Estudio de un brote. Caracterización de cepas

Transcripción

1 Estudio de un brote. Caracterización de cepas La investigación microbiológica con fines epidemiológicos requiere de métodos de tipificación de cepas. Estos métodos son capaces de discriminar entre cepas pertenecientes a una misma especie bacteriana en diferentes líneas clonales, es decir grupos de bacterias originados a partir de un mismo clon inicial. Basándonos en esta definición de clon bacteriano, distintos aislamientos bacterianos provenientes de diferentes momentos y localizaciones que presentan resultados idénticos por un numero de métodos diferentes de tipificación, muy probablemente pertenecen a una misma línea clonal. La clonalidad según esta definición implica la alta probabilidad de que dos aislamientos estén relacionados, siendo la confianza de esta probabilidad cada vez mayor cuantos mas métodos de tipificación sean utilizados. Es por esto deseable en investigación epidemiológica utilizar una variedad de métodos de tipificación. Principios de tipificación bacteriana. Un método de tipificación es aquel que puede ser usado para diferenciar cepas bacterianas pertenecientes a una misma especie. La esencia del uso de estos métodos es la de ser capaz de comparar aislamientos y agrupar cepas con idénticos resultados en un mismo grupo. Cuando dos aislamientos estudiados rinden resultados diferentes según uno o mas métodos de tipificación, en general puede concluirse que derivan de diferentes líneas clonales. Sin embargo, para poder ubicar distintos aislamientos en una misma línea clonal se requieren resultados coincidentes en más de un método de tipificación. La obtención de conclusiones epidemiológicamente válidas se facilita si existe un conocimiento de la distribución de tipos relevantes en un área geográfica determinada, que permitan sentar las bases para establecer cuáles resultados de tipificación pueden ser comparados. Los métodos de tipificación deben cumplir tres requisitos esenciales: 1) poder de tipificación (ser capaces de catalogar cualquier aislamiento en un tipo determinado); 2) Poder discriminatorio (ser capaces de discriminar entre aislamientos no relacionados); 3) reproducibilidad (ser capaces de brindar resultados reproducibles entre diferentes ensayos y estables para una cepa dada obtenida de diferentes orígenes). A la hora de evaluar un método de tipificación, además de considerar estos requisitos, se considera también la sencillez de realización y de interpretación de resultados. Los métodos de tipificación caen en dos amplias categorías: fenotípicos y genotípicos. Los primeros son aquellos que caracterizan los productos de la expresión génica para diferenciar cepas, estudiando propiedades bioquímicas, 190

2 antigénicas, sensibilidad a fagos, a antimicrobianos, etc. Estas propiedades, tienen tendencia a variar con las condiciones de cultivo, fase de crecimiento, ocurrencia de mutaciones espontáneas etc., debido a que son el resultado de la expresión génica. Por otra parte, los métodos genotípicos son aquellos basados en el análisis de la estructura genética de un organismo, e incluyen polimorfismos en los patrones de restricción del DNA por endonucleasas, perfiles de amplificación génica y perfiles plasmídicos. Estos métodos están menos sujetos a variación natural, aunque pueden afectarse por inserciones o deleciones de DNA en el cromosoma, ganancia o pérdida de DNA extracromosómico o mutaciones aleatorias que puedan crear o eliminar por ejemplo sitios de restricción. En general, los métodos fenotípicos tienen un poder de tipificación limitado, debido a que cada uno es aplicable a un número reducido de especies bacterianas (ej. serotipificación, fagotipificación), mientras que los métodos genotípicos son en general aplicables a cualquier taxón bacteriano. La reproducibilidad de una técnica, puede verse afectada tanto por variaciones en el método como por variaciones biológicas, que son mas fácilmente detectables en el caso de los métodos fenotípicos. Con el tiempo (de semanas a años dependiendo de la cepa), los patrones de tipificación producidos con métodos basados en DNA presentan en algunos casos variaciones menores, por lo que a la hora de analizar los resultados es importante considerar el tiempo transcurrido desde su aislamiento. La principal ventaja de los métodos genotípicos respecto a los tradicionales es su capacidad discriminatoria, logrando en muchos casos diferenciar entre cepas absolutamente idénticas en términos fenotípicos. La sencillez de realización, incluyendo costos, complejidad técnica del método, dificultades de puesta a punto, entrenamiento de personal, etc., es en general favorable a los métodos genotípicos, con la desventaja de que implican en general un costo de inversión en equipamiento, pero éste es aplicable teóricamente a todos los tipos bacterianos. La sencillez de interpretación se relaciona con las dificultades y experiencia requerida para utilizar un método particular. Hasta el presente la interpretación de los resultados de los métodos moleculares continúa siendo un área de activa discusión, aunque varios métodos fenotípicos como la fagotipificación requieren gran experiencia para realizar e interpretar los resultados y aun así muchas veces solo permiten obtener resultados ambiguos. 191

