroplastos. La astaxantina se dispersa hacia la periferia de las células de Haematococcus bajo la inducción de luz y se mueve hacia el centro después que se interrumpe la iluminación (Yong y Lee, 1991). Sin embargo, este proceso es reversible, es decir, cuando los quistes Alicia Soledad Martínez Silva 27

40 ANTECEDENTES maduros se transfieren a un medio fresco y se exponen a una baja de luz, las células hijas intracelulares se liberan de las células enquistadas maduras dentro del medio, y las células vegetativas se regeneran de las células hijas. La germinación coincide con la clorofila y síntesis de proteínas, y la degradación de carotenoides (Fabregas et al., 2003). a b c f d Figura 7. Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Célula vegetativa flagelada. b. Célula vegetativa sin flagelos. c. Palmella. d y f. Aplanóspora Presencia y distribución de Haematococcus pluvialis H. pluvialis se distribuye ampliamente y ha sido aislada en Europa, África y en América del Norte, a partir de cortezas secas de piedra, en los depósitos de agua en los acantilados, en los musgos de los estanques e incluso en una fuente (Figura 8) de agua bendita en el patio de una iglesia de Zúrich (Pringsheim, 1966). Algunas especies fueron recolectadas dos veces por lo menos en Minnesota (U. S), pero no han sido estudiados los cultivos (Thompson y Wujek, 1989). Este género también se encuentra muy extendido en Canadá, incluyendo British Columbia (Stein y Borden, 1979), Nunavut (Sheath y Steinman, 1982), Ontario (Duthie y Socha, 1976), en Europa: Gran bretaña (Pentecost 2002), Alemania (Toepel et al., 2005), Portugal (Sociedad Española Alicia Soledad Martínez Silva 28

41 ANTECEDENTES de Ficología, 2008), Rumania (Caraus, 2002), España (Alvarez y Cobelas, 1982, Aboal, 1988b, Sociedad Española de Ficología, 2008); Suramérica: Argentina (Damiani et al., 2006); Asia: China (Hu y Wei, 2006) y en las Islas del Pacífico: Islas en Hawai (Sherwood, 2004). H. pluviales también ha sido reportado en México (Ortega, 1984). (a) (b) Figura 8. Haematococcus pluvialis. (a) Depósito de agua estancada en los Montes Pirineo, España. (b) Pileta con agua estancada. La extensa presencia de Haematococcus en cuerpos de agua temporales y no en permanentes se debe, en parte, al hecho de que en esos depósitos, están comúnmente libres de la competencia de otras microalgas, y no a ninguna característica inherente de los depósitos de agua. Haematococcus pluvialis se puede adaptar bastante bien para sobrevivir en condiciones extremas y en las fluctuaciones luz, de temperatura, concentración de sales, que muchas otras microalgas, debido a su capacidad de enquistarse de manera rápida (Proctor, 1957). Pringsheim (1966) sugiere que H. pluvialis se distribuyó como quistes secos por el viento, de lo contrario no podría alcanzar la mayoría de las localidades donde se ha encontrado Composición química de Haematococcus pluvialis La composición general de esta microalga consiste comúnmente en carotenoides, ácidos grasos, proteínas, carbohidratos y minerales. Tabla 4. Compuestos comúnmente presentes en H. pluvialis. Compuestos Mínimo Máximo Media Alicia Soledad Martínez Silva 29

42 ANTECEDENTES Proteínas (%) Carbohidratos (%) Grasas (%) Fierro (%) Humedad (%) Magnesio (%) Calcio (%) Biotina (mg/lb) L-carnitina (ug/g) Ácido fólico (mg/100g) Niacina (mg/lb) Ácido pantoténico Vitamina B1 (mg/lb) < Vitamina B2 (mg/lb) Vitamina B6 (mg/lb) Vitamina B12 (mg/lb) Vitamina BC (mg/lb) Vitamina BE (IU/lb) Cenizas (%) NatuRose Technical Bulletin # 060. Tabla 5. Perfil de aminoácidos en H. pluvialis. Aminoácidos Valor mínimo (%) Valor máximo (%) Valor medio (%) Triptófano Ácido aspartico Treonina Serina Ácido glutamico Prolina Glicina Alanina Cisteína Valina Alicia Soledad Martínez Silva 30

43 ANTECEDENTES Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Histidina Lisina Arginina NatuRose Technical Bulletin # 060. Tabla 6. Ácidos grasos encontrados en la microalga H. pluvialis. Ácidos grasos Media (%) Mínimo (%) Máximo (%) C12:0 Laurico <0.01 < C14:0 Miristico C16:0 Palmítico C16:1 Palmitoleico C17:0 Margarico C17:1 Margaroleico C18:0 Estearico C18:1 Oleico C18:2 Linoleico C18:3 Linolenico C18:3 gamma linolenico omega C18:4 Octadecatetraenoico C20:0 Arachidico C20:1 Gadoleico C20:2 Eicosatrienoico C20:3 Gama Eicosatrienoico C20:4 Arachidonico C20:5 Eicosapentaenoico omega C22:0 Behenico C24:0 Lignocerico NatuRose Technical Bulletin # 060. Alicia Soledad Martínez Silva 31

44 ANTECEDENTES Aplicaciones de Haematococcus pluvialis La microalga H. pluvialis representa la más rica fuente natural de astaxantina, y ahora es cultivado a gran escala (Olaizola 2000; Olaizola y Huntley, 2003). El contenido de astaxantina en esta microalga puede superar el 4% de peso seco, este valor es por ahora el más alto reportado para cualquier microorganismos, incluyendo bacterias, hongos y otras microalgas (Boussiba 2000). La astaxantina es una xantofila de fuerte actividad antioxidante, diez veces superior que el b-caroteno y más de 500 veces más efectivo que el a-tocoferol, la astaxantina se ha propuesto como la supervitamina E (Jyonouchi et al.,1994). La dosis diaria recomendada es de 4 mg (Odeberg et al., 2003). Hematococcus contiene principalmente mono-ésteres de astaxantina ligados a ácidos grasos 16:0, 18:0, 18:2 y 18:1 (Restrøm et al., 1981a), teniendo los no esterificados, los mono y di-ésteres una configuración pura (3S, 3 S) (Grung et al., 1992). Sin embargo, esta microalga exhibe ciertas características desfavorables para su cultivo, tales como tasa lenta de crecimiento y ciclo de vida complejo, en comparación con otras microalgas exitosamente cultivadas a escala comercial, como la Dunaliella spp. y la Spirulina spp. (Cifuentes et al., 2003). El interés en la producción y comercialización de astaxantina microalgal para el consumo humano también ha aumentado, la inminente aprobación de la U. S. Food and Drug Administration (FDA) para su uso como ingrediente en suplementos dietéticos, y para su aprobación en varios países europeos (Cysewski y Lorenz, 2004). El mayor mercado para la astaxantina ha sido la acuicultura, donde es especialmente utilizado para el color rojizo a la carne del salmón cultivado (Tripathi et al., 1999). La astaxantina se vende a US$2500 por kg con un mercado mundial anual estimado en US$200 millones (Lorenz y Cysewski, 2000). En el mercado, los productos se encuentran en forma de concentrados en polvo, liofilizados o biomasa deshidratada, o bien como extracto de aceite vegetal. Aunque el 95% de este mercado consume derivados de astaxantina sintética, la demanda de los consumidores por los productos naturales hacen que los pigmentos sintéticos sean mucho menos deseable y proporciona una oportunidad para la producción de astaxantina por H. pluvialis. Alicia Soledad Martínez Silva 32

