DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A Método HPLC (columna inmunoafinidad y multifuncional) Detectar y cuantificar la presencia de ocratoxina A en alimentos.

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1 PRT Página 1 de 5 1. OBJETIVO Detectar y cuantificar la presencia de ocratoxina A en alimentos. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a cereales y sus derivados, pasas, vinos, cervezas. 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción de la micotoxina con distintos solventes de acuerdo a la matriz, purificación en columnas de extracciónen fase sólida (multifuncional o inmunoafinidad). La elección depende del límite de cuantificación en que se encuentre el analito, siendo más apropiada las columnas de inmunoafinidad pára límites más bajos. Cuantificación por HPLC usando detector de fluorescencia y confirmación de muestras positivas por LC- MS/MS 4. REFERENCIAS Método oficial de Japón, basado en la AOAC 5. TERMINOLOGÍA 5.1 Ocratoxina A: es una micotoxina que se origina principalmente de dos especies fúngicas, que son Aspergillus ochraceus y Penicillium verrucosum. Se puede encontrar en granos almacenados, vino cerveza y pasas. La administración crónica puede provocar cáncer hepático y renal. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Y EQUIPOS Balanza analítica, 0.1 mg Balanza de precisión, 0.01 g Equipo HPLC AGILENT 1200 con detector de fluorescencia Equipo LC-MS//MS 3200 Q TRAP Columnas de extracción fase sólida SPE (Multisep Ocratoxin 229 de Romer) o columna de inmunoafinidad (OcraTest WB Vicam) Homogeneizador o agitador

2 PRT Página 2 de Sistema Manifold para columnas SPE Sonicador Nitrógeno (cilindro o sistema concentrador) Baño termorregulado Erlenmeyer ámbar con tapa de 250 ml Viales ámbar de 2 ml para autosampler Papel filtro Whatman Nº 4 o equivalente, y filtro Whatman 934AH Micropipetas de 200 y 1000 µl Matraces de aforo de 10 ml ámbar Viales silanizados de 2 ml 6.2 REACTIVOS Estándar de ocratoxina A (OTA) Acetonitrilo, grado HPLC Metanol, grado HPLC, Acido acético glacial Bicarbonato de sodio, pa PBS (solución fosfato buffer salino). Disolver 8 g. NaCl, 1.16 g de Na 2 HPO 4 y 0.2 g KCl en 1 L de agua. Ajustar ph a 7.4 con NaOH 0.2 M. Este reactivo existe en tabletas y se prepara según las instrucciones del fabricante Cloruro de sodio pa Acetato de amonio 10 mm Polietilenglicol 800 (PGE 800) Solución tolueno-ácido acético 99:1 7. DESARROLLO 7.1 EXTRACION DE LA MUESTRA Moler aproximadamente 450 g de la Según la tabla N 1, elegir el peso y la solución extractante de acuerdo a la matriz a analizar. TABLA Nº 1 Matriz Peso (g)- volumen (ml) Solución Extractante Café Verde 25g MeOH-1% NaHCO 3 (7:3) 100 ml Cereales, Hojuelas, Arroz, maíz 25g NaCl 5g - MeOH-H2O (8:2) 100 ml Vino, Cervezas 10 ml 1%PEG 800-5% NaHCO 3 10 ml Trigo, Harina de Centeno 25g CH3CN-H2O (6:4) 100 ml Pasas 45g hidratados (5+4) MeOH - 1% NaHCO 3 (7:3) 80 ml

3 PRT Página 3 de Pesar en matraz ámbar con tapa de 250 ml y agitar por 30 min o mezclar a alta velocidad por 3 min en juguera Filtrar a través de un filtro Whatman N 4 o equivalente. Para vinos y cervezas filtrar a través de Whatman 934AH glass filter. Recolectar el filtrado en matraz ámbar con tapa. 7.2 PURIFICACION DE LA MUESTRA La elección de la columna para la limpieza de la muestra, depende del límite de cuantificación en que se encuentre el analito, siendo más apropiada las columnas de inmunoafinidad pára límites más bajos COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD Tomar 10 ml del filtrado y llevar a 50 ml con la solución fosfato buffer salino (PBS) Filtrar por filtro Watman 934AH glass filter. Para vinos y cervezas la purificación de la muestra se hace tomando 10 ml directo del homogenizado (sin diluir). Si las soluciones no son transparentes volver a filtrar Antes de colocar las columnas en el manifold (no se usa vacío). Hacer una pequeña perforación con una aguja en la tapa superior de la columna (para eliminar burbujas), luego retirar las tapas (inferior y superior) de la columna y conectar en el manifold. El líquido que contiene la columna comenzará a bajar. Detener el flujo cerrando la llave del manifold cuando el menisco alcance el tope del relleno (no permitir que el relleno de la columna se seque) Agregar 3 veces el volumen de la columna de PBS para retirar los conservantes que esta contiene Pasar 20 ml de la muestra (7.1.6) por la columna a flujo constante. Para los vinos y cervezas pasar 10 ml. Evitar que la columna se seque Lavar nuevamente la columna 3 veces con PBS (aprox. 9 ml en total) manteniendo el flujo constante Lavar con 10 ml de acetato de amonio 10 mm por 3 veces Con una jeringa usando adaptador hacer pasar aire en forma suave (para compactar el relleno de la columna) Colocar los viales ámbar de 2 ml silanizados bajo cada columna. Eluir la ocratoxina con 1 ml de MeOH CH 3 COOH 99+1 por tres veces Evaporar a sequedad bajo corriente suave de nitrógeno en un baño a 45 C Reconstituir con 1mL de acetonitrilo-agua-ac. acetico 30:70: Colocar en viales del autosample para su determinación y cuantificar por HPLC o LC-MS/MS si es necesario.