3 Métodos fenotípicos. La aplicación de los métodos tradicionales de tipificación bacteriana juega un rol esencial en la investigación epidemiológica de casos esporádicos y brotes de ETA, por ejemplo para agrupar bacterias aisladas de un posible brote como pertenecientes a un mismo biotipo, serotipo, antibiotipo, y de ser aplicable fagotipo. En el caso de Salmonella, la estabilidad, reproducibilidad y capacidad de tipificación de estos métodos es muy satisfactoria. También estos métodos proveen de información útil a la hora de aplicar métodos genotípicos que busquen diferenciar entre cepas con idénticos perfiles fenotípicos, para establecer su clonalidad. La biotipificación es hoy considerada insuficiente por su escaso poder discriminatorio y pobre reproducibilidad, ya que los microorganismos pueden alterar de forma impredecible la expresión génica. En algunos casos, sienta una base de conocimiento para dirigir la investigación epidemiológica con otros métodos como serotipificación, por ejemplo en el caso de cepas de E. coli negativas a la decarboxilación de la lisina, para la búsqueda de serotipos pertenecientes a EIEC, o las negativas a la fermentación del sorbitol para orientar la búsqueda de cepas de STEC O157:H7. La tipificación por perfiles de sensibilidad a antimicrobianos también es de muy bajo poder discriminatorio, debido a que la resistencia a antimicrobianos muchas veces es portada por plásmidos que son fácilmente transferibles entre cepas y dependen de factores de selección para su estabilidad, por lo que muchas veces se pierden en los cultivos. Por esto la antibiotipia no es viable para ser utilizada como único método de tipificación ya que muchas veces aislamientos epidemiológicamente relacionados y genéticamente indistinguibles pertenecen a antibiotipos diferentes y a la inversa, aislamientos no relacionados poseen el mismo perfil de resistencia lo cual puede representar la adquisición del mismo plásmido por cepas diferentes (brote plasmídico). La serotipificación es uno de los métodos clásicamente utilizados para estudios epidemiológicos para muchas especies de bacterias. Continua siendo un método clave para la tipificación de aislamientos de Salmonella, Shigella y E. coli y resulta de esencial valor para dirigir la investigación ulterior. La principal limitante consiste en mantener el stock de antisueros necesarios, pero debido a la asociación de ciertos serotipos con ETA estos métodos resultan de gran valor epidemiológico. Por otra parte, a partir del desarrollo de métodos de genotipificación se ha demostrado la existencia de varias líneas clonales dentro de un mismo serotipo, por lo que el poder discriminatorio de la serotipificación es insuficiente. La fagotipificación implica la caracterización de cepas basada en la susceptibilidad a la infección por un panel definido de bacteriófagos. Dentro de los agentes de ETA este método es de especial aplicación a muchos de los serotipos de Salmonella incluyendo S. Enteritidis y S. Typhimurium siendo de los principales métodos de tipificación para estos serotipos. Resulta un método con importante 192