45 ANTECEDENTES Medios de cultivo La microalga H. pluvialis tiene una tasa de crecimiento baja lo que constituye uno de los principales problemas para su producción a gran escala. Los medios de cultivo usados de manera habitual para su cultivo han sido adaptados de los empleados para otras microalgas, para bacterias o incluso una mezcla de ambos y no han sido diseñados para soportar altos crecimientos. Este problema ha provocado que se haya realizado un esfuerzo importante en el desarrollo de un medio de cultivo adecuado a los requerimientos propios de esta microalga (Gong y Chen, 1997; Pringshe, 1966; Sarada et al., 2002). La mayoría de estos trabajos se realizaron en condiciones de cultivo discontinuo o batch y se han optimizado sólo algunos componentes del medio. En este trabajo se presenta un estudio comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los pigmentos obtenidos de la microalga Haematococcus pluvialis ya que en los últimos años, este organismo ha sido considerado como una posible fuente natural para la producción de astaxantina. Alicia Soledad Martínez Silva 33

46 JUSTIFICACIÓN CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN En la centuria de 1900 el reino vegetal y animal proveía todos los materiales colorantes para la industria textil, cosmética, pinturas y alimentos. Este patrón comenzó a cambiar muy rápidamente seguido por el descubrimiento de los colorantes sintéticos. El impacto inicial fue sentido en la industria textil para los colorantes naturales los cuales perdieron su mercado. Progresivamente una amplia variedad de colorantes sintéticos fueron manufacturados y éstos desplazaron a muchos de los colorantes para alimentos y cosméticos que se venían utilizando ya que éstos fueron comparativamente más baratos, mayor consistencia en la calidad, mejor facilidad de obtención, mejores atributos de calidad y estabilidad superior en sistemas alimentarios. Hoy en día el sector alimentario, está experimentando un regreso al mercado de colorantes naturales, éste cambio no ha sido manejado directamente por la industria alimentaria sino por los consumidores de países desarrollados, los cuales están informados y preocupados sobre posibles riesgos a su salud asociados con aditivos alimentarios sintéticos. El interés por los alimentos funcionales es cada vez mayor, dado que éstos, además de satisfacer las necesidades energéticas y nutricionales básicas, son capaces de aportar beneficios adicionales a nuestra salud. Además, existe una tendencia entre los consumidores dirigida hacia la ingesta de productos procedentes de fuentes naturales en contraposición a los obtenidos de forma sintética. Actualmente, el número de ventajas de los pigmentos naturales sobre los sintéticos han aumentado debido a las propiedades farmacológicas que se han descubierto de los pigmentos naturales. Además, algunos productos han tenido un gran valor en el mercado porque en la fabricación de éstos se ocupan solo pigmentos naturales. Sin embargo, es necesario señalar que los colorantes sintéticos han tenido ventajas bien conocidas como el alto poder pigmentante, la estabilidad, el almacenamiento, la facilidad del procesamiento y además son más baratos y están disponibles en cantidades ilimitadas (Wissgot y Bortlik, 1996). Alicia Soledad Martínez Silva 34

47 JUSTIFICACIÓN De acuerdo a datos registrados por el Banco Nacional de Comercio Exterior (BANCOMEXT, 2006), el volumen de las importaciones a México de materiales colorantes de origen animal y vegetal aumentaron de 2000 a 2006 en un 61.96%, de ton a ton. Por otro lado las exportaciones bajaron en un 32% (4,481,786 ton en 2000 a 2008, 2, ton en 2008). El aumento en las importaciones y la baja en las exportaciones de materiales colorantes naturales, demuestra la necesidad de buscar nuevas fuentes alternativas de colorantes de origen natural, así como mejorar y optimizar los procesos existentes que reduzcan los costos actuales y ser más competitivos en el mercado internacional. Las microalgas se consideran como alimentos funcionales, capaces no sólo de elevar el contenido nutricional de los alimentos tradicionales, sino también de afectar positivamente la salud de animales y humanos. Poseen cantidades apreciables de carbohidratos, lípidos, vitaminas, minerales, ácidos grasos poliinsaturados (omega 3 y omega 6) y antioxidantes (carotenos). Algunas tienen, incluso, un contenido de aminoácidos superior al presentado por alimentos convencionales (Méndez, 2003; Abalde et al., 1996; Visentainer, et al., 2005). En este trabajo se presenta un estudio comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los pigmentos obtenidos de la microalga Haematococcus pluvialis considerando la hipótesis de que la fuente de nutrientes puede originar cambios en el crecimiento, contenido de pigmentos y actividad antimicrobiana.. Alicia Soledad Martínez Silva 35

48 OBJETIVOS CAPÍTULO 3 OBJETIVOS Objetivo general: Evaluar los pigmentos obtenidos de la microalaga Haematococcus pluvialis (Chlorophyta:Volvocales) cultivada en diferentes medios. Objetivos específicos: 1) Validar las técnicas operativas de crecimiento de Haematococcus pluvialis e inducción de pigmentos utilizando varios medios de cultivo. 2) Determinar la composición de cenizas, lípidos, carbohidratos, humedad y nitrógeno proteico de la microalga seca de Haematococcus pluvialis mediante un análisis químico proximal. 3) Obtener extractos orgánicos totales utilizando disolventes de diferente polaridad y variando el protocolo de extracción. 4) Evaluar el almacenamiento y la estabilidad de la biomasa seca y de los extractos orgánicos totales. 5) Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos orgánicos totales de H. pluvialis sobre bacterias gram positivas, gram negativas y un hongo levaduriforme. 6) Aislar y caracterizar los pigmentos obtenidos mediante cromatografía y espectroscopía UV-Vis Alicia Soledad Martínez Silva 36

