Manejo del hongo en el laboratorio

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1 Guía Práctica 3 Colletotrichum lindemuthianum Manejo del hongo en el laboratorio Guillermo Castellanos, Experto en Investigación 2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol Contenido Generalidades 3-2 Procedimientos 3-3 A. Recolección y transporte de las muestras 3-3 B. Preparación del medio de cultivo PDA 3-5 C. Aislamientos de C. lindemuthianum En el medio de cultivo PDA Como aislamiento monospórico 3-9 D. Incremento de C. lindemuthianum Sobre el medio de cultivo PDA Sobre hojas de frijol Sobre vainas de habichuela 3-15 E. Inoculación de las plantas Inóculo para el invernadero Inóculo para aspersión en el campo 3-23 F. Conservación del hongo para almacenamiento Liofilización Conservación en papel filtro a 20 C Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 C 3-34 G. Prueba de almacenamiento 3-36 H. Recuperación del hongo almacenado Conservado en suspensión liofilizada en ampolletas Conservado en papel filtro a 20 C Conservado a 20 C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa 3-39

2 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Generalidades El hongo Colletotrichum lindemuthianum causa la antracnosis del frijol, una enfermedad presente en todo el mundo que produce pérdidas económicas muy graves al productor de frijol. Temperaturas entre 13 y 25 C y una humedad relativa alta favorecen la enfermedad, la cual puede ser devastadora y causar la pérdida completa de la producción de grano (Foto 1) en las variedades susceptibles. Foto 1 3-2

3 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras El hongo Colletotrichum lindemuthianum se aísla de los tejidos vegetales que presenten síntomas típicos de la enfermedad, principalmente del tallo, de las hojas o de las vainas. En las hojas, las lesiones siguen las nervaduras y son muy visibles en el envés (Foto 2). Materiales Toallas de papel Bolsas de papel Rótulos para identificar el material Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de vainas, hojas o tallos) que se colectó se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico. Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su Foto 2 3-3

4 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán el aislamiento del patógeno que se hace partiendo de tejidos de frijol. Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra. Recomendaciones Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en el campo de un agricultor o en una estación experimental. Cuando no haya suficientes rótulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un código y registrar la información completa en una libreta de campo. No recolectar material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse. 3-4

5 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Pasos del proceso Paso 1 Tomar una muestra (o varias) de la parte de la planta enferma (hojas, vainas o tallos) que presente los síntomas causados por el patógeno (ver A. Recolección y ). Paso 2 Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo que corresponda (ver A. Recolección y ). Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del hongo. Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio (ver antes). B. Preparación del medio de cultivo PDA Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para aislar el patógeno. Materiales PDA deshidratado 39 g/litro Agua destilada estéril 1 litro Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2 Cajas petri

6 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Preparación Foto 3 Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno). Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esterilizan en autoclave. Esta máquina, con una presión de 20 libras y una temperatura de 121 C, realiza el proceso total de esterilización en 40 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri, a razón de 20 ml por caja (Foto 5). C. Aislamientos de C. lindemuthianum Foto 4 Foto 5 1. En el medio de cultivo PDA Materiales Cámara de flujo laminar Tijeras Cajas petri, de 60 y 100 mm Agua destilada estéril Hipoclorito de sodio al 2.5% Medio de cultivo PDA (servido en cajas petri) Muestra de tejido infectado, con síntomas típicos de antracnosis 3-6

7 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Toallas de papel Mechero Marcador, punta fina Pinzas Incubadora Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM). Foto 6 Pasos del proceso Paso 1 Cortar trozos pequeños del tejido enfermo de la muestra que presente lesiones típicas y bien desarrolladas, utilizando una tijera estéril (Foto 6). Foto 7 Paso 2 Desinfectar, durante 3 minutos, los trozos de la muestra en una caja petri de 60 mm que contenga suficiente hipoclorito de sodio al 2.5%. Enjuagar luego varias veces los trozos desinfectados con agua destilada estéril, en otra caja petri, vertiendo el agua sobre la muestra con una pipeta estéril (Foto 7). Paso 3 Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel estériles durante 10 minutos para que se sequen (Foto 8). Foto 8 3-7