4 poder discriminatorio, aunque ha sido demostrado que ciertos fagotipos (PT) pueden cambiar debido a procesos como la adquisición de plásmidos de resistencia o transposones. Cepas de S. Enteritidis PT4 convierten a PT24 luego de la adquisición de plásmidos de resistencia del grupo de incompatibilidad incn, o en PT7 luego de mutaciones espontáneas en genes codificantes de LPS, convirtiéndose en cepas rugosas avirulentas. La fagotipificación resulta insuficiente cuando un determinado tipo prevalece en un área geográfica, como es el caso de S. Enteritidis PT4 en varios países europeos, en donde el aislamiento de este PT en una muestra no brinda información respecto al origen de la cepa. Los métodos moleculares han permitido discriminar entre cepas del mismo PT estableciendo la existencia de líneas clonales diferentes. La tipificación por perfiles proteicos, basados en la separación electroforética de proteínas de membrana externa ha resultado útil en la caracterización de cepas de amplia distribución geográfica de Salmonella Dublin y S. Berta, pero no así para otros serotipos, compartiendo incluso el mismo perfil entre distintos serotipos. Métodos genotípicos. En la medida en que se fueron desarrollando métodos de microbiología molecular, las técnicas electroforéticas utilizadas para la separación de macromoléculas fueron aplicadas como métodos de tipificación. En los últimos 30 años se han desarrollado gran cantidad de sistemas genotípicos de caracterización de cepas, que se basan en propiedades que no dependen de la expresión de propiedades fenotípicas y que permiten con mínimas modificaciones ser aplicados con la misma metodología para una gran variedad de especies bacterianas. De éstos, surgen como métodos de elección para la tipificación de aislamientos bacterianos 3 diferentes: Perfiles plasmídicos, perfiles de restricción de DNA cromosómico y perfiles de amplificación génica basados en PCR. Perfiles plasmídicos: Este fue el primer método molecular desarrollado como herramienta epidemiológica de tipificación bacteriana. Los plásmidos son elementos de DNA circular extracromosómico que contienen al menos un origen de replicación. Cuando la célula bacteriana se divide, copias de los plásmidos residentes se distribuyen entre las células hijas, por lo que es de esperar que miembros de la misma línea clonal contengan los mismos plásmidos. La determinación de perfiles plasmídicos puede realizarse por procedimientos relativamente simples de lisis celular y separación del DNA plasmídico del cromosómico seguidos de electroforesis en gel de agarosa. El numero y el tamaño de los plásmidos presentes es utilizado como base para la tipificación de cepas. (Fig. 1.) 193

5 El principal problema de interpretación de los perfiles plasmídicos, consiste en que las moléculas de DNA circular, pueden presentarse en diferentes conformaciones que varían con el grado de superenrollamiento, produciendo a partir de una misma variedad de plásmido diferentes patrones de movilidad electroforética. Por otra parte, plásmidos de igual peso molecular pero diferente secuencia, podrán tener un patrón idéntico de movilidad electroforética. El sistema de tipificación puede mejorarse realizando restricción enzimática sobre los extractos plasmídicos. Luego de la restricción, todas las moléculas que contienen sitios específicos para la endonucleasa utilizada, dejarán de tener conformación circular transformándose en uno o varios fragmentos lineales dependiendo del numero de veces que contenga la secuencia específica de restricción, y estos fragmentos serán de diferentes pesos moleculares, dependiendo de la distancia entre los sitios de corte. Es así que diferentes plásmidos con igual peso molecular, presentaran un patrón de restricción enzimática distinto, ya que este depende de la secuencia. Este método de tipificación, ha sido muy utilizado para el análisis de brotes de infecciones causadas por una variedad de bacilos Gram negativos, y ha sido especialmente exitoso aplicado a Salmonella, Shigella y EPEC en los que la mayoría de los serotipos presentan numerosos perfiles plasmídicos. Sin embargo, no siempre es válido asumir que cepas pertenecientes a una misma línea clonal contienen los mismos plásmidos, dado que se trata de elementos con alta tasa de transferencia entre cepas; en el caso de Salmonella, se han identificado aislamientos de diferentes serotipos con perfiles plasmídicos idénticos. Por otra parte, los plásmidos de virulencia de S. Enteritidis y S. Typhimurium prevalecen en diferentes PT dentro de estos serotipos. Además de la posibilidad de que los plásmidos puedan diseminarse entre diferentes bacterias, debe considerarse la posibilidad de que el contenido plasmídico de una cepa pueda variar por pérdida o por contener secuencias transponibles (transposones o secuencias de inserción) que promueven la ocurrencia de duplicaciones o de deleciones de fragmentos de DNA. Tanto los plásmidos como los transposones a menudo contienen determinantes de resistencia a antimicrobianos, por lo que están sujetos a presión de selección. Debido a estas limitaciones, la tipificación por perfiles plasmídicos es útil para estudios epidemiológicos limitados temporal y geográficamente, y puede tener más valor si es complementado con otras técnicas genotípicas que involucren estudios cromosómicos. 194