49 MATERIALES Y MÉTODOS CAPÍTULO 4 MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Organismo La cepa Haematococcus pluviales con clave Hamp-1r se obtuvo del cepario del Laboratorio de Biotecnología de Microalgas de la Universidad del Mar, campus Puerto Ángel. Esta cepa es conservada en el medio de cultivo f/2 (Guillard y Ryther, 1962) a 28 o C como se observa en la figura 9. (b) (a) Figura 9. Conservación de H. pluvialis con clave Hamp-1r. (a) en agar y (b) en medio líquido Pruebas preliminares La microalga fue cultivada en 5 medios de cultivo diferentes y en 3 condiciones diferentes (figura 10). 1) 2) Figura 10. Pruebas preliminares de cultivo de H. pluvialis. 3) Alicia Soledad Martínez Silva 37

50 MATERIALES Y MÉTODOS Los medios de cultivos utilizados fueron BBM, BG-11, f/2, f/2 sin fosfatos y un fertilizante foliar (QF). Las condiciones de cultivo, fueron las siguientes las que se describen en la tabla 7. Tabla 7. Parámetros para las diferentes condiciones preliminarios de los cultivos de la microalga. T ( o C) Luz (ft cd) ph Agitación Condición Manual Condición Manual Condición Mecánica Todos estos experimentos se hicieron por quintuplicado, utilizando tubos, matraces erlenmeyer de 250 y 500 ml. Se ocuparon 2 inóculos de Haematococcus pluviales uno en su forma vegetativa con flagelos y otro en su forma de quiste. Cada dos días se tomaban muestras de la microalga para verlas al microscopio y observar los cambios morfológicos Condiciones de cultivo Se utilizaron cepas de H. pluviales en su forma de quiste. En la Tabla 9 se describe la composición química de los medios de cultivo empleados. La irradiancia fluctúo entre lux a lux. La agitación fue manual. Se utilizaron matraces erlenmeyer de 500 ml. Se le adicionó 350 ml de medio de cultivo y 17.5 ml de inóculo. Todos los experimentos se realizaron por quintuplicado. En la tabla 8 se detallan las condiciones iniciales de cultivo. Tabla 8. Condiciones iniciales de los medios de cultivo para H. pluvialis. Variables fisioquímicas f/2* Fertilizante foliar ph Conductividad eléctrica (mv) Concentración de inóculo (cel/ml) *(Guillard y Ryther, 1962) Alicia Soledad Martínez Silva 38

51 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 9. Composición química de los medios de cultivo f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y del Fertilizante foliar (QF). Constituyentes BBM [g/l] BG-11 [g/l] f/2* [g/l] f/2 [g/l] Fertilizante** [g/l] NaNO Nitrógeno nítrico x10-3 Nitrógeno amoniacal x10-3 Nitrógeno orgánico x10-2 Fósforo Asimilable x10-2 NaH 2 PO 4 4H 2 O KH 2 PO (K 2 O) 2.1x10-2 MgSO 4 7H 2 O (MgO) 6x10-5 EDTA x x FeCl 3 6H 2 O x x10-5 (Fe) 3x10-5 NaMoO x x10-6 (Mo) 1.2x10-6 ZnSO 4 7H 2 O x x10-5 (Zn) 9x10-6 MnCl 2 4H 2 O x x10-4 (Mn) 3x10-6 CuSO 4 5H 2 O x x10-6 (Cu) 6x10-6 H 3 BO (B) 4.5x10-6 CoCl x10-5 1x10-5 (Co) 6x10-6 Vitaminas*** x10-5 1x *Sin Nitrógeno. **Foliar. ***Solución comercial Recuento celular Después de inocular los matraces, se lleva el registro de crecimiento para identificar la etapa de mayor densidad de las microalgas (fase exponencial) la cual indica el momento apropiado para cosecharlas. Esta etapa también indica que el cultivo debe transferirse a un volumen mayor de medio de cultivo o diluirse si el recipiente tiene volumen disponible. Para determinar la densidad celular cada muestra fue fijada con lugol al 5%. Los conteos se hicieron empleando una cámara Neubauer estándar de 0.1 mm de altura y 1 mm 2 de área. Se hicieron las lecturas en un microscopio óptico Olympus Alicia Soledad Martínez Silva 39

52 MATERIALES Y MÉTODOS BX51. También se hizo una descripción de la microalga Haematococcus pluvialis mediante la aobservación de sus célula a través de varios microscopios como el Microscopio Carl Zeis modelo Estándar 25 (esteroescópico), Leica Zoom 2000 (contraste de fases) y Olympus BX51. Las imágenes de las células fueron capturadas por un dispositivo acoplado a una cámara fotográfica Densidad celular Con la cámara Neubauer estándar (Hematocímetro) de 0.1 mm de altura y 1 mm 2 de área, la densidad de microalgas se calcularon de acuerdo a la siguiente relación: 2 = F + F. D. + M C Cel/mL Donde: D= densidad del cultivo. F= fijador (ml). F. D.= Factor de dilución (ml). î.2 = Vf vi Vf= volumen final de la muestra diluida (ml). vi= volumen inicial de la muestra r (ml). M= Mililitros de muestra utilizados. C= número de células promedio contadas. 10= factor de multiplicación debido a la profundidad del hematocímetro. 1000= factor de conversión a mililitros Parámetros Poblacionales Los principales parámetros poblacionales del crecimiento de un cultivo de células se calcularon con las siguientes ecuaciones: 1.- Las divisiones por día (k) se calcularon de acuerdo a Guillard (1973): Donde: = N2 log T2 T1 N = Factor de conversión del logaritmo base 2 a base 10. Alicia Soledad Martínez Silva 40

53 MATERIALES Y MÉTODOS N1= Concentración celular al tiempo T1. N2.= Concentración celular al tiempo T La tasa de crecimiento específico (m) estimada como lo recomienda E. P. A. (1971) para ensayos con microalgas: N2 log = N1 T2 T1 día 3.- El tiempo de generación (Tg) se determina como lo recomienda Eppley y Strickland (1968): log2 T2 T1 log2 r. = = logn2 logn1 k 4.- La producción diaria de microalgas se valora según De la Cruz y Alfonso, 1975: N2 N1.2. = T2 T Cosecha y secado de la biomasa Las células microalgales fueron separadas del medio de cultivo por centrifugación (3500 rpm durante 5 min a 5 o C) y se secaron en una estufa de vacio LABLINE a 80 C por 24 horas Análisis Químico proximal Porciones de microalgas secas fueron molidas en un mortero para la determinación del análisis químico proximal, el cual se realizó por los métodos oficiales AOAC (1997), en donde se evaluó el contenido de Humedad (925.10), ceniza (923.03), lípidos totales y Nitrógeno proteico total (979.09). El contenido de carbohidratos se estimó por el método de fenol-sulfúrico (Dubois et al., 1956). En todos los casos, las determinaciones se realizaron por quintuplicado. Alicia Soledad Martínez Silva 41