8 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 4 Cuando las muestras estén secas, tomar los pedazos de tejido con una pinza estéril y sembrarlos en una caja petri (tres por caja) que contenga el medio de cultivo PDA (Foto 9). Hacer lo mismo con las demás muestras. Incubar las cajas a 20 C durante 10 días. Paso 5 Si en la muestra que se sembró en el medio de cultivo había microorganismos contaminantes, el hongo tratará de crecer en un área de la caja petri donde no estén presentes los contaminantes o donde su presencia sea mínima. Purificar entonces el aislamiento del patógeno tomando partes del hongo en esas áreas y transfiriéndolas a una nueva caja petri que tenga medio de cultivo PDA. Foto 9 Paso 6 Pasados los 10 días, el hongo habrá producido acérvulos; estas estructuras reproductivas albergan una gran cantidad de conidias, algunas de las cuales se tomarán para hacer aislamientos monospóricos. 3-8

9 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum 2. Como aislamiento monospórico La pureza genética de un aislamiento de C. lindemuthianum se garantiza si se parte de una sola conidia para hacer el aislamiento. En una muestra de tejido enfermo puede haber una mezcla de cepas del patógeno. A partir del crecimiento en medio de cultivo PDA En este proceso se aplica la metodología indicada en los pasos siguientes: Paso 1 Observar, con un estereoscopio, el tejido enfermo que fue sembrado en el medio de cultivo PDA de una caja petri (Paso 4, anterior). Identificar en él los acérvulos bien desarrollados de color salmón en cuyo interior están los conidióforos y las conidias; éstas son liberadas fácilmente al entrar el agua en contacto con el acérvulo. Paso 2 Tocar, con un alfiler flameado, la masa de conidias del acérvulo elegido, para que varias de ellas queden adheridas a la punta del alfiler. 3-9

10 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 3 Desprender (sobre el medio de cultivo PDA de una caja petri) las conidias del alfiler con la ayuda de una pipeta que tenga agua destilada estéril, de la cual se vierten de 4 a 6 gotas en el alfiler suspendido sobre el medio. Esparcir bien, con un triángulo de vidrio, sobre la superficie del medio, las gotas que llevan las conidias. Esta operación exige el uso de instrumentos estériles; el triángulo de vidrio se debe flamear antes de cada uso para no contaminar el medio. Paso 4 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 C durante 24 horas. Pasado ese tiempo, las conidias empiezan a germinar y estarán listas para ser transferidas individualmente. Paso 5 Enfocar las conidias germinadas con un estereoscopio. Elegir una y sacarla con un alfiler previamente flameado para transferirla a una caja petri que tenga medio de cultivo PDA; incubar luego la caja con la conidia a 20 C. La conidia se desarrolla en ese medio, el cual después de 12 días queda totalmente cubierto por las estructuras del hongo. 3-10

11 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Partiendo de vainas o tallos en cámara húmeda Cuando se recolectan muestras de vainas o tallos enfermos, el aislamiento se lleva a cabo mediante la inducción de la esporulación dentro de una cámara húmeda. Materiales Para configurar una cámara húmeda pequeña: Cajas petri Agua destilada estéril Papel filtro Varilla de vidrio en forma de V Muestra: Tallo o vaina infectados Paso 1 Colocar papel filtro en una caja petri estéril y humedecerlo con el agua destilada. Foto 10 Paso 2 Colocar, sobre el papel húmedo, una varilla de vidrio en forma de V (Foto 10). Colocar sobre ella una vaina o un trozo de tallo infectado (con acérvulos presentes) evitando que el tejido enfermo entre en contacto con el papel humedecido. 3-11

12 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 3 Guardar la caja petri durante 2 días en un lugar oscuro a temperatura ambiente, para que se mantenga la humedad dentro de ella. Paso 4 La vaina o el trozo de tallo enfermo producen acérvulos al estar en un ambiente húmedo. Se hace entonces el aislamiento monospórico directo, como se explicó en el proceso anterior. D. Incremento de C. lindemuthianum 1. Sobre el medio de cultivo PDA Foto 11 Un aislamiento monospórico permite hacer incrementos a partir de una cepa (ver antes). Se toma una caja petri que contenga un aislamiento monospórico bien esporulado, se deposita agua destilada estéril y con la ayuda de una espátula desintegrar los acérvulos para formar una suspensión de conidias, y con una pipeta transferir varias gotas a cada caja para luego esparcirlas con un rastrillo previamente flameado (Foto 11). 3-12