6 A B C Fig. 1. Perfiles plasmídicos de cepas de aislamiento nacional asociadas a diarrea infantil. A) y B) Cepas de EPEC O119:H6. C) Cepas de Shigella flexnerii. Departamento de Bacteriologia y Virología. Instituto de Higiene. F. Medicina. Perfiles de restricción de DNA cromosómico: Cada endonucleasa de restricción cliva el DNA en una secuencia específica de nucleótidos que puede encontrarse numerosas veces en el genoma. El número y tamaño de los fragmentos de restricción generados con una enzima en una determinada muestra de ADN refleja la frecuencia y distribución de los sitios de restricción. Distintas cepas de la misma especie bacteriana, podrán tener perfiles de restricción diferentes debido a variaciones en su secuencia de DNA. El método más simple utiliza endonucleasas que clivan el cromosoma en cientos de fragmentos que son luego separados por electroforesis en gel de agarosa en la que los fragmentos entre 0,5 y 25 Kb se resuelven en un patrón discernible de bandas. Todos los aislamientos pueden tipificarse por este método, pero puede llegar a ser de muy compleja interpretación. Una única banda puede contener fragmentos de tamaño similar de diferentes sectores del cromosoma, y los fragmentos mayores permanecen juntos al comienzo del gel o no logran migrar en él. Este método ha sido aplicado a muchas especies bacterianas, pero su uso ha disminuido en los últimos años, aunque resulta efectivo como método alternativo para la tipificación de C. difficile. De mas fácil interpretación, resulta la combinación de este método con el uso de sondas génicas, transfiriendo a una membrana de nitrocelulosa o de nylon el DNA separado por electroforesis e hibridizando la membrana con un fragmento de DNA marcado química o radioactivamente (sonda), que se unirá específicamente a aquellos fragmentos génicos que posean homología de secuencia. De esa manera, las variaciones en el número y tamaño de los fragmentos detectados por hibridación son de más fácil interpretación. Este método se denomina RFLP (restriction fragment lenght polymorphism). Según la sonda utilizada, varían las posibilidades de tipificación de la técnica, con diferente 195