54 MATERIALES Y MÉTODOS 4.7. Extracción Para evitar foto-descomposición de los pigmentos, este proceso se llevó a cabo en ambiente oscuro iluminado con luz roja (700 nm). Todas las extracciones se repitieron hasta que el color de la biomasa se agotase por los disolventes de extracción. Todos los experimentos fueron realizados por quintuplicado. Los extractos obtenidos se almacenaron en frascos ámbar a 4 C hasta su posterior análisis Biomasa húmeda Se tomaron 5 ml de cultivo y se agregó a un tubo de centrífuga de 15 ml de capacidad. Luego se centrifugó a 3500 rpm a 5 o C durante 5 min utilizando una centrifuga (Universal 32R Hettich Zentrifugen ). Los pigmentos se extrajeron del botón celular mediante la adición de 10 ml de acetona 100%. Se agitó vigorosamente en un vortex durante 30 seg. Se procedió a congelar la disolución a -20 o C durante 2 horas. Los extractos, por quintuplicado, se clarificaron mediante centrifugación y se procedió a medir la absorbancia de las muestras en un Espectrofotómetro de UV-Vis (Marca VARIAN. Modelo cary 50, USA) Biomasa seca Después del secado de la microalga, se realizo una ruptura celular mediante congelamiento de la biomasa a -40 o C durante 20 minutos, seguido de una molienda con un mortero. Se probaron tres diferentes métodos de extracción Método HCl 4N-Acetona La extracción y determinación del contenido total de pigmentos en las muestras en estudio se realizó por el método descrito por Sarada et al., (2006), quienes propusieron un método mejorado para la extracción de astaxantina de H. pluvialis. Este método se basa en la adición de unas gotas de HCl 4N a 70 o C para facilitar la extracción, y se logra hasta un 90% de la extracción del pigmento sin homogeneizar. Se pesaron, 100 mg de microalga y se añadieron 10 gotas de HCl 4N (PerkinElmer) y 3 perlas de ebullición (sigma, Alicia Soledad Martínez Silva 42

55 MATERIALES Y MÉTODOS micras) a un tubo falcón cónico de plástico. Se mezcló vigorosamente en un agitador vortex durante 30 seg. A continuación se incubó en un baño maría a 70 o C durante 2 minutos y se homogeneizó nuevamente en el vortex. Después se le adicionó al material celular 5 ml de acetona (Merck) al 100%. La suspensión fue homogeneizada en un agitador vortex y se sometió a centrifugación (3500 rpm por 5 minutos). El sobrenadante se colectó en un matraz balón para después concentrarlo en un rotavapor. Este procedimiento se repitió hasta la extracción exhaustiva de los pigmentos, lo cual fue confirmada mediante una exploración espectrofotométrica UV-Vis Método Acetona 100% Se pesaron 100 mg de microalga, se añadieron 5 ml de acetona 100% conjuntamente con 3 perlas de ebullición de vidrio (sigma, micras) a un tubo de centrifuga cónico de 50 ml. La suspensión fue homogeneizada en un agitador vortex y se sometieron a una centrifugación de 3500 rpm por 5 min. Los sobrenadantes fueron colectados, en un matraz balón para su posterior concentración en un rotavapor. Este procedimiento descrito se repitió con el fin de extraer exhaustivamente los pigmentos de la biomasa seca. La confirmación de la ausencia de estos compuestos en las muestras fue realizado mediante una la exploración espectrofotométrica UV-Vis, se consideró finalizado el procedimiento cuando los valores en la absorbancia fueran inferiores a 0.05 unidades Método DMSO A 100 mg de muestra se le añadieron 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck) y 3 perlas de ebullición de vidrio en un tubo falcón de plástico con capacidad de 50 ml. Se incubo este material en un baño maría a una temperatura de 50 o C por 30 min., seguido de una rigurosa agitación en el vortex durante 15 segundos cada 10 min. Posteriormente, el material fue centrifugado (3500 rpm por 5 min.), se recupero el sobrenadante y se repitió el proceso de extracción hasta agotamiento Determinación de pigmentos Alicia Soledad Martínez Silva 43

56 MATERIALES Y MÉTODOS Para la cuantificación del contenido total de pigmentos se utilizaron los siguientes métodos: 1. Fórmulas. Las concentraciones de clorofila a, b, carotenoides totales y astaxantina se determinaron mediante las fórmulas propuestas por Lichtentaler and Wellburn, (1985). 2. 6Ȭ>50 eߒ lėa eu = A 6Ȭ>6Ȭ>Þ A eߒ lėa eu = A 6Ȭ> A 6Ȭ>6Ȭ>Þ r ue 1 'ulė 1 a 1 = 1000 A C 81.4C Patrones de referencia. El contenido de carotenoides totales se estableció a partir de la concentración de los extractos la cual se obtuvo de la curva de calibración (absorbancia, Y, en función de la concentración X expresada en mg/l), elaborada con soluciones preparadas con b-caroteno (Y=, Astaxantina, Clorofila a y Xantofila. A todas las soluciones estándares se les determinó el espectro de absorción visible. Las determinaciones se realizaron por quintuplicado y los contenidos de pigmentos se expresaron como valores promedios para cada medio de cultivo Evaluación del almacenamiento y estabilidad de la biomasa seca y extractos totales La biomasa seca de H. pluvialis se mantuvo durante 1.5 años bajo las siguientes condiciones: A temperatura ambiente bajo a la exposición a la luz; a temperatura ambiente en la oscuridad; congelado a -20 o C en la oscuridad; con antioxidante (0,01% de ácido ascórbico) a temperatura ambiente en la oscuridad; en una estufa de vacio (P 0.04 atm). Los extractos acetónicos de los pigmentos carotenoides, fueron mantenidos en las mismas condiciones de almacenamiento antes mencionadas durante 6 meses. Alicia Soledad Martínez Silva 44

