Producción de plántulas y semilla prebásica de variedades comerciales de papa libres de enfermedades

Transcripción

1 Producción de plántulas y semilla prebásica de variedades comerciales de papa libres de enfermedades Marco Antonio ARELLANO GARCÍA, Eulalia Edith VILLAVICENCIO GUTIÉRREZ y Sergio J. GARCÍA GARZA Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Centro de Investigación Regional del Noreste Campo Experimental Saltillo, Febrero 2010 Folleto Técnico No. MX ISBN:

2 SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACION LIC. FRANCISCO JAVIER MAYORGA CASTAÑEDA Secretario M. C. MARIANO RUIZ-FUNES MACEDO Subsecretario de Agricultura ING. IGNACIO RIVERA RODRIGUEZ Subsecretario de Desarrollo Rural Dr. PEDRO ADALBERTO GONZALEZ HERNANDEZ Subsecretario de Fomento a los Agronegocios INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRICOLAS Y PECUARIAS Dr. PEDRO BRAJCICH GALLEGOS Director General Dr. SALVADOR FERNANDEZ RIVERA Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación MSc. ARTURO CRUZ VAZQUEZ Encargado de la Coordinación de Planeación y Desarrollo LIC. MARCIAL ALFREDO GARCIA MORTEO Coordinador de Administración y Sistemas LIC. RICARDO NOVERÓN CHAVEZ Director General Adjunto de la Unidad Jurídica CENTRO DE INVESTIGACION REGIONAL DEL NORESTE Dr. SEBASTIAN ACOSTA NUÑEZ Director Regional Dr. JORGE ELIZONDO BARRON Director de Investigación, Innovación y Vinculación M. C. NICOLAS MALDONADO MORENO Director de Planeación y Desarrollo M. A. JOSE LUIS CORNEJO ENCISO Director de Administración CAMPO EXPERIMENTAL SALTILLO M. C. GUSTAVO JAVIER LARA GUAJARDO Director de Coordinación y Vinculación en Coahuila GOBIERNO DEL ESTADO DE COAHUILA PROFR. HUMBERTO MOREIRA VALDES Gobernador Constitucional del Estado LIC. ROMAN ALBERTO CEPEDA GONZALEZ Secretario de Fomento Agropecuario LIC. ELIAS JUAN MARCOS ISSA Subsecretario de Agricultura y Comercialización ING. JOSE CARLOS DESTEVANE MEJIA Secretario de Agricultura M. V. Z. ENRIQUE GARCA PEREZ Director de Ganadería ING. FRANCISCO MARTINEZ AVALOS Secretario de Medio Ambiente DELEGACION ESTATAL DE SAGARPA ING. EDUARDO VILLARREAL DAVILA Delegado en Coahuila ING. JORGE ALBERTO FLORES BERRUETO Subdelegado Agropecuario LIC. REYNOLD MALTOS ROMO Subdelegado de Planeación LIC. REYNALDO PEREZ-NEGRON Subdelegado de Administración FONDO MIXTO DE FOMENTO A LA INVESTIGACION CIENTIFICA Y TECNOLÓGICA CONACYT-GOBIERNO DEL ESTADO DE NUEVO LEON DR. OSCAR VAZQUEZ MONTIEL Director Regional Noreste del CONACYT Secretario Técnico del Fondo Mixto C. RODOLFO TENORIO SANCHEZ Jefe del Departamento de Enlace Técnico Noreste del CONACYT LIC. ROGELIO FLORES DE LA PEÑA Secretario Administrativo del Fondo Mixto

3 Producción de plántulas y semilla prebásica de variedades comerciales de papa libres de enfermedades Dr. Marco Antonio ARELLANO GARCÍA M. C. Eulalia Edith VILLAVICENCIO GUTIÉRREZ Dr. Sergio J. GARCÍA GARZA Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina Delegación Coyoacán, C.P México D. F. Teléfono (55) Producción de plántulas y semilla prebásica de variedades comerciales de papa libres de enfermedades ISBN: Primera Edición 2010 No. de Registro INIFAP/CIRNE/A-458 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Centro de Investigación Regional Noreste Campo Experimental Saltillo Saltillo Coah., Febrero 2010 Folleto Técnico Núm. 41, ISBN: No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de la Institución.

4 Contenido Pág. Introducción 1 Origen del cultivo de papa 4 Taxonomía y botánica 5 Descripción de la planta de papa 6 Raíz 6 Tallo 6 Hojas 7 Flor 7 Tubérculos 7 I. Fase de emergencia 8 II. Fase vegetativa 8 III. Fase de tuberización 8 IV. Fase de madurez 8 Tipos de reproducción 9 Sustento legal para la micropropagación de papa 9 I. Producción de material prenuclear 10 Obtención de vitroplántulas libres de virus 10 a) Termoterapia 10 b) Cultivo de meristemos 12 c) Pruebas serológicas para detección de virus 13 Micropropagación de papa 14 Producción de plántulas in Vitro 15 Medio nutritivo base 16 Procedimiento para la elaboración del medio nutritivo 18 Vida del medio 20 Etapa 1. Selección de materiales donantes 20 Etapa 2. Multiplicación de explantes 20 Producción de material prenuclear 20 (vitroplantas) Etapa 3. Enraizamiento ) Enraizamiento in vitro ) Enraizamiento in vivo 23 Etapa 4. Trasplante al invernadero 24 Aclimatación 24 Producción de microtubérculos de papa (prenuclear) 25 II. Producción de minitubérculos-semilla 26 Sistemas de producción de semilla prebásica en otros países. 26 Sistema de producción de minitubérculo-semilla de papa en invernaderos de la región papera del noreste de México 27 Pág. Metodología para la producción de semilla prebásica 29 Selección del sustrato 29 Solución nutritiva 30 Riegos 31 Determinación del cuando regar 33 Determinación del cuanto regar 33 Control de plagas 34 Control de enfermedades 34 Prácticas culturales 36 Aporque 36 Cosecha 36 Clasificación del tamaño de minitubérculos 36 Producción de semilla prebásica de variedades comerciales de papa bajo condiciones de invernadero 37 Efecto de la densidad de población y altura de la plántula, sobre la producción de minitubérculossemilla de papa. 38 Número de minitubérculos 38 Peso de minitubérculos 39 Efecto del tamaño del microtubérculo, sobre la producción de minitubérculos-semilla de papa 40 Proceso de certificación de tubérculos-semilla básica en campo 41 Requerimientos de semilla certificada por hectárea 42 Conclusiones 42 Literatura Citada 43