7 poder discriminatorio dependiendo de la especie bacteriana. Es frecuente utilizar como sondas secuencias de inserción características, por ejemplo para Salmonella resulta con alto poder discriminatorio la hibridación con IS200. Cuando se utilizan sondas complementarias a las secuencias codificantes para RNA ribosómico 16 y 23S, la técnica se denomina ribotipificación. El RFLP y la ribotipificación han sido ampliamente utilizados para la tipificación de cepas de Salmonella, Shigella y E. coli, resultando de excelente reproducibilidad y poder discriminatorio, aunque su realización es laboriosa. Más recientemente, se ha desarrollado un sistema de electroforesis en gel de agarosa que permite separar fragmentos de DNA de mayor tamaño que la electroforesis tradicional, denominado PFGE (pulsed field gel electrophoresis) o electroforesis en campo pulsado. Esto es posible gracias a un sistema que utiliza 3 sets de electrodos distribuidos hexagonalmente alrededor del gel, que aplican corriente primero desde uno de los sets de electrodos, luego desde el segundo en un corto periodo de tiempo (pulso) y luego desde el tercero. Esto causa que el DNA se mueva en el gel hacia adelante y hacia atrás consecutivamente, aumentando el poder de resolución de la electroforesis y permitiendo así separar fragmentos de más de 1000 Kb. Este método, descrito en 1984 como herramienta para el análisis de cromosomas eucarióticos, ha probado ser muy efectivo para la tipificación bacteriana El genoma bacteriano, que contiene entre 2000 y 5000 Kb, es clivado con enzimas de restricción de bajo número de sitios de corte, generando entre 10 y 30 fragmentos de 10 a 800 Kb que se resuelven en un gel de agarosa sometido a campo pulsado. Todas las especies son tipificables por PFGE, siendo uno de los métodos de mayor reproducibilidad y poder discriminatorio que constituye en la actualidad el método de elección para una gran cantidad de especies en los centros internacionales de referencia, incluyendo Salmonella, STEC y Listeria. En nuestra experiencia con la puesta a punto de este método en los laboratorios del Instituto de Higiene, hemos corroborado la reproducibilidad de la técnica, aunque también experimentado la laboriosidad del método. Al tipificar un conjunto de cepas pertenecientes al serogrupo O119:H6 identificadas como EPEC y aisladas de un brote intrahospitalario de diarrea infantil, se obtuvo un perfil único de bandas por PFGE luego de restricción con XbaI, corroborando la existencia de clonalidad entre los aislamientos (Fig. 2). En la tipificación de 13 cepas de Salmonella Enteritidis de aislamiento nacional de origen alimentario o de cuadros de gastroenteritis, se encontraron 4 patrones diferentes de bandas luego de la restricción con la misma enzima. Estos resultados preliminares permiten asegurar el potencial discriminatorio de la técnica para los aislamientos nacionales de S. Enteritidis. La principal dificultad de este método radica en los detalles técnicos vinculados al procedimiento de extracción de DNA que debe mantenerse intacto hasta el momento de la restricción, y en el costo inicial de inversión al adquirir el equipamiento. Pero una vez operando, el método puede aplicarse con variaciones mínimas a una variedad de microorganismos. 196

8 Fig.2. PFGE en cepas de EPEC O119:H6 asociadas a un brote intrahospitalario de diarrea infantil. Depto. Bacteriologia y Virología. Instituto de Higiene. Facultad de Medicina. Perfiles de amplificación génica: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha sido utilizada durante mucho tiempo para la detección directa de varios agentes infecciosos en muestras clínicas, ha sido adaptada para su uso como herramienta de tipificación. La PCR permite producir millones de copias de un segmento de DNA con alta fidelidad en aproximadamente 3 horas. El procedimiento requiere de un molde de DNA (que puede estar presente en la muestra en muy pequeña cantidad), dos oligonucleótidos que flanquean la secuencia a ser amplificada (definiendo los puntos de partida para la actividad polimerasa), y una DNA polimerasa estable al calor. Un ensayo de PCR típicamente requiere de unas 3 horas para completar 30 ciclos, cada uno de los cuales consiste en una fase de desnaturalización (en donde las dos hebras de DNA se separan), una fase de hibridación ( en la que los oligonucleótidos se hibridan con las secuencias complementarias en el molde) y una fase de extensión (en donde la polimerasa sintetiza nuevas hebras de DNA a partir de las secuencias determinadas por los oligonucleótidos). En cada ciclo se generan dos nuevas copias de DNA doble cadena a partir del molde original por lo cual luego de 30 ciclos pueden sintetizarse teóricamente un billón de copias. La PCR utilizando oligonucleótidos arbitrarios, denominada RAPD (random amplification polymorphic DNA) es una variación de la PCR clásica, que utiliza un único oligonucleótido corto (típicamente de 10 pb), el cual por requerir baja 197