13 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum 2. Sobre hojas de frijol Los aislamientos de C. lindemuthianum crecen sobre PDA, pero algunos no esporulan lo suficiente en ese medio; en tales casos, el patógeno se incrementa sobre hojas de fríjol esterilizadas. Tanto los primeros aislamientos como los segundos han sido observados e identificados previamente; por tanto, el laboratorio asigna a cada uno de ellos el proceso de incremento que le corresponda. Preparación de las hojas Las hojas de fríjol escogidas que no deben haber recibido aplicaciones de fungicidas se esterilizan en autoclave. Se eligen solamente hojas maduras de cerca de 30 días de edad y de tamaño mediano, porque las hojas jóvenes se desintegran en el autoclave. Se colocan en cajas petri grandes con el envés hacia arriba y se rocían con un poco de agua destilada. Las cajas petri se envuelven en papel aluminio y luego en papel de envolver, y se llevan al autoclave. Materiales Aislamientos del hongo sobre el medio de cultivo PDA (10 días de crecimiento) Agua destilada estéril Cajas petri Pipeta con chupo Asa de vidrio y pinzas 3-13

14 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Medio de cultivo PDA Hojas de frijol sanas, libres de fungicidas y esterailizadas Pasos del proceso Foto 12 Paso 1 Colocar, con una pinza estéril, una hoja de frijol estéril (de la caja petri grande) sobre el medio de cultivo PDA contenido en una caja petri mediana (Foto 12). Paso 2 Agregar agua destilada estéril con la pipeta (presionando el chupo) al aislamiento monospórico (Foto 13), y raspar con una espátula la superficie del medio de cultivo (en la caja petri) para obtener así una suspensión de conidias de C. lindemuthianum. Foto 13 Paso 3 Tomar varias gotas de la suspensión del hongo que se obtuvo en el paso anterior y depositarlas en las hojas de frijol colocadas sobre el medio de cultivo (Foto 14). Esparcir, con el asa de vidrio previamente flameada, la suspensión sobre toda el área de la hoja. Foto

15 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Paso 4 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 C durante 12 días. Pasado este tiempo, el hongo habrá crecido y se observará una producción abundante de acérvulos. La Foto 15 presenta un aislamiento de C. lindemuthianum incrementado en hojas de fríjol; se observa la esporulación color salmón sobre las hojas. 3. Sobre vainas de habichuela El hongo C. lindemuthianum se incrementa sobre vainas de habichuela cuando se programa una inoculación de plantas en el campo; se debe preparar, por tanto, un volumen grande de suspensión del inóculo. Nota: Este método de incremento requiere de aislamientos del hongo en el medio de cultivo PDA ya esporulados. Foto

16 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Materiales Aislamiento del hongo sobre medio de cultivo PDA, esporulado Vainas de habichuela sanas Agua destilada estéril Frascos erlenmeyer de 250 ml Algodón estéril Papel aluminio Papel kraft Bandas de caucho Pipeta pasteur Cuchillo Marcador, punta fina Foto 16 Pasos del proceso Paso 1 Lavar con agua corriente las vainas de habichuela para eliminar residuos de productos agroquímicos y otros contaminantes posibles (Foto 16). Paso 2 Cortar las vainas de habichuela en trozos de 3 cm de longitud (Foto 17). Foto

17 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Paso 3 Llenar los frascos erlenmeyer con los trozos de habichuela hasta el inicio del cuello (Foto 18). Colocar en la boca de cada erlenmeyer un tapón de algodón (Foto 19), cubrirla con papel aluminio y con papel de envolver (papel kraft), y ajustar todo el recubrimiento con un banda de caucho (Foto 20). El tapón de algodón es una pieza clave en este proceso de incremento; debe estar muy bien armado y debe ajustar bien contra el cuello del frasco para que no se desarme más adelante al manipularlo. El tapón del recipiente sirve para mantener su contenido estéril. Paso 4 Esterilizar dos veces en el autoclave los trozos de habichuela contenidos en los frascos erlenmeyer. Paso 5 Esperar hasta que los frascos erlenmeyer se enfríen y retirar de ellos el agua que liberan los trozos de habichuela en la esterilización (Foto 21). Todo el proceso se lleva a cabo en una cámara de flujo laminar. Foto 18 Foto 19 Foto Foto 21