5 Índice de Cuadros Cuadro 1. Componentes de los medios de cultivo para la producción de vitroplántulas de papa (Solanum tuberosum). Cuadro 2. Características de la solución nutritiva universal elaborada por Steiner y modificada para su aplicación por etapas en la producción de minitubérculos semilla de papa. Cuadro 3. Tensiones de humedad para determinar la frecuencia de aplicación del riego (tensiómetros a 10 cm de profundidad) y coeficientes de desarrollo del cultivo (Kc), según Allen et al., (2006). Cuadro 4. Algunos productos recomendados para el control de hongos y bacterias (aplicación semanal preventiva). Cuadro 5. Clasificación con base en el diámetro polar del minitubérculo (clasificación propia). Cuadro 6. Producción de semilla básica (minitubérculos por m 2 ) de variedades comerciales de papa bajo condiciones de invernadero. Cuadro 7. Efecto de la altura de las vitroplántulas y las diferentes densidades de población en el número de minitubérculos-semilla obtenidos en la categoría media (2.5 a 5 cm de diámetro). Variedad Gigant. Cuadro 8. Efecto de la altura de las vitroplántulas y las diferentes densidades de población en el peso de minitubérculossemilla (g) obtenidos en la categoría media (2.5 a 5 cm de diámetro). Variedad Gigant. Pág Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Índice de Figuras Esquema de la trayectoria de un clon y/o variedad de papa para la producción de minitubérculo-semilla libre de virus. Elaboración del medio nutritivo para la multiplicación de papa (Solanum tuberosum) en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP. Obtención de explantes de papa (Solamun tuberosum) para la multiplicación intensiva de vitroplantas en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP. Enraizamiento in vitro de las vitroplantas de papa (Solamun tuberosum.) Los factores a controlar en esta etapa son: el medio de crecimiento, temperatura, luz y fotoperíodo. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP. Enraizamiento in vivo de vitroplantas de papa (Solanum tuberosum) en sustrato estéril. Camas en el interior del invernadero antes de ser rellenadas con el sustrato de tierra de bosque cribada. Abajo: proceso de desinfección de la tierra y vista del invernadero una vez rellenadas las camas. Figura 7. 1) Establecimiento de vitroplántulas; 2) Humedecimiento del Agribón; 3) Detalle del establecimiento de las vitroplántulas por debajo del Agribón; 4) Establecimiento completo de las vitroplantulas. Pág

6 Figura 8. Equipo Xilema, con la disposición de los elementos fertilizantes, cuando se tienen dos tanques para la concentración de la solución nutritiva. Figura 9. Detalle de la utilización de tensiómetros para el control de la aplicación del agua. Figura 10. Detalle de la sanidad lograda en el interior del invernadero. Figura 11. Tamaño de minitubérculos preferidos para la siembra, en campo, de semilla prebásica de papa. Figura 12. Producción de minitubérculos/m 2, mediante la siembra directa de microtubérculos. Invernadero Campo Experimental Saltillo. Figura 13. Esquema de certificación de tubérculossemilla de papa. Pág Producción de plántulas y semilla prebásica de variedades comerciales de papa libres de enfermedades Marco Antonio Arellano García 1 Eulalia Edith Villavicencio Gutiérrez 2 Sergio Javier García Garza 3 Introducción La papa es un alimento de gran importancia para el consumo en fresco y procesado que, junto con el maíz, frijol, trigo y arroz forman parte de la dieta del mexicano. De las 63 mil 919 ha anuales que se siembran con papa en el país, sólo el 20 % de la superficie utiliza semilla calificada (prebásica, básica, registrada, certificada y habilitada) (CONPAPA, 2009). La semilla es el insumo más importante en todo cultivo, siendo la disponibilidad de semilla sana y de buena calidad uno de los principales factores que limitan la producción de este tubérculo. Desde 1982 en el INIA, ahora INIFAP, se empezaron a establecer proyectos encaminados a la producción de semilla de papa. Posteriormente, en 1988 el sistema de producción Laboratorio-Invernadero-Campo fue adoptado por algunos productores del centro del país; sin embargo, aún no se ha logrado abastecer de suficiente semilla con calidad fitosanitaria. Las principales variedades comerciales de papa de las que se ha generado semilla calificada en México han sido variedades como: Alpha, Atlantic, Gigant, Mondial, Fiana, Caesar, Vivaldi y Felsina, y de una cantidad reducida de variedades mexicanas como: Norteña, Montserrat, Zafiro, Malinche y Tollocan. Entre las décadas de los 60 s y 70 s, la producción de semilla certificada en nuestro país se realizó con materiales importados de Europa, posteriormente se facilitó la importación de semilla de Holanda y 1 Dr. Ex-investigador del Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP. 2 M.C. Investigadora del Nodo Regional de la Red de Investigación e Innovación de Hortalizas del Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP. 3 Dr. Investigador del Nodo Regional de la Red de Investigación e Innovación de Hortalizas del Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP.