57 MATERIALES Y MÉTODOS También se hizo un estudio parcial de la estabilidad ante la luz, ensayándose la estabilidad en exposición a la luz solar, a la luz UV-vis y la oscuridad Separación e identificación de los pigmentos Para todos los análisis cromatográficos se utilizo el pigmento seco, extraído de la microalga Haematococcus pluvialis Cromatografía en capa fina La cromatrografía en placa fina se realizó en la oscuridad sobre una placa de gel de sílice de aluminio (Sigma-Aldrich Z ) probando diferentes disolventes de diversa polaridad como eluyentes. La mezcla que logró mejores separaciones fue hexano:acetona (7:3). El revelado de las placas se realizó utilizando una lámpara UV (Upland, USA) y vapores de yodo o ácido sulfúrico al 10%. La identificación de los carotenoides purificados se llevó a cabo utilizando los patrones de referencia ya antes mencionados y por un análisis espectrofotómetrico UV-vis Cromatografía en columna Se emplearon columnas de vidrio de 2 cm de diámetro y 25 cm de altura, empacadas con gel de sílice 60 (malla 60 y mm. Cromatografía en columna Merck ), y con 120 ml de hexano. El extracto se colocó en un vaso de precipitado y se disolvió en hexano. El pigmento se agregó a la columna formando una capa delgada uniforme, eluyendo inicialmente hexano 100%. Se obtuvieron fracciones de 6-10 ml en frascos trasparentes forrados con papel aluminio de 30 ml, que fueron concentrados en el rotavapor a sequedad, para su posterior estudio. Las fracciones obtenidas de la separación de los pigmentos por cromatografía en columna se analizaron por HPLC Cromatografía liquida de alta resolución El contenido de carotenoides y astaxantina de los extractos obtenidos fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución Un dispositivo Alicia Soledad Martínez Silva 45

58 MATERIALES Y MÉTODOS HPLC (bomba LC de Perkin Elmer, serie 200, Nor walk CT 06859, USA) utilizando una columna C18 de fase inversa (Supelco, 25 cm de 4,6 mm). Los disolventes empleados fueron (A) acetona y (B) una mezcla de metanol:agua (9:1 v/v). La velocidad de flujo fue de 1.25 ml/min. La separación de los carotenoides se logró mediante un gradiente entre los disolventes A y B durante 40 minutos de la siguiente manera: El disolvente B, se eluyo de 80 a un 20% durante 25 min, 20% para 10 minutos, y de 20 a 80% durante 5 min. La separación de los carotenoides y los ésteres de astaxantina fueron identificados mediante un detector de matriz de fotodiodos (Brinda et al., 2004). Los picos fueron integrados a 477 nm para cuantificación de la astaxantina libre y los ésteres de astaxantina. Fueron utilizados estándares de b caroteno, y la astaxantina (Sigma) para la identificación y cuantificación de los pigmentos Bioensayo antimicrobiano Prueba de Susceptibilidad La técnica de difusión en agar también conocida como de difusión en disco, antíbiograma o "Kirby-Bauer" es la más utilizada en los laboratorios de microbiología clínica (Fig. 11). Esta técnica es, en esencia, el resultado de la interacción de tres elementos: el antibiótico depositado en un reservorio, generalmente un disco de papel filtro (sensidiscos); un microorganismo que será inhibido o no por el antibiótico, y un medio sólido (agar) que servirá como apoyo al crecimiento del microorganismo y de difusión del antibiótico. El comportamiento de estos tres elementos a su vez estuvo determinado por las condiciones de incubación: temperatura, concentración de bióxido de carbono y tiempo de incubación. Se depositó el disco con el antibiótico sobre el agar ya uniformemente inoculado; se estableció una competencia entre el antibiótico que se difundió a través del medio y el microorganismo: que comienza a crecer. Si éste es susceptible, habría un halo de inhibición que se extenderá hasta un límite dado por la concentración alcanzada por el antibiótico en ese punto (concentración crítica). Por lo que el diámetro de la zona de inhibición indicó el grado de susceptibilidad del organismo al antibiótico, cuando éste quedó como única Alicia Soledad Martínez Silva 46

59 MATERIALES Y MÉTODOS variable del sistema. A mayor zona de inhibición mayor será la susceptibilidad del organismo. Todos los ensayos se hicieron por quintuplicado. Figura 11. Determinación de la actividad antimicrobiana por el método de difusión en placa (Kirby-Bauer). El perfil de acción se mide por la formación de halos de inhibición Categorías de susceptibilidad El International Collaborative Study Group on Antimicrobial Susceptibillity Testing de la Organización Mundial de la Salud (Ericsson, 1971) recomienda cuatro categorías de susceptibilidad: Categoría 1.- Incluye a las bacterias con un grado de susceptibilidad tal, que la respuesta in vivo es probable en infecciones sistémicas, moderadas a severas, cuando se tratan con la dosis habitual de un antimicrobiano. Estos organismos se consideran como susceptibles. Categoría 2.- Incluye la susceptibilidad in vitro que hace probable la respuesta in vivo en infecciones sistémicas, cuando el antibiótico se usa en dosis mayores o cercanas a la toxicidad. Categoría 3.- Comprende ciertos grados de susceptibilidad en los que la Respuesta in vivo es probable cuando se tratan infecciones localizadas en sitios donde el antibiótico puede ser concentrado por procesos fisiológicos o por aplicación local. Un ejemplo sería el tratamiento correcto de infecciones urinarias por Proteus con penicilina G, que resultaría inadecuado para tratar al mismo organismo alojado en una válvula cardiaca. Alicia Soledad Martínez Silva 47

60 MATERIALES Y MÉTODOS Categoría 4.- Incluye organismos cuya susceptibilidad hace la respuesta in vivo improbable. Son organismos considerados como resistentes. Las categorías 2 y 3 corresponden a la susceptibilidad intermedia, como se informa tradicionalmente, que además de las implicaciones clínicas antes señaladas sirve para evitar discrepancias significativas que resulten de errores técnicos no controlables Medios de cultivo Los medios de cultivo que se emplearon fueron agar y caldo Dextrosa Sabouraud (DIBICO) para Candida albicans agar y caldo Müeller Hinton (MERCK) para las bacterias Microorganismos de referencia Los microorganismos fueron elegidos entre especies representativas de distintas bacterias Gram (+) y Gram (-), y un hongo levaduriforme. En la Tabla 10 se describe el tipo de microorganismo y el número de código de los microorganismos de prueba. Éstos se adquirieron del Cepario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Tabla 10. Microorganismos utilizados en el ensayo antimicrobiano. Microorganismo Tipo de microorganismo No. de código Bacillus subtilis Bacilo Gram + ATCC 6633 Candida albicans Levadura ATCC Enterococcus faecalis Bacteria Gram + ATCC Escherichia coli Bacilo Gram + ATCC Pseudomona aeruginosa Bacilo Gram - ATCC Staphylococcus aureus Coco Gram + ATCC 6538 Antes de realizar la determinación del efecto antimicrobiano de los diferentes extractos de la esponja, se verificó la viabilidad de cada uno de los microorganismos seleccionados para este trabajo. Todas las determinaciones del bioensayo antimicrobiano se hicieron por quintuplicado. Alicia Soledad Martínez Silva 48