18 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 6 Tomar las cajas petri que contienen el aislamiento esporulado, agregarles agua destilada estéril y raspar con una espátula los acérvulos de la superficie del medio para hacer una suspensión de conidias (Foto 22). Foto 22 Paso 7 Agregar la suspensión anterior a los trozos de vaina de habichuela esterilizados. Esta operación consta de los siguientes pasos: Tomar la pipeta pasteur con la mano derecha y llenarla con la suspensión de conidias (cerca de 2 ml). Retirar (con la mano izquierda y sin soltar la pipeta) los papeles que tapan el erlenmeyer, quitar el tapón de algodón y sostenerlo con los dedos de esa mano. Depositar la suspensión contenida en la pipeta dentro del erlenmeyer y sobre los trozos de habichuela (Foto 23). Tapar el frasco erlenmeyer con el tapón de algodón. Foto 23 El buen resultado de este paso depende de que el tapón de algodón haya sido muy bien armado (Paso 3) y no se desbarate cuando se destape el frasco. Si el tapón se deshace al manipularlo, el laboratorista no podrá tocarlo con la mano para recuperarlo porque lo contamina; si no dispone de un tapón estéril de repuesto, debe usar la pinza para 3-18

19 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum sujetar el tapón deshecho e introducirlo hábilmente en el cuello del frasco erlenmeyer tapándolo de nuevo, de manera que el tapón quede tan ajustado como sea posible. Sellar luego el erlenmeyer con el capuchón de papel aluminio y de papel de envolver y ajustar alrededor de él la banda de caucho. Marcar luego el frasco erlenmeyer con el número del aislamiento. Paso 8 Golpear suavemente contra una mano cada frasco erlenmeyer para que la suspensión de conidias del hongo cubra todos los trozos de vaina de habichuela. Evitar que la suspensión entre en contacto con el algodón del tapón (Foto 24); si lo hiciera, se reduciría el número de propágulos sobre el sustrato de multiplicación. Paso 9 Llevar todos los frascos erlenmeyer a incubación a 20 C durante 9 días. Pasado este tiempo, el hongo habrá esporulado en los trozos de vaina de habichuela y estará listo para preparar el inóculo que se llevará al campo. Foto

20 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol E. Inoculación de las plantas 1. Inóculo para el invernadero Foto 25 Foto 26 Paso 1 Incrementar el hongo 12 días antes de la inoculación según el número de plantas que se quiere inocular. Calcular el número aproximado de cajas petri (con medio de cultivo PDA) que se necesitan y en ellas sembrar el hongo. Una caja petri bien esporulada produce aproximadamente 300 ml, que alcanzará para 3 bandejas. Este cálculo depende de las características del aislamiento, ya que no todos los aislamientos de este hongo esporulan de la misma manera. Paso 2 Agregar agua destilada estéril a los incrementos del hongo en las cajas petri del paso anterior, y raspar luego la superficie del medio con una espátula estéril para desprender las conidias (Foto 25). Obtenida así la suspensión de conidias, filtrarla en una gasa estéril para separar las partículas como restos de agar y micelio, y recoger en un vaso estéril mediano (o en una caja petri estéril grande) el filtrado con las conidias (Foto 26). La separación de estas partículas sólidas tiene dos objetivos: facilitar el conteo de las conidias y evitar que se tapone la boquilla del aspersor DeVilbiss (designado aquí por su marca) que se emplea, junto 3-20

21 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum con un compresor, para aplicar el inóculo sobre las plantas. En lugar del DeVilbiss se puede usar un aerógrafo o un atomizador de líquidos. Paso 3 Contar, empleando el microscopio, las conidias observadas en la cuadrícula central del hemacitómetro (los cuatro cuadros de las esquinas y el cuadro central). El número de conidias contadas se multiplica por La concentración que debe tener (en este caso) el inóculo del patógeno es de 1.2 x 10 6 conidias/ml. Entonces, dado un volumen final del inóculo que se asperjará y dada la concentración de conidias del inóculo original, se utiliza la siguiente fórmula para hallar el volumen de este inóculo original que se necesita para preparar el de la aspersión: V 1 x C 1 = V 2 x C 2 Ejemplo Se contaron 150 conidias en el hemacitómetro. Por tanto, 150 x = = 7.5 x 10 6 (conidias en 1 ml) Ésta es la concentración del inóculo original (el filtrado del Paso 2). Ahora bien, si se necesitan 250 ml de un inóculo que tenga una concentración de 1.2 x 10 6 (conidias/ml) se sustituyen esos datos en la fórmula anterior y se halla el valor del volumen 3-21