7 Canadá y los productores dejaron de producir semillas de variedades mexicanas criollas y mejoradas. A finales de la década de los 80 s y principios de los 90 s se presentaron una serie de eventos que dificultaron en nuestro país el comercio de semillas, como fue la restricción de la semilla importada, debido a problemas fitosanitarios y la firma del Tratado de Libre Comercio de América del Norte (TLCAN). Durante la última década se han hecho esfuerzos para consolidar en el sector agropecuario el sistema-producto papa, generando normas fitosanitarias para su producción en invernadero y campo, lo que ha fortalecido el programa de producción de semillas. Esto ha generado que a nivel nacional se tengan establecidos 10 laboratorios y 17 invernaderos con una superficie útil de 60 mil m 2, en los que se producen aproximadamente 25 millones de minitubérculos por año, con los que se abastece sólo el 1.3% de la superficie cultivada, sin llegar a satisfacer la demanda nacional (Hernández, 2008). En la zona papera del noreste de México existen 4 laboratorios y 5 invernaderos con una capacidad instalada de 11,248 m 2 y una superficie de 8,000 m 2, donde se llegan a generar hasta tres cosechas de minitubérculos al año, obteniendo 1.5 millones de unidades de minitubérculos-semillas clasificados como semilla con categoría prebásica, mismos que se pueden utilizar para establecer 50 ha. Esta producción es baja si se considera que en el ciclo Primavera-Verano 2007 (P-V) se sembraron en esta región 5,000 ha y la producción de semilla prébasica sólo cubrió el 1% de esta superficie. Algunos productores de la región papera de Coahuila y Nuevo León han invertido en la 2 construcción de invernaderos para abastecerse de semilla, importando plántulas in vitro y/o minitubérculos a precios altos. En esta infraestructura se pueden obtener minitubérculos comerciales con un diámetro mayor a 2.5 cm. Como lo refiere Ranalli et al., (1994), el potencial genético de una variedad o clon se conserva con tubérculossemilla libres de virus, en donde la calidad fitosanitaria repercute en el rendimiento del cultivo, por lo que la producción de semilla prebásica es importante. La capacidad de producción de semilla certificada de papa en la región corresponde aproximadamente al 10% de la demanda total de semilla, valuada en $780 millones de pesos, considerándose un cultivo clave en la economía y en la generación de empleos directos (60 jornales por hectárea) e indirectos (compañías productoras de agroquímicos, transportes, comercio e industria). Recientemente, este cultivo ha sido seriamente afectado por la enfermedad conocida como síndrome de la punta morada de la papa (PMP), la cual reduce el rendimiento y la calidad del cultivo en ocasiones en más del 65%. Durante el ciclo de producción P-V 2006, el cultivo de papa tuvo grandes pérdidas debido a este síndrome, el cual, se considera como el factor limitante de la producción de este cultivo en México (CONPAPA, 2009). La PMP se detectó en México en el año de 1948 y se clasificó como un problema de baja importancia. Sin embargo, esta enfermedad se ha incrementado notablemente en los últimos 15 años, afectando al 70% de la superficie sembrada con papa en México y un gran porcentaje en la región papera de Coahuila y Nuevo León (Flores y Flores, 2008). 3

8 Para seguir apoyando a este sector productivo, es necesario fortalecer el esquema de producción de semilla certificada, ya que este ha sido el insumo más afectado con pérdidas mayores al 65% debido a la PMP, por lo que el objetivo de la presente publicación es ofrecer a los productores y a los interesados en esta cadena productiva, una metodología para la producción de minitubérculossemilla prebásica libre de agentes patógenos, describiendo de manera práctica los resultados obtenidos en el Campo Experimental Saltillo del INIFAP bajo el esquema de producción de Laboratorio-Invernadero. Origen del cultivo de papa Existe abundante evidencia arqueológica que demuestra que la papa ha sido cultivada en la región Andina de América del Sur desde tiempos muy antiguos. Se considera que el centro de origen es en las tierras altas del sur de Perú, en una zona comprendida entre El Cuzco y los alrededores del lago Titicaca. De ahí se difundió por el sur hacia Bolivia, Argentina y Chile; y por el norte hacia Ecuador, Colombia, Venezuela, Guatemala y México. Han transcurrido miles de años desde que el hombre andino domesticó una o más especies silvestres del género Solanum con capacidad de producir tubérculos. Una vez que la agricultura se hizo más extensiva, la papa fue difundida a otras áreas geográficas, en donde se generaron variedades mas adaptadas a cada lugar. En estas regiones numerosos cultivares nativos muestran gran variación en el tipo de hoja, color de flor y característica de los tubérculos, tales como forma, color y sabor. Dentro de las especies cultivadas, la subespecie tuberosum se cultiva mundialmente. 4 Sin embargo, en el sur de Chile se han cultivado por varios siglos, cultivares nativos de esta subespecie. La subespecie andigena es todavía la de mayor distribución en la zona andina de Venezuela, Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia, el norte de Argentina y también se cultiva en algunas áreas de Guatemala y México. Tradicionalmente se produce entre los 2,000 y 4,000 metros de altitud (Huamán, 1986). La diferencia entre andigena y tuberosum reside en la adaptación a la longitud del día. La evidencia experimental expuesta en Europa y Estados Unidos muestra que las poblaciones de andigena adaptadas principalmente a días cortos se pueden transformar en poblaciones tolerantes a días largos. Este proceso se acompaña de cambios morfológicos, tales como disminución en el crecimiento de la parte superior, entrenudos más cortos, hojas más grandes, reducción en su floración y producción de frutos. Esto indica que las subespecies presentes en Chile, Europa y Estados Unidos proceden de andigena a través de un proceso de adaptación a los días largos que son características en estas zonas (Plaisted, 1971). Taxonomía y botánica La papa cultivada y sus parientes silvestres se clasifican como sigue: Familia: Solanaceae Género: Solanum Sección: Petota (tuberosum) Sub-Sección: Potatoe (hyperbasarthrum) La última categoría taxonómica se subdivide en series y éstas en especies. La papa es una dicotiledónea herbácea con hábitos de crecimiento rastrero o erecto, generalmente de tallos gruesos y leñosos, con entrenudos cortos. 5

