Epidemiología molecular Clostridium difficile

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1 Epidemiología molecular Clostridium difficile Dra Paola Pidal Laboratorio biomédico Nacional y de Referencia Clostridium difficile: Epidemiología molecular Disciplina que resulta de la aplicación e integración de la Biología Molecular a la investigación epidemiológica. La caracterización de los agente es EI indispensable para análisis epidemiológico. En los estudios epidemiológicos de brote Definir la relación existente entre los aislamientos estudiados Clon aislamientos relacionados por el hecho de descender de un ancestro común Definición probabilística

2 Identificación de género y especie Análisis clonal Clones Clostridium difficile: Métodos de caracterización molecular Método de elección depende de la pregunta epidemiológica. Estudio de brote: Marcadores muy discriminativos. PFGE Monitorizar diseminación a nivel mundial en un largo periodo Clon sufrirá cambios microevalutivos que generan patrones relacionados pero no idénticos. MLST: Identificación de grupos con independencia de pequeñas variaciones.

3 Clostridium difficile: Métodos de caracterización molecular PFGE: Electroforesis en campo Pulsado. MLST: Tipificación por secuenciamiento de multilocus. Ribotipificación: Amplificación y secuenciamiento de genes ribosomales. Elementos complementarios: PCR y secuenciamiento de gen regulador de la producción de toxina. Determinación de toxina binaria PFGE Extracción del ADN cromosómico bacteriano. Corte del ADN, utilizando enzimas de restricción de corte poco frecuente. Reconocen sitios específicos en el cromosoma generando largos fragmentos de ADN (0kb a 0Mb) Separación de los fragmentos obtenidos según su tamaño.

4 Pulsed field gel electrophoresis [PFGE] Preparación de gel de agarosa y siembra de plugs La aplicación de un complejo sistema de pulsos eléctricos alternantes, en diversos ángulos, permite separar en el gel de agarosa estos grandes fragmentos de DNA. Preparación gel agarosa % Pulsed field gel electrophoresis [PFGE] Estandarización S.Braenderup S.Braenderup S.Braenderup S.Braenderup Gel de agarosa % Generando un patrón de bandas llamado huella digital bacteriana o fingerprinting

5 Criterios de Tenover para la interpretación de perfiles de PFGE Categoría Nº bandas diferentes Nº eventos genéticos Interpretación epidemiológica Indistinguible 0 0 Aislamiento es parte del brote Muy relacionado 2\3 Aislamiento probablemente es parte del brote Posiblemente relacionado 4\6 2 Aislamiento posiblemente es parte del brote Diferente >=7 >=3 Aislamiento no es parte del brote Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP. Tipificación por secuenciamiento de multilocus : MLST Amplificación de 7 genes housekeeping Purificación de producto PCR

6 Multi-Locus Sequence Typing [MLST] Lectura nucleotídica Secuenciador Abi 330

7 MLST Clonal complex [CC] Ribotipificación Amplificación de región intergénica del RNAr. Secuencias altamente conservadas. Electroforesis tradicional o capilar ( mayor resolución) Análisis bioinformático del patrón obtenido en base de datos internacional. Nomenclatura establecida. Entrega en con probabilidades la similitud con respeto a cepas incorporadas.

8 Clostridium difficile Bacilo G(+), anaerobio estricto, esporulado. Toxina A (principalmente enterotoxina) y Toxina B (citotoxina) Toxina binaria formada por 2 subunidades Toxina binaria no se conoce claramente su rol en la patogénesis

9 Codifica Regulador (+) Codifica Regulador (-) Codifica Toxina B Codifica Toxina A Deleción en gen tcdc Presenta toxina binaria CDT, cepas normales sólo 4% Resistencia a ciertas fluoroquinolonas (hasta un 00%) Levofloxacin Gatifloxacin Moxifloxacin

10 Plos One August 202 Rol del gen tcdc y Toxina binaria como factores de virulencia de C. difficile No aclarado

11 Estados Unidos Afectó a 6 estados: Georgia, Illinois, Maine, New Jersey, Oregon y Pennsylvania 87 aislados Caracterización Molecular: PFGE y REA PCR para Toxina binaria Deleción en tcdc 00%

12

13 Clostridium difficile Canadá ( ) Afectó a diferentes hospitales en la Región de Québec 22,5 casos/mil admisiones hospitalarias. Reino Unido ( ) Otros países: Bélgica, Irlanda, Francia, Finlandia, Polonia, Alemania, Australia, Hong Kong, Costa Rica.