61 MATERIALES Y MÉTODOS Reactivación, mantenimiento y conservación de las cepas Todos los microorganismos fueron activados en caldo Muller Hinton a 36 o C por 24 horas, luego se resembro en agar Mueller Hinton y se incubó en las condiciones anteriores, para obtener colonias aisladas. Con las colonias asiladas se hacieron resiembras masivas sobre cuñas de agar Mueller Hinton con 1% p/v de glicerol y sin glicerol. Los tubos en cuña, luego de ser incubados, se conservaron en refrigeración para tener cultivos de trabajo. De las cajas de agar se cosecharon los microorganismos con solución crioprotectora para conservar las cepas a -20 o C. También se determinó periódicamente la pureza de las cepas microbianas identificándolas por medio de morfología colonial, aislándolas por estría cruzada en el agar apropiado para cada microorganismo, por morfología microscópica y pruebas bioquímicas específicas Viabilidad de las cepas Con el fin de de verificar la viabilidad de cada uno de los microorganismos, conocer la concentración celular y la fase de desarrollo de los microorganismos, se realizó una curva de crecimiento empleando caldo Dextrosa Sabouraud la levadura y caldo Müeller Hinton para las bacterias. En la figura 12 se muestra el protocolo que se siguió para las cinéticas de crecimiento. MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR Figura 12. Diagrama de flujo de la curva de crecimiento microbiano de los microrganismos de referencia Preparación de los inóculos Alicia Soledad Martínez Silva 49

62 MATERIALES Y MÉTODOS Bacterias Para la preparación de los inocúlos bacterianos se utilizaron las bacterias S. aureus, E. faecalis, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa (Tabla 10). Cada bacteria fue transferida al medio de mantenimiento Mueller Hinton e incubada a 37 0 C durante 24 horas, para la activación respectiva del cultivo. Para preparar el inóculo fueron seleccionadas de 4 a 5 colonias de bacterias activas en agar Mueller Hinton y transferidas a un tubo de ensaye roscado con 5 ml de solución estéril de Caldo Mueller Hinton, seguido por una homogenización en in vortex durante 15 segundos. La densidad del inóculo fue ajustada por espectrofotometría a 520 nm, al patrón de turbidez número 0.5 de McFarland (NCCLS, 1993). El inóculo final se obtuvo de la suspensión diluida de los cultivos bacterianos respectivos, obteniéndose una concentración aproximadamente de 1.5 x 10 6 células/ml (NCCLS, 1993). La suspensión ajustada del inóculo no debe permanecer más de 15 a 20 minutos antes de proceder a sembrarla en la caja petri Hongo levaduriforme La levadura utilizada para la preparación del inóculo fue Candida albicans. Se cultivo, por lo menos dos veces, en agar Dextrosa Saboraud, para asegurarse de la pureza y viabilidad de los cultivos jóvenes de 24 y 48 horas a 37 0 C. El procedimiento para la obtención del inóculo fue el que se describió para las bacterias Selección del Antibiótico (Control Positivo) Para la selección del control de sensibilidad o control positivo, con el fin de obtener un marco de referencia acerca de la resistencia o sensibilidad de los microorganismos objeto de estudio, se realizaron antibiogramas utilizando algunos antibióticos que se encuentran en el mercado como Ampicilina, Ketoconazol, Tienam/Imipenem, Cloranfenicol, Estreptomicina, Metronidazol y Eritromicina. Se ensayaron concentraciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 mg/ml Control negativo El control negativo consistió en discos impregnados con disolvente y Alicia Soledad Martínez Silva 50

63 MATERIALES Y MÉTODOS secados en iguales condiciones que las muestras; el ensayo es válido si hay ausencia de halo inhibitorio Preparación de las concentraciones de extracto Se aplicaron diferentes concentraciones (2, 3, 4, 5, 6 y 7 mg/ml) del concentrado de cada uno de los extractos crudos microalgales obtenidos anteriormente y disueltos con los diferentes disolventes. Mediante una micropipeta con puntas estériles, se adicionaron a cada sensidisco estéril aproximadamente 5 ml de las diluciones de los extractos y se dejaron secar. Esta operación se repitió las veces necesarias hasta obtener las concentraciones antes mencionadas Determinación de la actividad antimicrobiana Se utilizaron cajas petri de vidrio, en las que se vertieron 15 ml de agar Muller Hinton. Se dejaron solidificar y enfriar a temperatura ambiente. Con un hisopo estéril se sembró en cada caja petri los organismos de referencia. Inmediatamente se depositaron los sensidiscos con el apoyo de una pinza estéril, presionándolos ligeramente para asegurar un contacto completo con la superficie del agar. Se colocaron 6 sensidiscos en cada caja, los cuales contenían diferentes concentraciones de extracto, además de los controles negativos y positivos. Para prevenir una sobreposición de las zonas de inhibición, la distribución de los sensidiscos se procuró tener un límite no menor de 20 mm entre cada uno, y de 15 mm en relación con el borde de la placa. Las cajas se incubaron de forma invertida a 37 o C durante 24 h, los diámetros de las zonas de inhibición se midieron por la parte posterior de la placa con una regla graduada en milímetros, utilizando una fuente de luz brillante, cada hora hasta completar las 24 horas. El ensayo se considera positivo (+) cuando hay presencia de halo inhibitorio y negativo (-) cuando hay ausencia de halo inhibitorio Concentración Mínima Bactericida (MBC) Para determinar la concentración mínima bactericida, se seleccionaron los cultivos que presentaron halo de inhibición antimicrobiana. Se tomó una Alicia Soledad Martínez Silva 51

64 MATERIALES Y MÉTODOS asada de estos cultivos y se sembraron en cajas petri con medio de cultivo de agar Mueller Hinton y se incubaron a 37 o C durante 24 horas. Después de la incubación de los cultivos que han sido objeto de inspección se verificó visualmente el crecimiento microbiano. Para la interpretación de los resultados que se consideraron en la inhibición es la siguiente si se percibió el crecimiento microbiano los cultivos en las cajas petri el extracto se considera que es de acción bacteriostática y si no existe crecimiento en los cultivos la acción se considera bactericida (Baron y Finegold, 1990). Alicia Soledad Martínez Silva 52

65 RESULTADOS Y DISCUSIÓN CAPÍTULO 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Características morfológicas de Haematococcus pluvialis Los cambios morfológicos durante la etapa de formación de glóbulos rojos incluyen un engrosamiento de la pared celular y un aumento significativo en el volumen celular, a veces formando gigantes aplanoesporas rojas. Sin embargo, la mayoría de los quistes son más pequeños de color rojo. Figura 13. Fotomicrografía H. pluvialis (40X) en forma de quiste tomada con un microscopio óptico. En la Figura 13 se observa el espesor de la pared celular de la aplanoespora de H. pluvialis. Esta pared se caracteriza por una extraordinaria resistencia contra la agresión mecánica y química. Lorenz y Cysewski (2000) recomiendan conocer los aspectos del ciclo de vida de H. pluvialis pues cada vez se hace más importante este aspecto, debido al creciente interés en este microorganismo como una fuente biotecnología de astaxantina. Al igual como lo mencionan los autores Bubrick, (1991) y Olaizola, (2000) el engrosamiento de la pared celular de la aplonoespora disminuye la biodisponibilidad de los carotenoides acumulados ya que el rompimiento de las células para accesar a los pigmentos se hace más difícil y caro debido a las multiples técnicas de extracción Condiciones de cultivo y parámetros poblacionales de H. pluvialis en los medios f/2 y QF. Alicia Soledad Martínez Silva 53