9 Los tallos son huecos o medulosos, excepto en los nudos que son sólidos, de forma angular y por lo general verdes o rojo púrpura. El follaje normalmente alcanza una altura entre 0.60 a 1.50 m. Las hojas son compuestas y pignadas. Las hojas primarias de plántulas pueden ser simples, pero una planta madura contiene hojas compuestas en par y alternadas. Las hojas se ordenan en forma alterna a lo largo del tallo, dando un aspecto frondoso al follaje, especialmente en las variedades mejoradas. Descripción de la planta de papa Raiz. La raíz puede desarrollarse a partir de una semilla o de un tubérculo. Cuando crece a partir de una semilla, forma una delicada raíz axonomorfa, con ramificaciones laterales. Cuando crece de tubérculos, forma raíces adventicias, primero en la base de cada brote y luego encima de los nudos en la parte subterránea de cada tallo. El sistema radical varía de delicado y superficial a fibroso y profundo Tallo. Las plantas provenientes de semilla verdadera tienen un tallo principal, mientras que las provenientes de tubérculos-semillas pueden producir varios tallos. El tallo es generalmente de color verde y algunas veces puede ser de color marrón-rojizo o morado. Las yemas que se forman en el tallo a la altura de las axilas de las hojas pueden desarrollarse para llegar a formar tallos laterales, estolones, inflorescencias y, a veces, tubérculos aéreos. Los estolones son tallos laterales que crecen horizontalmente por debajo del suelo a partir de yemas de la parte subterránea de los tallos. Los estolones pueden formar tubérculos mediante un agrandamiento de su extremo terminal. 6 Sin embargo, no todos los estolones llegan a formar tubérculos; un estolón no cubierto con suelo, puede llegar a ser un tallo vertical con follaje normal. Hojas. Las hojas están distribuidas en espiral sobre el tallo. Normalmente, las hojas son compuestas, es decir, tienen un raquis central y varios folíolos. Cada raquis puede llevar varios pares de folíolos laterales primarios y un folíolo terminal. Flor. El pedúnculo de la inflorescencia está dividido generalmente en dos ramas, cada una de las cuales se subdivide en otras dos ramas. Las flores de papa son bisexuales y poseen las cuatro partes esenciales de una flor (cáliz, corola, estambres y pistilo). Las flores pueden ser de color blanco, crema, azul claro, rojo o morado en diferentes tonos e intensidades. Las flores pueden llegar a formar frutos llamados baya, que contienen numerosas semillas conocidas como la semilla sexual de la papa (Huamán, 1986). Tubérculos. Morfológicamente los tubérculos son tallos modificados y constituyen los principales órganos de almacenamiento de la planta de papa. Un tubérculo tiene dos extremos: el basal o extremo ligado al estolón, que se llama talón, y el extremo opuesto, llamado apical o distal. Los ojos del tubérculo de papa se distribuyen sobre la superficie del mismo en espiral. Los ojos corresponden morfológicamente a los nudos de los tallos, las cejas representan las hojas y las yemas del ojo representan las yemas axilares. Los brotes crecen de las yemas que se encuentran en los ojos del tubérculo. El brote es una característica varietal importante. La forma y color del brote es para la papa lo que la huella digital es en los humanos. 7

10 Los brotes pueden ser blancos, parcialmente coloreados en la base o el ápice, o casi totalmente coloreados. En la mayoría de las variedades comerciales la forma del tubérculo varía entre redonda, ovalada y oblonga. La piel del tubérculo o peridermo, es una capa delgada protectora del exterior del tubérculo; su color varía entre blanco, crema, café, amarillo, naranja, rojo o morado. En algunas variedades la piel de los tubérculos tiene dos colores; generalmente es suave y en algunas variedades es rugosa o áspera y, al frotarla cuando el tubérculo no ha madurado, se desprende fácilmente. Por eso, el daño de la piel es frecuente cuando se cosechan tubérculos antes de su madurez. En la superficie de la piel se encuentran distribuidas las lenticelas (poros respiratorios) por los cuales se efectúa el intercambio de gases entre el tubérculo y el ambiente. La pulpa constituye la carne del tubérculo la cual, en variedades comerciales, es normalmente de color blanco, crema o amarillo pálido; algunas variedades andígenas presentan dos colores. El crecimiento y desarrollo de las plantas pueden dividirse en cuatro fases: I. Fase de emergencia. Período entre la siembra y la aparición de los brotes en el surco. II. Fase vegetativa. Período entre la emergencia y la iniciación de la tuberización. III. Fase de tuberización. Período entre el inicio de la formación de tubérculos y el máximo desarrollo del follaje. En muchas variedades introducidas este período coincide con el inicio y la finalización de la floración. Esta relación no está bien establecida para la mayoría de los cultivares mexicanos. IV. Fase de madurez. Período entre el máximo desarrollo del follaje y la senescencia total. 8 Tipos de reproducción La papa se puede propagar por medio de la reproducción sexual (semilla botánica) y asexual (tubérculo). La sanidad fisiológica de los tubérculos-semilla está entre los factores más importantes que influyen sobre la producción. En los sistemas de producción convencional, los tubérculos se utilizan generalmente para la multiplicación y producción. Este método tiene algunas desventajas como un índice reducido de multiplicación y un alto riesgo de adquirir enfermedades (fungosas, virales y bacterianas). Algunas plagas y agentes causales de enfermedades pueden ser transmitidos y diseminados por los tubérculos, causando así la degeneración de los tubérculos-semilla. La papa es propensa a la degeneración de la semilla porque la propagación continua disminuye la calidad de los tubérculos-semilla, causado por un aumento en las enfermedades, entre las cuales las provocadas por virus son las más frecuentes. Algunas de las ventajas de utilizar tubérculos-semilla para la multiplicación de la papa son: la producción de plantas sanas, la uniformidad de los tubérculos y el crecimiento vegetativo vigoroso. Existen técnicas de multiplicación desarrolladas recientemente. Una de éstas es la producción in vitro o cultivo de tejidos. Esta técnica es muy flexible y produce una tasa de multiplicación alta, la cual proporciona vitroplántulas libres de enfermedades (Roca et al., 1978; Wang y Hu, 1982; Jones, 1988; Beukema y Van der Zaag, 1990). Sustento legal para la micropropagación de papa El proceso de producción de vitroplantas se inicia en laboratorio, en donde se multiplica de 9