22 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol (V 1 ) del inóculo original o inicial que se toma para preparar el que ahora se necesita: V 1 x 7.5 x 10 6 = 250 ml x 1.2 x 10 6 Foto 27 Por tanto, V 1 = 250 ml x 1.2 x 106 = 40 ml 7.5 x 10 6 Se toman entonces 40 ml del inóculo inicial y se completan hasta 250 ml con agua destilada estéril para obtener la concentración final deseada. Foto 28 Paso 4 Obtenida la concentración requerida del inóculo final, verter un volumen de esta suspensión en un frasco erlenmeyer de 250 ml, que se conecta luego a un DeVilbiss (o a un aerógrafo) y éste a un compresor (Foto 27) para hacer la inoculación por aspersión. Se inoculan plántulas de 8 días de edad (Foto 28). Paso 5 Llevar las plantas asperjadas a una cámara húmeda cuya humedad relativa sea mayor que 90% (Foto 29), dejarlas allí y evaluarlas 8 días después. Para hacer la evaluación se aplica la escala estándar del CIAT, cuyas categorías van del 1 al 9 y se distribuyen así: Foto 29 de 1 a 3: planta resistente de 4 a 6: planta de reacción intermedia de 7 a 9: planta susceptible 3-22

23 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum 2. Inóculo para aspersión en el campo Materiales Incrementos de C. lindemuthianum en trozos de habichuela Licuadora industrial Recipiente grande Agua corriente Embudo mediano Hemacitómetro Para preparar el inóculo con que se asperjará 1 hectárea de cultivo de frijol en el campo, se requieren los siguientes materiales: 16 kg de trozos de habichuela que tengan el hongo bien esporulado 120 litros de agua Pasos del proceso Paso 1 En el recipiente de la licuadora industrial, verter agua corriente y trasladar a él (con ayuda de una espátula) los trozos de habichuela con el incremento del patógeno que se conservaron en frascos erlenmeyer. El volumen de la suspensión de inoculación para el campo es mucho mayor que el que se prepara para el invernadero. 3-23

24 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 2 Licuar el contenido del recipiente (habichuelas colonizadas por el hongo) hasta obtener un producto homogéneo y verterlo, utilizando un embudo, en un recipiente fácil de manipular (Foto 30). Paso 3 Leer, en un hemacitómetro, la concentración de conidias del inóculo en el producto licuado. Calcular luego el volumen de solución final del inóculo según el área de cultivo que se quiere inocular, y ajustar la concentración final del inóculo. Paso 4 Las inoculaciones con este patógeno deben hacerse siempre al caer la tarde, cuando la temperatura va en descenso y la humedad relativa aumenta. La inoculación se hace con una bomba de espalda con motor. Foto

25 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum F. Conservación del hongo para almacenamiento Para conservar el hongo C. lindemuthianum se emplean tres métodos: la liofilización, el papel filtro en trozos guardados en sobres, y el papel filtro impregnado con una suspensión del hongo en solución de peptona-sucrosa. 1. Liofilización Es el método más confiable para conservar microorganismos en almacenamiento. Materiales Liofilizador Ampolletas para liofilizar de cristal neutro ( neutral glass ) de 0.5 ml Pipetas pasteur largas Tijeras y algodón Incremento del hongo, en medio de cultivo PDA Peptona al 10% Sucrosa al 20% (Foto 31) Foto 31 Nota: Los aislamientos deben prepararse 12 días antes de empezar el proceso de liofilización (ver D. Incremento de ). 3-25

