UNIVERSIDAD DE MAYORES PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA MICROBIOLOGÍA I

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1 UNIVERSIDAD DE MAYORES PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA MICROBIOLOGÍA I DRAS. MARÍA LUISA ORTIZ Y ANA PEDREGOSA 1

2 PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA I MICROBIOLOGÍA I I) PRIMER DÍA DE PRÁCTICAS En cada taquilla se dispone de dos microorganismos, crecidos en tubos con medio agar nutritivo, que se utilizarán en el desarrollo de las prácticas: Bacteria Gram - : Escherichia coli Bacteria Gram+: Staphylococcus aureus I.1.- Resiembra de bacterias en tubo de agar inclinado. Los microorganismos se deben de mantener de forma adecuada en el laboratorio para poder utilizarlos cuando se requiera. Los microorganismos se pueden conservar en diversos medios de cultivo contenidos en tubos o placas; sin embargo, es necesario realizar cada cierto tiempo su resiembra en medio nuevo. En esta práctica se va a llevar a cabo la resiembra de dos microorganismos por taquilla (Escherichia coli y Staphylococcus aureus); cada uno se inoculará en un tubo con medio agar nutritivo nuevo. Procedimiento a seguir: Se toma el asa de siembra y se esteriliza a la llama del mechero, hasta que se pone al rojo. Se destapa el tubo que contiene el microorganismo, tomando el tapón con el dedo meñique de la mano derecha. Se esteriliza la boca del tubo pasándolo ligeramente por la llama del mechero. Se introduce el asa, se roza suavemente la superficie del cultivo, y se saca el asa con cuidado para no tocar las paredes del tubo. Se esteriliza la boca del tubo y se cierra. Se abre el tubo que contiene el medio nuevo y se esteriliza la boca en la llama del mechero. Se introduce el asa de siembra (que contiene una muestra del microorganismo) hasta el fondo del tubo. Al sacar de nuevo el asa se avanza en zig-zag sobre la superficie del medio sólido. Se flamea la boca del tubo antes de cerrarlo de nuevo y el asa de siembra se esteriliza a la llama del mechero. Los tubos inoculados se incuban en una estufa a 371C durante 24 horas, escribiendo el nombre del microorganismo resembrado en el tubo nuevo. I.2.- Inoculación de microorganismos en medios selectivos y diferenciales: Inoculación mediante siembra en placa por agotamiento. En Microbiología se pueden utilizar diferentes medios de cultivo para el crecimiento de los microorganismos. Los medios generales son aquellos que permiten el crecimiento indiscriminado de gran número de microorganismos (el agar nutritivo es un medio general). Los medios selectivos favorecen el crecimiento de unos 2

3 microorganismos frente a otros. Los medios diferenciales permiten diferenciar o distinguir a algunos microorganismos según el crecimiento que tengan en estos medios. En esta práctica vamos a observar el crecimiento de microorganismos en varios medios selectivos y diferenciales. Los microorganismos usados son: Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Los medios son agar Levine y manitol salado. Se dispone de una placa Petri de cada uno de estos medios. Se inoculará Escherichia en agar Levine y Staphylococcus en Manitol Salado. La inoculación se realizará según el procedimiento de siembra en estría en superficie de una placa, según se indica: Se parte del tubo con el microorganismo; el tubo se destapa, se flamea la boca y con el asa de siembra se toma una muestra. Se lleva el asa de siembra a una placa con el medio sólido correspondiente. Se desliza el asa suavemente sobre la superficie del medio, dibujando varias líneas paralelas próximas (estrías) en un borde de la placa. Esterilizar de nuevo el asa de siembra, dejándola enfriar. Repetir dos veces la operación anterior, haciendo nuevas estrías en ángulo con las precedentes. Incubar en la estufa de cultivo a 371C durante 24 horas, colocando la placa Petri en posición invertida. Este tipo de siembra recibe el nombre de Asiembra por porque el número de microorganismos que se inocula en cada dirección es cada vez mas pequeño. Mediante este procedimiento, en algún sitio de la placa aparecerán colonias aisladas de los microorganismos inoculados. Este método de siembra nos permite obtener cultivos puros de los mismos (un cultivo puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo). A continuación se indican algunos aspectos de la composición de los medios que determinan el diferente crecimiento de los microorganismos en ellos. Agar levine o EMB. Fundamento. Este medio contiene colorantes (azul de metileno y eosina), que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram+. El medio contiene lactosa como fuente de carbono, que es usada por diversas enterobacterias con producción de ácido. Crecimiento de microorganismos en el medio: Escherichia coli crecerá en el medio al ser un microorganismo Gram-. Al fermentar lactosa, produce una acidificación muy intensa del medio; por ello, los colorantes precipitan originando colonias de color oscuro con tono verde metálico brillante característico. Manitol salado Fundamento: Este medio contiene una elevada concentración de cloruro sódico, lo que permite el crecimiento sólo de microorganismos tolerantes a ella, entre los que se encuentran los pertenecientes al género Staphylococcus. Además, el medio contiene como fuente de carbono manitol, que es utilizado por los microorganismos produciendo ácido que ocasiona un viraje del colorante rojo de fenol que contiene el 3