11 manera intensiva el genotipo o variedad comercial de interés. Los laboratorios comerciales dedicados a esta actividad deben estar dados de alta, contar con su registro fitosanitario, cumplir con la Norma Oficial Mexicana NOM-041-FITO-2002 y la Ley Federal de Producción y Certificación de Semillas SAGARPA- SNICS. I. Producción de material prenuclear Obtención de vitroplántulas libres de virus En el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del CESAL así como en otros laboratorios comerciales el método que tradicionalmente se ha utilizado para obtener vitroplántulas libres de virus es mediante la termoterapia, despunte apical y cultivo de ápices meristemáticos establecidos in vitro. a) Termoterapia Para la erradicación de uno o más virus, se requiere someter el material vegetativo ya sea plantas de maceta o vitroplántulas a un período de calor (Escalante, 1989). En el primer caso, se establecen minitubérculos de papa del genotipo de interés en macetas, luego que las plantas alcanzan entre 15 a 20 cm se someten a un tratamiento con calor considerando temperaturas de incubación relativamente altas (± 28 hasta 32 C) por un período de 3 a 4 semanas (Figura 1). Para promover el desarrollo vegetativo del vástago, inactivar la multiplicación del virus y mantener el metabolismo de la planta, se recomienda que en la termoterapia también se considere el fotoperíodo y humedad relativa, debido a que la interacción de dichos factores influye en la sobrevivencia del material (Escalante, 1989). 10 LIMPIEZA Disección meristemo MULTIPLICACION PRODUCCIÓN SEMILLA PREBASICA INVERNADERO camas 10 x 10 cm Cultivo de meristemos y Termoterapia Prueba de Elisa Material libre de virus Prueba de Elisa ACLIMATACION Figura 1. Esquema de la trayectoria de un clon y/o variedad de papa para la producción de minitubérculo-semilla libre de virus. 11 BANCO DE GERMOPLASMA Almacenamiento PRODUCCION MICROTUBERCULOS PRODUCCIÓN SEMILLA BASICA EN CAMPO

12 Escalante (1989) y López-Delgado y Zavala (1988) coinciden en señalar que la termoterapia es el método más utilizado para obtener plantas libres de virus, agregando que algunos virus son más estables que otros por lo que su erradicación se vuelve un problema, debido a que algunos genotipos necesitan períodos más largos de termoterapia que otros o viceversa. b) Cultivo de meristemos Morell y Martín (1952) demostraron que el tejido meristemático es capaz de desarrollar vitroplántulas completas a partir de células aisladas. El meristemo es un tejido no diferenciado que se divide rápidamente y constituye el punto activo de la yema vegetal. Esta es una estructura genéticamente estable en donde el nivel de infección viral tiende a ser reducido, debido a que los primordios foliares no están en contacto con los haces vasculares del tallo (tejido más diferenciado), originando que la concentración del virus sea reducida. Aunque el cultivo de meristemos se conoce desde 1955, la técnica ha sido modificada en papa por Kartha (1981) y Debergh (1991). Se ha encontrado que el número de plántulas libres de virus tiene una relación inversa con el tamaño del meristemo, esto significa que mientras más grande sea el meristemo las posibilidades de su establecimiento in vitro aumentan pero se disminuye la probabilidad de saneamiento. Al respecto Kartha (1981) encontró menor eficiencia (10%) en el saneamiento al establecer primordios grandes ( mm), mientras que Debergh (1991) obtuvo mayor eficiencia (100%) cuando estableció domos más pequeños ( mm). 12 El aislamiento del meristemo y su establecimiento in vitro son procesos delicados que requieren mucha práctica. Bajo el esquema combinado de termoterapia y cultivo de meristemos, en algunos casos la etiolación puede aumentar el margen de seguridad en la obtención de plantas sanas. Después de la termoterapia, los tallos de las plantas se fraccionan y disectan extrayendo el meristemo apical, con uno o dos primordios foliares, los cuales se transfieren a un medio de cultivo selectivo haciéndolos crecer. Al desarrollarse forman una planta nueva, de la cual se extrae una muestra para realizar la prueba de ELISA (Ensayos Inmunoabsorbentes de Enzimas Ligadas) y determinar la eficiencia de la limpieza. Las plantas seronegativas (libres de virus) continúan su fase de multiplicación hasta obtener el volumen deseado (Figura 1). Cuando se tiene un interés particular sobre un clon o variedad, las yemas también pueden tomarse de plantas en campo. c) Pruebas serológicas para detección de virus En el laboratorio se lleva a cabo la termoterapia, disección y cultivo de meristemos, y posteriormente la prueba de ELISA seleccionando aquellas vitroplántulas que hayan resultados seronegativas. Con esta prueba serológica se determina el estado fitosanitario del material vegetal. En papa, se han realizado pruebas serológicas, las cuales se basan en la reacción antígeno-anticuerpo (López- Delgado et al., 1985). Entre las más comunes están: a) doble difusión de gel; b) hibridación molecular; c) micro precipitación; d) látex y e) ELISA. Sin embargo, en años recientes esta última ha sido la más utilizada debido a que requiere menor cantidad de antisuero 13

13 muestras en menor tiempo y es más sensible que la que las otras, permite analizar un mayor número de prueba de látex (Salazar, 1998; López-Delgado Zavala, 1988). En la prueba serológica de ELISA pueden utilizarse plántulas de laboratorio y/o de invernadero, su fundamento se basa en el uso de enzimas conjugadas a moléculas de anticuerpo (gamma-globulina) para detectar partículas de virus provenientes de extractos de savia de la planta. En papa los virus que comúnmente se detectan en la prueba de ELISA son: el PVM, PVS, PVY, PVX y PLRV (DOF, 2003). Actualmente existen antisueros comerciales para virus específicos por lo que esta prueba es igual de efectiva que los ensayos electroforéticos, hibridación molecular y microscopía electrónica (Hooker, 1981; Escalante, 1989). En caso que el material resulte seropositivo se aplica termoterapia y/o quimioterapia para eliminar los patógenos (Figura 1). Después de la termoterapia se vuelve a realizar la misma prueba serológica con el fin de certificar la limpieza, si el material resulta seronegativo se procede a su multiplicación (Salazar, 1983; López-Delgado y Zavala 1988). Esta prueba es de mucha importancia en el sistema laboratorio-invernadero, dentro de la etapa de multiplicación, en la producción de plantas in vitro y en la producción de minitubérculos-semilla prebásica cosechada en invernadero. También se recomienda su realización en la producción de tubérculos-semilla básica obtenida en campo (Salazar, 1998). Micropropagación de papa La micropropagación de plantas forma parte de la biotecnología moderna, en la cual se utiliza el cultivo de tejidos vegetales para multiplicar rápida y masivamente una especie de interés (Figura 1). 14 Mediante esta técnica se pueden producir vitroplántulas a partir de pequeños segmentos (yemas, tallos, hojas) que crecen dentro de un tubo o frasco en un medio aséptico (libre de microorganismos). El cultivo de tejidos permite manipular no sólo los mecanismos de diferenciación celular, sino también los factores físicos y químicos que los regulan, por lo que en papa las técnicas de micropropagación pueden utilizarse para producir en un tiempo corto una gran cantidad de vitroplántulas y microtubérculos in vitro, ambos con calidad fitosanitaria. Producción de plántulas in vitro La micropropagación es el método más rápido para producir plántulas manteniendo su calidad fitosanitaria. La técnica del cultivo de tejidos vegetales ha solucionado algunos de los problemas asociados al sistema convencional de producción de tubérculos-semilla, como son la obtención de una gran cantidad de vitroplántulas sin virus (Khurana et al., 2003). También es posible obtener un índice más alto de multiplicación, material sano, almacenaje y transporte más conveniente y menores espacios durante la multiplicación. Además, la multiplicación se puede hacer en todo el año (Wang y Hu, 1982; Marinus, 1983; Struik y Wiersema, 1999). El término "cultivo in vitro" se define como el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (semillas, embriones u órganos superiores) dentro de recipientes de vidrio en condiciones estériles de ambiente controlado (Pierik, 1987). El cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante; por lo tanto, los principales factores no biológicos que afectarán al desarrollo del cultivo in vitro son: 1) La composición del medio y el ph 15