26 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Pasos del proceso Foto 32 Paso 1 Escribir o marcar en papel filtro la identificación de los aislamientos que se van a liofilizar. La identificación incluye el nombre científico del hongo, el número del aislamiento (código empleado por cada laboratorio), la fecha en que se almacena el hongo. Esta información se escribe con letra pequeña en áreas reducidas del papel (1 a 2 cm 2 ). Paso 2 Cortar, con una tijera estéril, los trozos de papel filtro con la identificación del hongo e introducir uno en cada ampolleta hasta el fondo. Foto 33 Foto 34 Preparar luego el tapón de algodón con que se tapa la ampolleta, de modo que cubra, más o menos, los dos tercios superiores de la ampolleta. Extender un trozo de algodón hasta que tenga unos 5 x 3 cm y enrollarlo sobre una pinza (o la parte delgada de un asa), presionando con los dedos hasta formar el tapón sobre ese extremo del asa (Fotos 32, 33 y 34). Dejar un poco de algodón sin enrollar en el lado opuesto del tapón. Introducir el tapón en la ampolleta y retirar la pinza (o el asa) suavemente con una mano, mientras se sostiene el tapón dentro de la ampolleta con la otra. Preparar ampolletas adicionales con sus respectivos tapones para tener más tapones 3-26

27 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum en caso de que se necesiten. Si un tapón se desintegra al ser manipulado, es necesario remplazarlo con uno que esté esterilizado en las ampolletas adicionales. Paso 3 Llevar este material (ampolletas con sus tapones), junto con las pipetas, al autoclave para esterilizarlos. Paso 4 Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solución de sucrosa (o de dextrosa) al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solución homogénea de peptona-sucrosa. Paso 5 Con una pipeta pasteur larga, succionar de 2 a 3 ml de la mezcla peptona-sucrosa (ver Paso 4) y verterlos sobre el cultivo del hongo. Obtener luego un homogenizado con el hongo y la solución de peptona-sucrosa, haciendo primero un raspado del cultivo y luego succiones y expulsiones sucesivas del homogenizado con la pipeta sobre el medio; se emplea una sola pipeta en toda la operación (Foto 35). Foto

28 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 6 Tomar, con la misma pipeta pasteur, unas gotas (2-3 ml) de esa suspensión del hongo y depositarlas en el interior de la ampolleta siguiendo los pasos siguientes: Tomar con una mano la pipeta pasteur y con la otra la ampolleta con su respectivo tapón (preparada en el Paso 2). Tomar la pipeta pasteur con los dedos índice y pulgar, y con el meñique de la misma mano sujetar el extremo libre del tapón de algodón de la ampolleta contra el borde interior de la mano, retirarlo cuidadosamente de la ampolleta y mantenerlo sujeto firmemente en el sitio indicado. Verter enseguida la suspensión del hongo en el fondo de la ampolleta sobre el papel filtro que lleva la identificación del aislamiento. Tapar luego la ampolleta introduciendo suavemente en ella el tapón, tal como se mantenía sostenido entre el meñique y la palma de la mano (ver antes). Si el algodón del tapón entra en contacto con otra superficie o con alguna sustancia, se contamina, por lo que se debe desechar y remplazar con uno de los que se habían preparado (ver Paso 2) para estos casos. 3-28

29 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Paso 7 Cortar, con una tijera flameada, la parte del tapón que quedó por fuera de la ampolleta (Foto 36). Introducir finalmente en la ampolleta el resto del tapón de algodón empleando la punta de la tijera, hasta dejar 1 cm entre el borde de la ampolleta y el tapón (Foto 37). Paso 8 Colocar las ampolletas verticalmente en una gradilla. Empujar luego el algodón hacia el fondo de cada una hasta que toque el trocito de papel filtro que lleva la identificación del hongo; para ello se utiliza un objeto alargado (como la parte superior de un asa), el cual se flamea constantemente para evitar que se contaminen los tapones (Foto 38). La parte superior de la ampolleta, que no contiene algodón, se sellará después del proceso de liofilización (Paso 13). Foto 36 Foto 37 Paso 9 Una vez organizadas las ampolletas, llevarlas a un congelador a 0 C durante 15 minutos. Cuando las muestras se hayan congelado, se inicia el proceso de liofilización. Foto