4 PRT Página 4 de COLUMNA MULTIFUNCIONAL La columna multifuncional (Multisep N 229 de Romer) se conecta en el manifold y se adiciona 3 veces el volumen de la columna de metanol. En este caso no es sólo para eliminar los conservantes, si no que también para activar los grupos OH (mantener el flujo constante). Las impurezas quedan retenidas en el relleno Pasar 10 ml del extracto (7.1.4) cuidando el flujo sin vacío Eliminar los 5 primeros ml del eluato, cerrar la llave y conectar los tubos silanizados bajo cada columna, abrir las llaves para recibir 2 ml del eluato Evaporar bajo corriente de Nitrógeno en baño a 45 C Una vez terminada la evaporación reconstituir con 0.5 ml de MeOH-CHOOH (30+70). Pasar a viales del autosampler para su determinación por HPLC o LS/MSMS si fuera necesario. 7.3 PREPARACION DE SPIKE Se recomienda preparar spike de muestras por adición de estándares en dos niveles: 5 µg/kg y 0.5 µg/kg, para asegurar la eficiencia del proceso. Usar matrices de 25 g de muestra (tabla N 1) Preparar una solución intermedia de 1000 ppb a partir del estándar original de 50 ppm de Ocrotoxina. Tomar 200 µl en un matraz de 10 ml y aforar con acetonitrilo Solución intermedia de 100 ppb. Tomar 1 ml de la solución de 1000 ppb (7.4.2) y llevarlos a 10 ml con acetonitrilo Spike de 5ppb. Tomar 125 µl de la solución de 1000 ppb (7.4.2), agregar a los 25 g de Spike de 0.5 ppb. Tomar 125 µl de la solución de 100 ppb (7.4.3) y agregar a los 25 g de la Para vinos y cervezas Spike de 5 ppb. Tomar 50 µl de la solución de 1000 ppb y agregar a los 10 ml de la Spike de 0.5 ppb. Tomar 50 µl de la solución de 100 ppb y agregar a los 10 ml de la Para pasas Spike de 5 ppb. Tomar 125 µl de la solución de 1000 ppb y agregar a los 45 g de

5 PRT Página 5 de Spkike de 0.5 ppb. Tomar 125 µl de la solución de 100 ppb y agregar a los 45 g de Agregar la solución extractante según tabla N 1 y continuar con el proceso. 7.4 PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN Preparar soluciones de trabajo de 0.1, 0.5, 1.0, 2.5 y 5.0 ppb a partir de la solución intermedia de 100 ppb Tomar las alícuotas correspondientes, evaporar con nitrógeno y reconstituir en fase móvil 7.5 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS HPLC Columna: Purospher STAR RP-18e (5µm), 250 mm, 4.6 mm Flujo: 1mL/min Excitación: 333 nm Emisión: 460 nm Temperatura columna: 45 ºC Vol. inyectado: 100 µl Fase movil: CH 3 CN-H 2 O-CH 3 COOH (55:43:2). Gradiente: canal A acetonitrilo (55%), canal B ácido acético-agua (45%) Tiempo corrida: 15 min 7.6 Resultado Si la técnica se realiza sin modificaciones, usando cualquiera de las columnas de limpieza, la concentración extrapolada de la curva de calibración que da el equipo, corresponde a la concentración en µg/kg (ppb) de la ocratoxina en la 7.7 CONDICIONES CROMATOGRFICAS LC-MS/MS Electrospray (ESI) Modo: positivo Fragmentador: 140 V Nebulizador: N 2 (60 psi) Gás: N 2 (10 L/min, 350 C) Ion monitor: 404 (M+H) MS/MS: 239

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