14 88 Hospitales Quebec 478 aislados 0-8% NAP 57%

15 Clostridium difficile Sistema de Vigilancia Vigilancia ante el aumento de casos notificados. Estudio de Toxina positivo. Envío de muestras o cepas al ISP.

16 Instituto de Salud Pública de Chile Caracterización molecular de aislamientos Clostridium difficile Tipificación genética por Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE) según: Protocolo estandarizado ISP con asistencia técnica del Instituto Nacional de Salud de Québec, Canadá Tipificación por secuenciación de multilocus MLST Ribotipificación Complementariamente Estudio de deleción gen regulador tcdc por PCR y secuenciación Clostridium difficile Cepas y muestras según procedencia Año Cepas Muestras Total Total

17 Clostridium difficile Cepas y muestras según procedencia 202 Presencia Clostridium difficile, Chile % Fuente: Laboratorio de Agentes Emergentes y Zoonosis Instituto de Salud Pública de Chile 66 % recuperación Fuente: Laboratorio de Agentes Emergentes y Zoonosis Instituto de Salud Pública de Chile Clostridium difficile Cepas y muestras según fecha de recepción

18 Clostridium difficile Cepas y muestras según edad del paciente Caracterización Genética Clostridium difficile Herramientas Epi-Mol Tipificación Genética. MLST RIBOTIP. PFGE Tiempo evolutivo medido en cambios. MLST: Gold Standard para relaciones evolutivas PFGE: Gold Standard para análisis de brotes

19 Instituto de Salud Pública de Chile Tipificación Molecular C. difficille, Abril de 202 Electroforesis de Campo Pulsado PFGE Hallazgos Iniciales Fenómeno Local? Fenómeno Global? Clones Circulantes Chilenos Comparación Bases Genética INSPQ-Quebec ISP Chile 00 CHILE NAP Clon no identificado en base de datos PFGE del INSPQ-Québec Tres bandas de diferencia, correspondería a variante chilena de NAP-??

20 MLST Tipificación por Secuenciación de Multilocus Amplificación y Secuenciación de fragmentos internos de 7 genes altamente conservados Fragmentos C. difficile Secuenciar Perfil Alélico MLST DataBase ST Secuenciación de multilocus (MLST) revela ST, perteneciente a complejo clonal relacionado a cepas NAP- Resultados de Caracterización molecular por PFGE y Ribotipificación en cepas de Clostridium difficile. Instituto de Salud Pública. Chile Tipo de Perfil PFGE Nº cepas Estudiadas Clon Nº aislados Ribotipo 027 Otros Clones no TOTAL cepas estudiadas 24 Ribotipo 43 altamente relacionado Variante chilena de NAP-

21 Tipo de Perfil Nº cepas % Variante NAP Clon predominante otros TOTAL cepas estudiadas Perfil por PFGE Nº cepas Estudiadas Nº cepas con deleción % cepas con deleción Otros perfiles* TOTAL cepas estudiadas *5 cepas no se logra amplificar en TcdC.

22 Perfil por PFGE Nº cepas Estudiadas Nº cepas con deleción 7 % cepas con deleción Otros perfiles* % TOTAL cepas estudiadas *5 cepas no se logra amplificar en TcdC Nº cepas con desarrollo Clostridium difficile Nº cepas estudiadas PFGE CL-CDF-SMA-00 REGION Nº % ANTOFAGASTA ARAUCANIA 2 2 ATACAMA BIOBIO COQUIMBO 3 0 MAULE METROPOLITANA O HIGGINS VALPARAISO Total