30 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Foto 39 Foto 40 Foto 41 Foto 42 Paso 10 Colocar la gradilla en la campana del liofilizador y encenderlo (Foto 39). El aparato hace descender en su interior la temperatura hasta 55 o C e inicia un proceso de secamiento en que extrae el agua de la muestra mediante una bomba de vacío. Este proceso tarda entre 20 y 22 horas. Paso 11 Al día siguiente, apagar el liofilizador y retirar de él la gradilla con las ampolletas. Preparar luego una pistola de gas propano y proceder al estiramiento de las ampolletas en la parte opuesta a aquella en que está la muestra, es decir, hacer un cuello en cada una ablandando el vidrio con la llama y estirando la ampolleta por sus extremos (Fotos 40 y 41). El procedimiento requiere mucha precaución para evitar quemaduras en las manos por la llama. El objetivo de este paso es reducir el espacio por donde puede entrar aire (con humedad) a la muestra, antes de sellarla completamente. Paso 12 Una vez estiradas todas las ampolletas, colocarlas en el árbol del liofilizador insertando el extremo abierto de cada una en los soportes del árbol. De esta manera, el extremo que contiene la muestra quedará más visible (Foto 42). Repetir el proceso de secamiento en el liofilizador durante 1 hora, aproximadamente, para eliminar la humedad que pudo haber entrado a la muestra durante el Paso

31 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Paso 13 Sin apagar el liofilizador, sellar al vacío las ampolletas, una por una, empleando la pistola de gas propano, derritiendo el vidrio con la llama donde se hizo el cuello o estiramiento (Foto 43). Una vez selladas, finaliza el proceso de liofilización. En caso de que se pierda el vacío al estar sellando una ampolleta, retirar esta parte de la ampolleta, remplazarla por una nueva y esperar que el vacío llegue al punto indicado para poder continuar con el sellado de las otras ampolletas. La duración de una muestra en almacenamiento conservada mediante el proceso de liofilización no se ha establecido formalmente; sin embargo, en nuestro laboratorio se han recuperado muestras liofilizadas que permanecieron almacenadas durante 30 años. La liofilización de muestras microbiológicas tiene, no obstante, una desventaja: para recuperar una muestra hay que romper toda la ampolleta y, por consiguiente, es necesario tener varias copias de cada una de las muestras liofilizadas para poder mantener adecuadamente una colección. Foto

32 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol 2. Conservación en papel filtro a 20 o C Este método permite conservar microorganismos durante períodos largos de tiempo. Materiales Papel filtro estéril, cortado en trozos pequeños Incremento de C. lindemuthianum Pinzas Cajas petri estériles Agua destilada estéril Pipeta Sobres de papel mantequilla Pasos del proceso Paso 1 Cortar cuadritos (60-80) de papel filtro de 1 cm 2, colocarlos dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterilizarlos en autoclave. Paso 2 Colocar 10 cuadritos de papel filtro esterilizado sobre el medio de cultivo PDA en cada caja petri. 3-32

33 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Paso 3 Preparar una suspensión de conidias y micelio de un aislamiento del hongo, de la siguiente manera: Agregar agua destilada estéril sobre el aislamiento desarrollado en la caja petri. Raspar luego la superficie del aislamiento con la punta de la pipeta hasta que se logre la suspensión. Tomar un poco de esa suspensión con la pipeta y colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2). Paso 4 Incubar las cajas a 20 C durante 12 días. Paso 5 Pasados los 12 días, retirar los cuadritos de papel filtro de las cajas petri de incubación con una pinza estéril y, cumpliendo con todas las condiciones de asepsia, depositarlos en una caja petri estéril vacía. Colocarlos invertidos (la cara en que está el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. Secar los cuadritos de papel filtro durante 7 días a 24 C. 3-33

34 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 6 Pasar los cuadritos secos (con una pinza flameada) a bolsitas de papel mantequilla estéril, las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa más grande del mismo material (o en una cajilla adecuada), para almacenarlos (ver Fotos 47 y 48). Esta última bolsa, en la que se coloca toda la información referente al hongo C. lindemuthianum, se almacena a 20 C. 3. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 o C La conservación de un patógeno suspendido en solución de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa) que se deposita en papel filtro es, después de la liofilización, uno de los métodos más efectivos para almacenarlo. Materiales Foto 44 Peptona al 10% Sucrosa al 20% Cajas petri Papel filtro Pinza Espátula Pipetas (Foto 44) 3-34