9 temperatura de hibridación se une a múltiples sectores del cromosoma bacteriano iniciando en diferentes sitios la síntesis de DNA. Cuando un oligonucleótido se une a una hebra del DNA molde y otro oligonucleótido se une en la cadena complementaria en un sitio próximo al anterior, se sintetiza un fragmento de DNA que será amplificado en los ciclos posteriores. Los productos de la amplificación consisten en una variedad de fragmentos que varían en tamaño y pueden ser separados y visualizados por electroforesis en gel de agarosa. Este método de tipificación es aplicable tanto a eucariotas como a procariotas y su reproducibilidad y poder discriminatorio se halla sujeto a activa discusión entre los investigadores. Es un sistema rápido de tipificación, que permite investigar decenas de aislamientos en un mismo día, aunque es altamente susceptible a las variaciones técnicas. Pequeñas variaciones en ph, fuerza iónica del buffer usado, origen de la polimerasa, temperatura de reacción, se traducen en diferentes perfiles de amplificación a partir de un mismo aislamiento. Estos factores hacen dificultoso obtener patrones reproducibles, y la interpretación de los resultados puede ser compleja cuando se trata de comparar aislamientos ensayados en diferentes momentos. Sin embargo el método brinda resultados válidos al amplificar y separar en un mismo gel varios aislamientos en forma comparativa. El poder discriminatorio aumenta si se utilizan varios oligonucleótidos en reacciones separadas, y se compaginan resultados de patrones de amplificación con los perfiles de bandas para cada oligonucleótido utilizado. En nuestra experiencia en la tipificación de cepas de aislamiento nacional de Salmonella Enteritidis utilizando un conjunto de 5 oligonucleótidos arbitrarios, la tipificación por RAPD ha demostrado tener buen poder discriminatorio, y ser un procedimiento reproducible al ser aplicado al análisis comparativo entre cepas (Fig. 3). De 43 cepas aisladas entre 1995 y 2001 de origen alimentario, avícola o humano, se obtuvo un perfil genotípico mayoritario presente en 37 de las 43 cepas, y otros 5 perfiles menores correspondientes a las 6 cepas restantes todas aisladas entre 1997 y Se encontró mayor variedad de tipos entre los aislamientos de origen avícola o alimentario que entre los de origen humano. En la comparación entre 8 cepas de S. Enteritidis aisladas en 2001 a partir de huevos de gallina, se encontró la presencia de 3 tipos génicos diferentes coincidentes con los 5 oligonucleótidos utilizados. El poder discriminatorio y reproducibilidad del método resulta apropiado para los aislamientos de S. Enteritidis en nuestro país. Consideramos que se trata de una herramienta epidemiológica ampliamente aplicable en nuestro medio, por su rapidez, bajo costo y facilidad de realización, siendo reproducible y fácil de interpretar siempre que se utilice de manera directamente comparativa. Es además probadamente eficaz para la tipificación de varias otras especies bacterianas incluyendo E. coli y Shigella. 198