23 Sma Clostridium difficile Subtipificación por PFGE. Clones Circulantes en Chile 60SmaTipo Genético Cl-Cdf-Sma-009 Cl-Cdf-Sma-00 Cl-Cdf-Sma-006 Cl-Cdf-Sma-07 Cl-Cdf-Sma-025 Cl-Cdf-Sma-04 Cl-Cdf-Sma-047 Cl-Cdf-Sma-057 Cl-Cdf-Sma-08 Cl-Cdf-Sma-040 Cl-Cdf-Sma-032 Cl-Cdf-Sma-034 Cl-Cdf-Sma-052 Cl-Cdf-Sma-048 Cl-Cdf-Sma-024 Cl-Cdf-Sma-0 Cl-Cdf-Sma-008 Cl-Cdf-Sma-042 Cl-Cdf-Sma-00 Cl-Cdf-Sma-053 Cl-Cdf-Sma-046 Cl-Cdf-Sma-038 Cl-Cdf-Sma-049 Cl-Cdf-Sma-036 Cl-Cdf-Sma-058 Cl-Cdf-Sma-003 Cl-Cdf-Sma-028 Cl-Cdf-Sma-02 Cl-Cdf-Sma-026 Cl-Cdf-Sma-05 Cl-Cdf-Sma-027 Cl-Cdf-Sma-05 Cl-Cdf-Sma-020 Cl-Cdf-Sma-043 Cl-Cdf-Sma-029 Cl-Cdf-Sma-002 Cl-Cdf-Sma-055 Cl-Cdf-Sma-035 Cl-Cdf-Sma-044 Cl-Cdf-Sma-045 Cl-Cdf-Sma-02 Cl-Cdf-Sma-023 Cl-Cdf-Sma-039 Cl-Cdf-Sma-022 Cl-Cdf-Sma-03 Cl-Cdf-Sma-004 Cl-Cdf-Sma-037 Cl-Cdf-Sma-007 Deleción Casos Clínicos del8pb/stop codon 62. del39pb/stop codon del8pb/del7 2 del8pb/del7 2 del8pb/del7 368 del8pb/del7 2 del8pb/del7 del8pb/del7 2 stop codon 64 aa del8pb/- del36pb/stop codon 64. del54pb/del7 3 del8pb/ Linaje Hipervirulencia I Relacionado con cepa NAP/027 Se han identificado 47subtipos genéticos distintos Análisis filogenético de C. difficile en Base de Datos Global MLST ST2 (CLCDFSMA002) ST3 ST26 ST2 ST56 ST59 ST9 (CLCDFSMA0) ST5 ST6 ST36 ST7 ST4 ST53 ST4 ST7 ST33 ST3 (CLCDFSMA003) ST42 ST8 ST8 ST6 ST3 ST5 ST49 (CLCDFSMA02) ST0 ST35 (CLCDFSMA007) ST9 ST20 ST54 (CLCDFSMA04;00;006;04) ST34 ST69 ST4 (CLCDFSMA06) ST4 (CLCDFSMA026) GROUP /HA GROUP 2/Hyoervirulent ST22 (CLCDFSMA023) ST (CLCDFSMA00) ST67 ST5 (CLCDFSMA02) ST22 ST38 ST37 ST39 ST (CLCDFSMA026) GROUP 3/HA2 GROUP 4/ A-B+ clade Outlier 0.002

24 Subtipo 003 Subtipo 00 Variante NAP- Ribotipo 027 MLST ST Subtipo 009 Clostridium difficile: estudio genoma completo

25 Secuenciamiento genoma completo NAP/ cepas Dos Linajes con mutación confiere resistencia a Fluoroquinolonas : FQR / FQR2 no descritos anteriormente Análisis probabilístico: FQR emerge en USA FQR emerge USA (59% Prob) Canadá (33% prob) Ventaja selectiva??

26 Clostridium difficile: Conclusiones Problema a nivel mundial. Requiere de vigilancia coordinada. En el estudio genético de los aislamientos de C. difficile han integrado herramientas de epidemiología molecular: PFGE MLST Genoma Completo Predomina el clon 00, demostrándose que corresponde a una variante del clon internacional NAP-. Los hallazgos en la caracterización insertan a Chile dentro del fenómeno de expansión global que desafortunadamente ha desarrollado el C. difficile a través del clon norteamericano NAP- y sus variantes. Gracias

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