14 (ambiente químico) y 2) la temperatura, luz y fotoperíodo a los cuales serán sometidos los explantes (ambiente físico). El cultivo de tejidos permite manipular los mecanismos de diferenciación celular, así como los factores físicos y químicos que los regulan, por lo que en papa las técnicas de micropropagación pueden utilizarse para producir en un tiempo corto no sólo una gran cantidad de vitroplántulas, sino también microtubérculos in vitro, ambos con calidad fitosanitaria. Para la multiplicación in vitro se utilizan segmentos de tallo con al menos una yema axilar como explantes (Figura 1). La propagación de nódulos puede hacerse en tubos, frascos, envases o magentas, variando el número de explantes que se establecen, siendo de 4, 10 y 25, respectivamente. Los explantes, cualquiera que sea su naturaleza, requieren de un medio que suministre un balance nutricional adecuado, para que a corto plazo se obtenga un crecimiento óptimo (Toledo et al., 1998). Existen diferentes medios de cultivo, por lo que su selección depende del objetivo que se persiga, ya sea establecimiento in vitro, multiplicación, cultivo de meristemos, almacenamiento, microtuberización, etc. El medio que más se ha utilizado para la producción de plántulas in vitro de papa es el propuesto por Murashige y Skoog (1962), el cual es adicionado con diferentes dosis de fitohormonas, vitaminas y ajustadores osmóticos, dependiendo los intereses establecidos. Medio nutritivo base Existen diferentes medios de cultivo, por lo que su selección depende del objetivo que se persiga, ya sea para el establecimiento in vitro o multiplicación. 16 Cuadro 1. Componentes de los medios de cultivo para la producción de vitroplántulas de papa (Solanum tuberosum). Composición Requerimientos Peso para 1 L de medio molecular (g) Milimoles Micromoles (mm) (µm) Macroelementos NH 4 NO KNO MgSO 4.7H KH 2 PO Ca(NO 3 ) Microelementos IK H 3 BO MnSO 4.4H 2 O ZnSO 4.7H 2 O Na 2 MoO 4.2H 2 O CuS0 4.5H 2 O CoCl.6H 2 O Quelatos Na 2 EDTA FeSO 4.7H 2 O Vitaminas Acido Nicotínico Piridoxina Tiamina Myoinositol Aminoácidos Glicina Acido P é i Medio de Cultivo Sacarosa Agar (6.0 g/l) En otros laboratorios comerciales y en el del CESAL el medio nutritivo base que se ha utilizado 17

15 para la producción de plántulas in vitro de papa es el MS (Murashige y Skoog, 1962), mismo que se complementa con diferentes dosis de fitohormonas, vitaminas y ajustadores osmóticos (Cuadro 1). Los explantes requieren de un medio que suministre un balance nutricional adecuado para que a corto plazo se obtenga un crecimiento óptimo. Procedimiento para la elaboración del medio nutritivo A continuación se describe el procedimiento para la elaboración del medio nutritivo. 1) En un vaso de precipitado añadir la cuarta parte de agua destilada de la cantidad que se desea preparar de medio (Figuras 2a y 2b). 2) Disolver la cantidad de sacarosa. 3) Añadir el volumen correcto de cada una de las soluciones de microelementos y macroelementos (Figura 2c). 4) Añadir el volumen correcto de quelatos, vitaminas y aminoácidos (Figura d). 5) Añadir las fitohormonas si el medio nutritivo lo requiere. 6) Mezclar estos componentes y aforar con agua destilada a la cantidad que se desea preparar del medio (Figura 2e). 7) Introducir el electrodo del potenciómetro en el medio, esperar que el aparato tome la lectura y ajustar el ph a 5.7. Para bajarlo agregar algunas gotas de HCl 1N y para subirlo aplicar algunas gotas de NaOH (Figura 2f). 8) Colocar el medio en una parrilla para calentar y agregar el agar, mezclar hasta diluirlo, antes de la ebullición. 9) Vaciar el medio en los recipientes, ya sean frascos, tubos o envases y esterilizar por minutos en el autoclave, considerando una temperatura de 120 C y 4 libras de presión (Figuras 2g y 2h). 10) Ya esterilizados, los recipientes se colocan en un lugar limpio. a b c e g Figura 2. Elaboración del medio nutritivo para la multiplicación de papa (Solanum tuberosum) en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP. 19 f d h