4 medio, que cambia a amarillo. Crecimiento de microorganismos: En manitol salado tienen que crecer sólo estafilococos, formando colonias pequeñas amarillas rodeadas de un halo amarillo. I.3.- Observación del crecimiento de microorganismos presentes en los dedos La superficie de la piel está colonizada por diferentes microorganismos, cuya presencia se va a detectar en esta práctica. En cada taquilla se dispone de dos placas Petri con medio agar nutritivo. Cada alumno presionará suavemente con los dedos de una mano sobre la superficie del medio de una placa. Incubar a 371C con la placa en posición invertida. II) SEGUNDO DÍA DE PRÁCTICAS II.1.- Tinción de bacterias. Observación de microorganismos presentes en el yogur mediante tinción simple con azul de metileno. La observación de los microorganismos al microscopio óptico se facilita con la realización de diferentes tinciones. La tinción simple de denomina así porque emplea un sólo colorante. Se llevará a cabo la tinción simple de yogur para observar los microorganismos presentes en el mismo. En la producción de yogur se utilizan, en general, los microorganismos Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus lactis (actualmente denominado Lactococcus lactis). Procedimiento de tinción: Método de Loeffler. - Con el asa de siembra estéril se toma una muestra del yogur. - Se coloca la muestra en un portaobjetos, extendiéndola sobre su superficie. - Fijar la preparación calentando el porta muy ligeramente sobre la llama del mechero hasta que esté seco (un exceso de calor podría destruir las bacterias). - Se realiza una tinción simple con azul de metileno, cubriendo la preparación con el colorante durante 5 minutos. - Lavar con agua destilada. - Secar la preparación al aire. - Observar al microscopio óptico. Las bacterias aparecen teñidas de color azul. Los lactobacilos se observan como bacilos muy alargados y los estreptococos como cocos que forman cadenas. II.2.- Tinción de bacterias. Tinción de Gram. La tinción de Gram es una tinción diferencial. En ella se emplean dos colorantes. Sirve para diferenciar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, lo que es debido a la diferente estructura de su pared celular. Se llevará a cabo la tinción de dos bacterias: Staphylococcus aureus y Escherichia coli, que son microorganismos Gram+ y Gram-, respectivamente. 4

5 Procedimiento: - Con el asa de siembra estéril se toma una muestra del cultivo bacteriano, rozando suavemente el extremo del asa en la superficie del cultivo. - Se coloca una gota de agua en un portaobjetos y sobre ella se deposita el microorganismo, extendiendo la suspensión de bacterias sobre la superficie del porta. - Fijar la preparación calentando el porta muy ligeramente sobre la llama del mechero hasta que esté seco (un exceso de calor podría destruir las bacterias). - Cubrir la preparación con el colorante cristal violeta (colorante primario) durante 2 minutos. Lavar con agua. - Escurrir el exceso de colorante y aplicar una solución de lugol durante 1 minuto. - Decolorar con alcohol de 961 hasta que no salga mas colorante. Lavar con agua. - Aplicar safranina (colorante de contraste) durante 1 minuto. - Lavar con agua, secar al aire y observar la preparación con el objetivo de inmersión del microscopio óptico. Las bacterias Gram positivas aparecen coloreadas en violeta y las Gram negativas presentan una coloración rojiza. II.3.- Observación de la resiembra en tubo de agar inclinado. Se observará si se ha producido crecimiento de los microorganismos inoculados en la superficie del agar inclinado. II.4.- Observación del crecimiento de los microorganismos en medios selectivos y diferenciales. Para la observación del crecimiento de los microorganismos inoculados el día anterior en diferentes medios selectivos y diferenciales, consultar el apartado I.2. III) TERCER DÍA DE PRÁCTICAS III.1.- Observación del crecimiento de microorganismos presentes en los dedos Se observará la placa de agar nutritivo para determinar si se ha producido desarrollo de colonias correspondientes a los microorganismos presentes en los dedos. III.2.- Observación de otros microorganismos (hongos filamentosos y levaduras) Se llevará a cabo la observación en fresco de hongos mediante tinción con azul de lactofenol, siguiendo el siguiente procedimiento: Se deposita una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos. Se toma una muestra del cultivo del microorganismo a observar con el asa de siembra estéril y se resuspende sobre el colorante. Se coloca un cubreobjetos encima y se observa al microscopio. 5

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