66 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las investigaciones sobre el cultivo de microalgas revisten gran importancia dada su amplia aplicación biotecnológica y comercial. En tal sentido, se han utilizado los cultivos discontinuos por su fácil manejo para determinar la cinética de crecimiento y los parámetros que influyen en el desarrollo poblacional de las microalgas (Abalde et al., 1995). Sin embargo, el uso de los medios de cultivo sintéticos ha incrementado sustancialmente el valor económico para la producción de la biomasa de estos microorganismos (González et al., 1999). Recientemente se ha ensayado el uso de sustratos alternativos y no convencionales como medios de cultivo, destacando: fertilizantes agrícolas, residuos pesqueros y exudados gomosos, entre otros, para el crecimiento y desarrollo de algunas microalgas. Se destaca que a partir de estos medios innovadores se han obtenido resultados comparables y superiores a los correspondientes a los medios sintéticos. El objetivo general de este trabajo fue evaluar los cultivos por lotes de Haematococcus pluvialis en los medios f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un fertilizante foliar (QF). Para que las microalgas crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial como el f/2 debe reunir una serie de condiciones. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesario y debe estar exento de todo microorganismo contaminante Comportamiento del ph, de la conductividad eléctrica y de la temperatura con relación al crecimiento de H. pluvialis. Son numerosos los trabajos que se han realizado sobre los factores físico-químicos que condicionan el crecimiento del fitoplancton en cultivo entre los que se destacan la luz, temperatura, salinidad, ph y CO 2 (Coutteau 1996, Sánchez et al., 2000, Leonardos y Lucas 2000, Tzovenis et al., 2003). Como se mencionó el ph es un parámetro fundamental para el crecimiento de la microalga. Las microalgas de agua dulce, comúnmente crecen favorablemente en intervalos de ambientes neutros a básicos (Ginzburg y Ginzburg, 1981). Este parámetro afecta muchos procesos directamente relacionados con el crecimiento microalgal y el metabolismo, incluyendo la Alicia Soledad Martínez Silva 54

67 RESULTADOS Y DISCUSIÓN disponibilidad y asimilación de iones (Borowitzka y Borowitzka, 1988). El intervalo de ph requerido por el fitoplancton es de 7.7 a 8.2 aproximadamente (14) QF F/2 ph Tiempo (días) Figura 14. Variación del ph de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días. En la figura 14 se observa que el ph siguió la misma tendencia en los dos medios de cultivo. En el medio f/2 se observa un aumento de Alicia Soledad Martínez Silva 55

68 RESULTADOS Y DISCUSIÓN QF F/2 Conductividad Eléctrica (mv) Tiempo (días) Figura 15. Conductividad eléctrica de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días. La temperatura óptima para el crecimiento de H. pluvialis es relativamente bajo. Borowitzka et al. (1991) ha reportado que una variedad de esta microalga (H. pluvialis MUR) crecía mejor a 15 o C de temperatura. A 25 o C fue inhibido el crecimiento y a 35 o C de temperatura el cultivo decayo en su totalidad. El mismo modo Harker el al., (1995) demostró que la temperatura optima de crecimiento estaba entre los 14 y 15 o C Densidad Celular. La curva de crecimiento de las microalgas, de forma general, posee cinco fases en el tiempo. La duración de cada fase puede acortarse, alargarse o apenas reconocerde, dependiendo de diversos factores como temperatura, fuente deluz, composición química del medio de cultivo, tamaño del inóculo y características propias de las microalgas. Al inocular un nuevo medio, a menudo no se registra un crecimiento inmediato en el número de células. Esta fase de inducción o de retraso del Alicia Soledad Martínez Silva 56

69 RESULTADOS Y DISCUSIÓN crecimiento se puede dilatar entre 1 a 3 días, dependiendo del tamaño y del estado del inoculo. En general, este periodo se puede evitar utilizando como inóculos cultivos que todavía están en su fase de crecimiento exponencial. Al adaptarse las células al medio, la densidad de las microalgas aumenta en forma geométrica (exponencial). La fase exponencial puede presentarse del segundo al tercer día después de inoculado el medio y prolongarse hasta 4 días. En la fase de declinamiento relativo del crecimiento, puede durar de 1 a 2 días, empieza a manifestarse un decremento de la velocidad de las células, debido a condiciones desfavorables en el cultivo generadas en la fase exponencial. Al final de esta fase la densidad del cultivo alcanza su valor máximo. f/2 QF 2.50E E+06 No. de cel/ml 1.50E E E E Tiempo (días) Figura 14. Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar). Como se observa en la figura 14, el crecimiento de la microalga presentó una tendencia similar en los dos medios evaluados, con una fase de latencia que culminó el día 12 para el medio f/2 y para el QF el día 6, seguida de una fase exponencial que duró 18 días para el medio QF y para el medio f/2 10. La microalga presentó una fase estacionaria después de los días 24 y 26 en los Alicia Soledad Martínez Silva 57

70 RESULTADOS Y DISCUSIÓN medios f/2 y QF respectivamente. En el día 24 la microalga alcanza su densidad celular máxima ( cel/ml) en el medio QF y en el f/2 el día 22 con cel/ml Divisiones por día (k) en los diferentes medios de cultivo f/2 QF k (divisiones por día) Tiempo (días) Figura 16. Divisiones por día de H. pluvialis en los medios f/2 y QF (fertilizante foliar) en 30 días de cultivo. y QF Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de cultivo f/2 Alicia Soledad Martínez Silva 58

71 RESULTADOS Y DISCUSIÓN m (día -1 ) f/2 QF Tiempo (días) Figura 17. Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días. cultivo Tiempo de generacion (Tg) en los diferentes medios de f/2 QF Tiempo de generación (Tg) Tiempo (días) Figura 18. Tiempo de generación de H. pluvialis en 30 días de cultivo en los Alicia Soledad Martínez Silva 59