16 Vida del medio El medio de cultivo se puede almacenar a temperatura ambiente por una semana. Si se requiere aumentar el tiempo de almacenamiento el medio de cultivo tendrá que refrigerarse. Sin embargo, de preferencia se debe usar medio fresco, siempre que sea posible. Etapa 1. Selección de materiales donantes El material vegetativo puede obtenerse de un banco de germoplasma in vitro, seleccionarse de minitubérculos-semilla sanos o de campo. En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP se han utilizado las variedades; Atlantic, Gigant, Mondial, Alpha, Felsina, Vivaldi y Caesar además de clones del INIFAP provenientes de genotipos sobresalientes para la zona de Coahuila y Nuevo León y otros provenientes del Centro Internacional de la Papa (CIP). Todo el material vegetativo utilizado ha sido sometido a pruebas de indexación corroborando su calidad fitosanitaria, realizando las pruebas de ELISA correspondientes de acuerdo a lo señalado anteriormente. Después de obtener plántulas seronegativas in vitro se procede a su multiplicación intensiva para producir material prenuclear. Etapa 2. Multiplicación de explantes Producción de material prenuclear (vitroplantas) La multiplicación in vitro del material vegetativo de interés se realiza obteniendo explantes de la planta donadora a partir de cortes transversales. Los segmentos de tallo con yema axilar o apical son de 1 cm de longitud, los cuales son sembrados en contenedores con medio de multiplicación semisólido, como se describió en la Figura Los explantes requieren de un medio que suministre un balance nutricional adecuado, para que a corto plazo se obtenga un crecimiento óptimo, éstos se cultivan en envases de polipropileno, estableciendo un total de 25 explantes por envase con 50 ml de medio. El medio de multiplicación que se utiliza para la producción intensiva de plántulas in vitro de papa es el de Murashige y Skoog (1962), el cual es adicionado con diferentes dosis de vitaminas y ajustadores osmóticos de acuerdo a lo descrito en el cuadro 1. Dependiendo del genotipo, los subcultivos en este medio semisólido se realizan después de un período de incubación de 4 a 6 semanas para obtener vitroplantas (Figura 3). Figura 3. Obtención de explantes de papa (Solamun tuberosum) para la multiplicación intensiva de vitroplantas en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE- INIFAP. 21

17 Las vitroplantas generadas sirven como fuente donadora de explantes, obteniendo de cada subcultivo de 4 hasta 8 segmentos de tallo más yema por vitroplanta, mismos que pueden utilizarse como material prenuclear para la producción de minituberculos en invernadero o utilizarse para la producción de microtubérculos in vitro. En esta etapa se vuelve a corroborar el estado fitosanitario de las vitroplantas producidas; el material que resulta seronegativo se sigue multiplicando periódicamente en un medio de cultivo fresco, realizando estas operaciones asépticamente. Se recomienda que en esta etapa se lleve un registro de la producción semanal de cada genotipo y de la producción que genera cada persona dedicada a la multiplicación, para determinar el volumen de producción en función del tiempo y de este modo programar y coordinar las labores de la siguiente etapa en invernadero. Etapa 3. Enraizamiento 3.1) Enraizamiento in vitro Es importante que el enraizamiento de las vitroplantas sea inducido dentro del medio de cultivo, pues de ello depende en gran medida que se obtengan altas tasas de viabilidad en la siguiente etapa. En papa no se requieren reguladores de crecimiento para inducir este proceso; pero sí condiciones mixotróficas que lo favorezcan, como regular la concentración de sacarosa del medio en el último subcultivo y controlar el fotoperíodo. Las raíces formadas en esta etapa no son 100% funcionales para la asimilación de nutrientes, pero sí aseguran un buen sostenimiento en el sustrato cuando se establecen en invernadero. 22 Las vitroplantas listas para el invernadero se extraen de sus contenedores, se lavan con abundante agua para eliminar los restos del medio de cultivo del sistema radicular y evitar su contaminación en el sustrato. Se acomodan en papel húmedo y se llevan al invernadero para su trasplante (Figura 4). Figura 4. Enraizamiento in vitro de las vitroplantas de papa (Solamun tuberosum.) Los factores a controlar en esta etapa son: el medio de crecimiento, temperatura, luz y fotoperíodo. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE- INIFAP. 3.2) Enraizamiento in vivo En este caso, las vitroplantas se transfieren a suelo utilizando un sustrato limpio y esterilizado que se coloca en contenedores de plástico termoestables acondicionados con un domo. Dependiendo del tamaño del contenedor que se utilice se establecen entre 25 hasta 60 plantas/contenedor. Como sustrato para el enraizamiento se puede utilizar peat moss comercial. Con este método se requiere que las vitroplantas tengan más de tres yemas axilares y que las hojas estén bien desarrolladas, esto, para que la planta a través de la fotosíntesis obtenga los 23

18 fotosintatos y energía necesaria para enraizar y desarrollarse. Los contenedores con las plantas se llevan al invernadero para su aclimatación. En este proceso es necesario cuidar los factores que controlan el ambiente de crecimiento, como la temperatura del invernadero y aplicar riego por nebulización periódicamente con una solución nutritiva. Después de tres semanas las plantas están listan para su establecimiento en las camas de invernadero (Figura 5). Figura 5. Enraizamiento in vivo de vitroplantas de papa (Solanum tuberosum) en sustrato estéril. Etapa 4. Trasplante al invernadero Aclimatación. Dado que las plántulas obtenidas in vitro carecen de adaptaciones morfológicas que les permitan el traspaso directo a las condiciones exteriores, éstas deben ser transplantadas manteniendo un control de la temperatura, humedad relativa e intensidad lumínica en invernadero. 24 Vitroplantas sanas enraizadas in vitro o in vivo que presenten más de 4 nudos cada una se pueden transplantar a suelo. Al momento que se extraen de sus contenedores, ambos tipos de plántulas están poco adaptadas para crecer en un invernadero, ya que ambas han crecido en ambientes con una elevada humedad relativa, por lo que sus estomas no responden fácilmente al descenso de la humedad y son susceptibles a la desecación al momento del trasplante. Esto debido a la falta de una cutícula cerosa bien desarrollada, que es necesaria para evitar la pérdida de agua. Independientemente del tipo de plantas utilizadas, éstas requieren aclimatarse en invernadero por un periodo de 2 a 3 semanas en donde se disminuya progresivamente la humedad relativa e incremente progresivamente la intensidad de luz. Esto se logra colocando una cubierta de Agribón en la cama del invernadero. Después de este período se retira el agribón y se levanta el sistema de riego por microaspersión, para continuar con el ciclo normal del cultivo. Aplicando este procedimiento la sobrevivencia de las plantas al trasplante es alta; sin embargo, el proceso es delicado y requiere el uso intensivo de mano de obra. Producción de microtubérculos de papa (prenuclear) Los microtubérculos representan otra forma de producir material prenuclear en laboratorio y se utilizan como fuente de material vegetativo para la producción como minitubérculos-semilla prebásica de papa en invernadero. 25