35 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa (o dextrosa) Ver F., 1. Liofilización, Paso 4. Pasos del proceso Paso 1 Tomar una caja petri que contenga un aislamiento esporulado del hongo y agregarle 2 ml de la solución de peptona-sucrosa (Foto 45). Paso 2 Raspar, con una espátula estéril o con la misma pipeta con que se agregó la solución, la superficie del aislamiento contenido en la caja petri para desprender las conidias del hongo. De este modo se obtiene una suspensión de conidias. Foto 45 Paso 3 Depositar, con una pinza estéril, 20 cuadritos de papel filtro en la caja petri del Paso 2 e impregnarlos con la suspensión del hongo en la solución de peptona-sucrosa (Foto 46). Paso 4 Retirar los cuadritos de papel filtro de esa caja petri con una pinza estéril y colocarlos en una caja petri estéril que tenga papel filtro en el fondo, para que se sequen a 24 C durante 7 días. Foto

36 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 5 Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos en sobres estériles de papel mantequilla (Foto 47) para almacenarlos a 20 C, escribiendo en ellos la información referente al hongo, como fecha de almacenamiento, nombre de la cepa, etc. (Foto 48). G. Prueba de almacenamiento Esta prueba es la forma clara, práctica y confiable de garantizar que el hongo secado por 7 días está libre de contaminantes, viable y que puede ser almacenado. Foto 47 Pasos del proceso Paso 1 Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que había sido impregnado con la suspensión del hongo y que fue secado por 7 días a 24 C. Paso 2 Sembrar el cuadrito en medio de cultivo PDA. Después de 5 días, el patógeno debe haber crecido en este medio de cultivo. Foto 48 Paso 3 Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes, como otros hongos o bacterias, tanto la muestra observada como los demás cuadritos de papel filtro deberán desecharse, y se repetirá entonces el proceso de conservación. 3-36

37 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum H. Recuperación del hongo almacenado 1. Conservado en suspensión liofilizada en ampolletas Materiales Ampolletas con el hongo liofilizado Solución de peptona al 10% Solución de sucrosa al 20% Cajas petri con medio de cultivo PDA Pipeta con chupo Mazo (de mortero) Servilleta estéril Pinza (Foto 49) Foto 49 Pasos del proceso Paso 1 Romper la ampolleta que contiene el hongo golpeándola con un mazo (Foto 50) por el extremo opuesto a aquél en que está el hongo liofilizado (la servilleta sirve para amortiguar el golpe y la rotura del vidrio). Retirar con la pinza el algodón que está dentro de la ampolleta (Foto 51). Foto Foto 51

38 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 2 Depositar con la pipeta, en la mitad abierta de la ampolleta, cuatro gotas de la solución de peptonasucrosa (Ver F., 1. Liofilización, Paso 4). Las células liofilizadas del hongo quedan así suspendidas en la solución y pueden retirarse de la ampolleta (Foto 52). Foto 52 Paso 3 Transferir la suspensión del hongo de la ampolleta a una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA, para reiniciar el proceso de crecimiento del hongo (Foto 53). 2. Conservado en papel filtro a 20 o C Pasos del proceso Foto 53 Paso 1 Trasladar, con una pinza estéril, uno de los cuadritos de papel filtro que portan el hongo que habían sido almacenados en bolsitas a 20 C (ver F., 2. Conservación en..., Paso 6) a una caja petri (Foto 54) que contenga el medio de cultivo PDA. Foto

39 Guía Práctica 3: Colletotrichum lindemuthianum Paso 2 Depositar 1 o 2 gotas de la solución de peptonasucrosa en los cuadritos de papel filtro que contienen el hongo; así se hidrata el hongo y podrá ser esparcido sobre toda la superficie del medio (Foto 55), usando la punta de la pipeta. De esta manera se aumenta el campo de crecimiento del hongo. Paso 3 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 C. El desarrollo del hongo se reactivará y después de 12 días estará listo para ser usado en los procesos que se realizarán más adelante. 3. Conservado a 20 o C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa Pasos del proceso Paso 1 Sacar de los sobres de papel mantequilla (ver F., 3. Conservación..., Paso 5, Foto 48) de 1 a 2 trocitos de papel filtro que portan el hongo almacenado en suspensión de peptona-sucrosa, y sembrarlos en el medio de cultivo PDA contenido en las cajas petri. Foto 55 Paso 2 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 C. Después de 2 o 3 días se puede ver el crecimiento del hongo. A los 8 días después de la incubación, el hongo estará listo para ser incrementado. 3-39

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