72 RESULTADOS Y DISCUSIÓN medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) Producción diaria de los medios de cultivo f/2 y QF. f/2 QF 9.E+04 Producción diaria (cel/ml) 8.E+04 7.E+04 6.E+04 5.E+04 4.E+04 3.E+04 2.E+04 1.E+04 0.E Tiempo (días) Figura 19. Producción diaria de la microalga H. pluvialis en los diferentes medios de cultivo Análisis químico proximal. Otra de las herramientas para determinar la cantidad y calidad de la biomasa celular en cultivos es la determinación de su composición bioquímica (proteínas, carbohidratos, cenizas, humedad y lípidos). Esta información es sumamente útil para analizar sobre todo aquellas especies de uso potencial en acuicultura; además puede ser utilizada como una medición indirecta para mostrar la fase de crecimiento en que se encuentra el cultivo. Tabla 13. Composición química proximal de H. pluvialis en base de los medios f/2 y QF. Análisis f/2*(%) Fertilizante foliar (%) Proteínas 37.6 ± ± 0.7 Alicia Soledad Martínez Silva 60

73 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Carbohidratos 18.5 ± ± 0.2 Lípidos 29.7 ± ± 0.7 Humedad 3.3 ± ± 0.3 Cenizas 10.9 ± ± 0.6 *(Guillard y Ryther, 1962) Las microalgas, en general, contienen del 25 hasta el 65% de su peso seco como proteínas, hasta el 53% de lípidos y hasta el 58% de carbohidratos, dependiendo de su etapa de desarrollo (Castillo y Berger, 1983; Brow et al., 1989). La composición bioquímica de la microalga Haematococcus pluvialis ha recibido relativamente poca atención, ya que la mayoría de las investigaciones han sido dirigidas a la evaluación de otros compuestos de interés, tales como carotenoides totales y particularmente la astaxantina, en determinadas condiciones de cultivo. Sin embargo, es importante examinar la composición bioquímica de esta microalga (proteínas, carbohidratos y lípidos), sobre todo cuando van a ser incluidas como células en dietas peletizadas para la alimentación de peces y crustáceos. Esta propuesta se debe a que además de la pigmentación que dicha microalga proporciona a estos organismos, podría funcionar como complemento alimenticio o como un alimento potencial para otros organismos filtradores que forman parte de la cadena alimenticia. Estos últimos deben ser capaces de digerir la pared celular, característica de esta cepa cuando se encuentra enquistada (células en estado plameloide y aplanosporas). Los resultados obtenidos en el cultivo de Haematococcus pluvialis en los diferentes medios utilizados mostraron un porcentaje de componentes bioquímicos adecuados. Estos porcentajes son similares a los reportados para H. lacustris (Cerón, 1996) y para otras especies de microalgas, ampliamente utilizadas en acuicultura (Brown et al., 1989). Durante el desarrollo de los cultivos, predominó la presencia de células rojas sobre las demás morfologías. Se observaron células flageladas con el centro pigmentado, esta expresión de la microalga se condiseraría idónea si se lograra mantener cultivos masivos. En estas condiciones pudiera ser utilizada directamente en la alimentación de organismos con bajo poder de digestibilidad Alicia Soledad Martínez Silva 61

74 RESULTADOS Y DISCUSIÓN de paredes celulares duras, como algunos peces y crustáceos de importancia económica (Sommer et al., 1991) Extracción y determinación de pigmentos Los pigmentos carotenoides son solubles en lípidos o en solventes no polares, excepto cuando se forman complejos con las proteínas y azúcares. Los disolventes polares más utilizados para la extracción de los carotenoides son el éter de petróleo y el éter etílico. Hay otros, pero, tienen muchos inconvenientes, como ser inflamables, tóxicos y degradan rápidamente los carotenoides. Otros disolventes menos polares como la acetona, el metanol y el etanol también se utilizan para la extracción, pero sólo son eficientes siempre y cuando se trate de la extracción de xantofilas (Rodriguez-Amaya, 1997). En general, la extracción de los carotenoides se debe hacer rápidamente, a fin de evitar el contacto con la luz, el oxígeno y altas temperaturas, ya que se tiene que minimizar la degradación de estos compuestos. Según algunos autores (Rodríguez-Amaya 1989, Rodríguez- Amaya, 1990 y Amaya-Farfan, 1992), hay varios puntos que deben tenerse en cuenta en la extracción de los carotenoides, dentro de los cuales destacan: r El origen de los carotenoides. r La composición de los carotenoides en los alimentos ya que éstos varían tanto cualitativa y cuantitativamente. r La predisposición a la isomerización y la oxidación Determinación de los pigmentos en la biomasa húmeda Alicia Soledad Martínez Silva 62

75 RESULTADOS Y DISCUSIÓN (días) Unidades de absorbancia Longitud de onda (nm) Figura 15. Espectro de absorción f/ (días) Unidades de absorbancia Longitud de onda (nm) Figura 17. Espectro de absorción QF. Alicia Soledad Martínez Silva 63

76 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Clorofila a Clorofila b Astaxantina b-caroteno Luteína Concentración (mg/ml) Tiempo (días) Figura 11. Concentración de pigmentos f/ Clorofila a Clorofila b Astaxantina b-caroteno Luteína Concentración (mg/ml) Tiempo (días) Figura 15. Concentración de pigmentos biomasa humeda QF. Lababpour y Lee (2005) probaron varios disolventes orgánicos (metanol, hexano, cloroformo, n-propanol y acetonitrilo) y seleccionaron a la acetona 100% como el mejor disolvente extractivo de los pigmentos, debido a su sensibilidad y baja toxicidad en comparación con otras pruebas. No obstante en Alicia Soledad Martínez Silva 64

77 RESULTADOS Y DISCUSIÓN este estudio se obtuvieron bajos rendimientos en la extracción de Astaxantina con la Acetona 100%. Un rompimiento con DMSO es un método rápido y reproducible en comparación con los métodos de mecánicos, por lo que es un método alternativo que puede utilizarse eficazmente para de extracción de astaxantina a partir de células de H. pluvialis. Tal como se presenta en la literatura, algunos autores han señalado que en la extracción de astaxantina se han utilizado distintos extractantes y disolventes, entre ellos la acetona que ha sido uno de los disolventes orgánicos para la extracción de dicho pigmento. Se evaluó el potencial extractor de tres disolventes: Acetona 100%, Acetona-HCl 4N y DMSO. Según los resultados que se presentan en la Tabla 10. Tabla 10. Resultados de las extracciones Disolvente F/2 (Guillard y Ryther, 1962) [mg/ml] QF (Fertilizante foliar) [mg/ml] Acetona 100% 3.5 (1.4% en 50 mg*) 2.0 (0.79% en 50 mg*) Acetona-HCl 4N 2.1 (0.8% en 50 mg*) 3.8 (1.5% en 50 mg*) DMSO 3.2 (4% en 50 mg*) 2.8 (3.5% en 20 mg*)* En la figura 20 se observa las células antes y después de las extracciones con los diversos disolventes. Alicia Soledad Martínez Silva 65

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