19 Estos son comúnmente cosechados asépticamente, y al envasarse son tratados con fungicidas, secados y suberizados en la obscuridad a 20 C. Este material se almacena en refrigeradores a 4-5 C para cumplir con sus requerimientos de dormancia. Por el tamaño tan pequeño que caracteriza a este material vegetativo es más fácil de manejar en invernadero; sin embargo, se requiere que los microtubérculos estén brotados. Los microtuberculos se producen a partir de vitroplantas que se subcultivan en un medio base inductor de tuberización adicionado con 5 mg/l de BAP (6-Bencilaminopurina) y 500 mg/l de CCC (chlorocholine chloride) incubando los nódulos en oscuridad por cuatro semanas para obtener de 3 a 5 microtubérculos/ frasco. II. Producción de minitubérculos-semilla Sistemas de producción de semilla prebásica en otros países. En la Estación Experimental Sta. Catalina del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), localizado en la ciudad de Quito, Ecuador, se utilizaba como sistema convencional para la producción de minitubérculos, camas de producción bajo invernadero con un sustrato a base de tierra negra, pomina y humus, con fertilización sólida y riego manual, con una densidad de 16 vitroplántulas/m 2 (arreglo topológico de 25 x 25 cm). Posteriormente, pasaron a un sistema semihidropónico, el cual consistió en colocar un sustrato liviano en camas de producción. El agua y los nutrientes se suministraron por medio de un sistema de riego por goteo y la densidad utilizada cambió a 34 plantas/m 2 (arreglo topológico de 15 x 20 cm entre plantas). Actualmente, el INIAP 26 recomienda utilizar el arreglo topológico de 15 x 15 cm entre plantas. Sin embargo, no encontraron diferencias significativas en cuanto a producción frente al sistema convencional, pero sí se obtuvo un incremento en la calidad sanitaria de la semilla. En su sistema de producción también utilizan plantas in vitro producidas en laboratorio, libres de virus, plagas y enfermedades, de diferentes variedades (Paredes et al., 2004). En la región de Asia Tropical, se está utilizando la tecnología del cultivo de tejidos para producir tubérculos-semilla de papa libre de virus. Han observado incrementos en los rendimientos de este cultivo utilizando esta técnica (Nagib et al., 2003). De igual manera sucede en la India, en donde desde 1999 se encuentran aplicando el cultivo de tejidos (Khan et al., 1999). En todas las regiones del mundo en donde se produce este cultivo, ya se encuentran utilizando este tipo de tecnologías para erradicar las enfermedades o virus. Sistema de producción de minitubérculosemilla de papa en invernaderos de la región papera del noreste de México El rendimiento de la región papera de Coahuila y Nuevo León es de los más altos del país; sin embargo, el beneficio económico para el productor se reduce, debido a que el costo por hectárea es alto ($100,000 ha -1, aproximadamente). Una parte importante de este costo (25 al 35%) se destina a la compra de semilla. Para satisfacer las necesidades de este insumo se requieren de aproximadamente 42 mil toneladas de semilla, que es insuficiente, importándose de otras regiones paperas del país y del extranjero. 27

20 La falta de semilla sana de variedades mexicanas adaptadas a la región y tolerantes a enfermedades obliga a los productores a introducir materiales de dudosa calidad fitosanitaria, incrementando los problemas fitopatológicos en la región. Dada la apertura del Tratado de Libre Comercio de América del Norte (TLCAN), se requiere que la zona papera del noreste cuente con semilla de buena calidad que compita con la semilla que se importa de Estados Unidos y Canadá. La producción de semilla de papa bajo condiciones de invernadero, puede realizarse a partir de plántulas in vitro, microtubérculos (material prenuclear) y minitubérculos, de los cuales, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-041-FITO-2002, se puede obtener de semilla prebásica. El material prenuclear se recomienda establecerlo en camas de invernadero con ambiente controlado para promover el desarrollo de las plantas bajo condiciones de aislamiento. Los requerimientos de este material vegetativo dependen de la capacidad instalada del invernadero, el cual puede estar compuesto por un determinado número de naves, con un número específico de camas, las cuales conforman la superficie útil del invernadero. En los cinco invernaderos comerciales de la zona, el material prenuclear se establece generalmente bajo el mismo diseño de plantación o arreglo topológico, con una distancia de 10 x 10 cm entre plantas e hileras. Considerando dicho esquema de plantación, en una cama de 42 m de largo por 1.25 m de ancho se podrán establecer 5,100 plántulas y/o minitubérculos. Por cada planta establecida se producirán en promedio 3 minitubérculos de semilla prebásica de 28 papa. Este rendimiento fluctuará de acuerdo con el genotipo a utilizar. Metodología para la producción de semilla prebásica Con el propósito de producir semilla prebásica de papa libre de agentes patógenos, a continuación se describe el proceso de producción minitubérculos a partir de material prenuclear. Selección del sustrato La elección del sustrato se basa en sus características de retención de humedad, aereación y permeabilidad, además de asegurar su condición de asepsia. Puede emplearse el peat moss indicado para la germinación de plántulas, o bien utilizar tierra de bosque cribada y desinfectada para darle las condiciones de aereación y retención de humedad al suelo. Esto, para promover un óptimo desarrollo y crecimiento de la planta de papa. El sustrato estéril se extiende en las camas y se humedece al momento del trasplante (Figura 6). Figura 6. Camas en el interior del invernadero antes de ser rellenadas con el sustrato de tierra de bosque cribada. Abajo: proceso de desinfección de la tierra y vista del invernadero una vez rellenadas las camas. 29