10 A B Fig.3. RAPD-PCR en cepas de Salmonella Enteritidis de aislamiento nacional. A) con oligonucleotido P1254. B)con oligonucleotido 23L. Depto. Bacteriología y Virología - Depto. Desarrollo Biotcnologico. Instituto de Higiene. F. de Medicina. Más recientemente se han desarrollado métodos de tipificación que combinan la restricción enzimática del DNA cromosómico con la amplificación por PCR, que están siendo evaluados para aislamientos de Salmonella. Son métodos más complejos que el RAPD que involucran mayor tiempo de realización y laboriosidad, ya que implican la restricción, la ligación de los fragmentos con espaciadores de DNA, y la amplificación posterior usando oligonucleótidos complementarios a las secuencias de los espaciadores. Este método denominado AFLP (ampified fragment length polymorphism), aparece como una alternativa menos laboriosa que el PFGE pero también implica la adquisición de equipos de electroforesis sofisticados de alto costo. Otra aplicación de la PCR a la tipificación bacteriana consiste en la utilización de oligonucleótidos específicos para secuencias repetidas en el cromosoma bacteriano, discriminando según el número de veces que se encuentra la secuencia de interés y la separación entre una y otra dentro del cromosoma. Este método denominado REP-PCR y sus variantes, ha sido muy aplicado en varias especies de enterobacterias, aunque el RAPD ha resultado con mayor poder discriminatorio en el caso de E. coli y Salmonella. Una variante consiste en la tipificación por presencia de secuencias de inserción detectadas por PCR, utilizando secuencias de oligonucleótidos complementarias a los segmentos que flanquean la secuencia buscada. En el caso de Salmonella, la tipificación según la secuencia IS200 por PCR está siendo evaluada, y existen informes referidos a su potencial valor epidemiológico. Sin duda la metodología disponible para la tipificación bacteriana aplicada al estudio comparativo de aislamientos relacionados a ETAs, es cada vez mas amplia y esta en permanente proceso de cambios. Creemos que el desafío actual para el laboratorio que estudia las ETA incluye el uso combinado de varios de estos métodos así como la implementación de metodología de nueva generación. 199

11 Referencias bibliográficas. Van Belkum, A., Struelens, M., De Visser A., Verbruugh H and Tibayrenc M Rol of Genomic Typing in Taxonomy, Evolutionary Genetics and Microbial Epidemiology. Clinical Microbiology Reviews, 14(3): Olsen J.E., Brown, D.J., Skov, M.N. and Christensen J.P Bacterial typing methods suitable for epidemiological analysis. Applications in investigations of salmonellosis among livestock. The Veterinary Quarterey; 15(4): Tenover F., Arbeit R. and Goering R How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: A review for healthcare epidemiologists. Infection Control and Hospital Epidemiology; 18(6): Swaminathan B, Barret TJ, Hunter SB, Tauxe RV; The CDC PulseNet Task Force PulseNet: The molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States. Emerging Infectious Disease 2001;7(3): Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH and Swaminathan B Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulse-Field gel electrophoresis: Criteria for bacterial typing. Journal of Clinical Microbiology; 33(9): Surdeanu M, Pencu E., Tonciu M, Mihai I and Ciudin L Differentiation of Shigella strains by plasmid profile analysis, serotyping and phage typing. Roum. Arch Microbiol Immunol; 59(1-2): Chiou CS, Hsu WB, Wei HL, Chen JH Molecular epidemiology of a Shigella flexneri outbreak in a mountainous township in Taiwan, Republic of China. Journal of Clinical Microbiology;39(3): Welinder-Olsson C., Kjellin E., Badenfors M., Kaijser B Improved microbiological techniques using the polymerase chain reaction and pulsed-field gel electrophoresis for a diagnosis and follow-up of enterohaemorrhagic Escherichia coli infection. European Journal of Clinical Microbiology Infectious Diseases;19(11): Hopkins KL, Hilton AC Use of multiple primers in RAPD analysis of clonal organisms provides limited improvement in discrimination. Biotechniques;30 (6): , Hilton A.C. and Banks J.G. and Penn C.W Optimization of RAPD for fingerprinting Salmonella. Letters in Applied Microbiology; 24:

12 Olsen JE, Skov MN, Threlfall EJ and Brown DJ Clonal lines of Salmonella enterica serotype enteritidis documented by IS200-, ribo-, pulse field gel electrophoresis and RFLP typing. Journal of Medical Microbiology;40(1): Vogel L., Van Oorschot E, Maas HM, Minderhoud B., and DijkshoornL Epidemiologic typing of Escherichia coli using RAPD analysis, ribotyping and serotyping. Clin Microbiol Infect;6: