REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Tamaño: px

Comenzar la demostración a partir de la página:

Download "REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)"

Jorge Escobar Tebar
hace 7 años
Vistas:

1 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Microbiología General Microbiología M de los Alimentos Licenciatura en Bioquímica i Ingeniería en alimentos c Microbiología r 2015 Licenciatura en Biotecnología o b UNSL i o l o g í

2 Desarrollada por Kary Mullis en 1986 Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN, la cual se encuentra flanqueada por 2 secuencias de ADN conocidas Se basa en el mecanismo de replicación in vivo de ADN: El ADN bicatenario se desenrolla pasando a monocatenario, duplicándose y volviéndose a enrollar.

3 Pasos para realizar una PCR 1) Extracción del ADN deseado 2) Preparación de la mezcla de reacción (Master mix) 3) Separación de master mix en alícuotas y agregado del ADN de interés 4) Amplificación en un termociclador 5) Electroforesis en gel de agarosa 6) Observación en transiluminador UV

4 1- Extracción de ADN Existen distintos métodos para extracción de ADN. Técnica A: Bacterias en medio de cultivo An s ada Resuspender en 150 µl de Triton X-100 en buffer TE Colocar en baño de agu a 100 C 15 min Tomar 50 µl del Centrifugar a ADN listo para PCR sobrenadante y rpm 5 colocar en tubo nuevo min

5 Técnica B: Kit comercial de extracción QIAamp

6 2 - Componentes de la Master Mix H 2 O ultrapura Buffer Mg +2 dntps Primer forward Primer reverse Termociclador ADN polimerasa + ADN de interés

7 Preparación de Master mix Reactivos Solución stock Solución de trabajo Volumen en la mezcla (µl) Buffer 10 x 1x.. dntps 2,5 mm 0,1 mm.. M g Cl 2 25 mm 1,5 mm.. Iniciador a 100 pmol/ µl 2 pmol/ µl.. Iniciador b 100 pmol/ µl 2 pmol/ µl.. Taq pol 5 U/ µl 0,02 U/ µl.. ADN templado.. H2O ultrapura.. Volumen final 25

8 3 - Pasos durante la amplificación 1) Desnaturalización nicial C 2) Ciclos: -Desnaturalización - Unión o annealing - Extensión C C C 3) Extensión final C Importancia de los controles: Control positivo: ADN diana que amplifica el gen buscado. Para verificar que el procedimiento se realiza adecuadamente. Control negativo: master mix sin ADN. Para verificar que no haya contaminación de los reactivos.

10 Cuidados a tener en cuenta Trazas de ADN contaminante podrían servir como ADN molde, llevando a la amplificación de un fragmento no deseado (FALSOS POSITIVOS). Para evitarlo es fundamental: Trabajar en asepsia Lugar de trabajo bien limpio, trabajar con guardapolvo, guantes Material que se utiliza debe ser estéril Usar material nuevo Zonas de trabajo Recomendable: zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de material adecuado. Zona de preparación de la master mix. Zona de PCR Zona post-pcr: se visualizan los resultados.

11 4 - Revelado Los fragmentos de PCR se revelan mediante electroforesis en gel de agarosa. Gel de agarosa y buffer de corrida TAE o TBE Siembra 10 µl de muestra + 2 µl de azul de bromofenol Visualización

12 Conceptos básicos Especificidad: generación de un único producto de amplificación. Eficiencia: máxima producción de amplificación en función del número de ciclos. Fidelidad: número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia (menor número de errores, mayor fidelidad). Sensibilidad: mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias Aplicaciones n Microbiología: Identificación de microorganismos por presencia de una secuencia especifica del gen 16S ARNr u otros genes específicos de especie Selección de clones que posean genes asociados a virulencia, resistencia a antibióticos, etc. Establecer relación entre cepas durante brotes o estudio epidemiológicos n otras áreas: Identificación de genes para diagnóstico y medicina legal Investigación de modelos de expresión

13 Ventajas A partir de una pequeña cantidad de ADN se puede obtener una cantidad considerable de copias Rapidez en el diagnóstico Mayor sensibilidad que los cultivos Se puede amplificar ADN de cualquier organismo, viable o no. El fragmento obtenido se puede clonar, secuenciar y analizar Desventajas La enzima ADN polimerasa puede generar errores al sintetizar la copia nueva Puede contaminarse con ADN de ensayos previos Reactivos costosos

14 Tipos de PCR Nested PCR (2 PCR) Técnica muy sensible en la que el producto de la 1ª PCR es utilizado como molde para realizar una 2ª PCR con cebadores que hibridizan dentro de la primera secuencia amplificada. Ventaja: brinda alta sensibilidad y especificidad Desventaja: no permite cuantificar la muestra

15 PCR multiplex PCR en la cual se amplifican simultáneamente dos o más secuencias, para lo cual se combinan dos o más pares de cebadores en el mismo tubo de la mezcla de reacción junto con los demás reactivos.

16 RT- PCR Variante de PCR en donde una hebra de ARN mensajero es transcripta a ADN complementario (ADNc) usando la enzima retrotranscriptasa, y el resultado se amplifica como una PCR tradicional.

17 Aplicaciones en el Laboratorio de Microbiología

18 Sensibilidad de la técnica nested- PCR para el gen yada Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos por nested-pcr cuando distintas concentraciones de Y. enterocolitica W1024 fueron inoculadas en chorizo de puro cerdo. (a) ADN extraido mediante el protocolo desarrollado por Kapperud y modificado en el presente trabajo, (b) ADN extraído mediante el reactivo PrepMan Ultra. Línea M: marcador de peso molecular de 100pb; C (-): control negativo.

19 PCR múltiplex para la determina ción de la presencia de genes de virulencia PCR multiplex para los genes inv (558 pb) y yst. (192 pb) de Yersinia enterocolitica 1: Cepa 51, B2/O:9 2: Cepa 52, B2/O:9 3: Cepa 53, B2/O: : Cepa 64, B4/O:3 5: Marcador de peso molecular 6: Cepa 68, B4/O:3 7: Cepa de referencia, W1024, B2/O:9 8: Cepa de referencia, MCH700 B4/O:3 9: Control negativo 10: Marcador de peso molecular

20 Resistencia a ATM de Helicobacter pylori El mecanismo de resistencia a Cla está asociado a mutaciones puntuales en la región peptidiltransferasa del gen 23s RNAr, principalmente en las posiciones 2142 y 2143 en las cuales una guanina o citocina reemplazan una adenina. ACGGAAAGACC WT S CLA ACGGGAAGACC A2142G R CLA ACGGAGAGACC A2143G R CLA Amplificación fragmento 450 pb

21 Bibliografía Brock, Biología de los microorganismos. Somma M, Querci M. Análisis de la presencia de los organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos. Sesión N 6 Torres Tejeda AG, Baca BE. Reacción en cadena de la polimerasa. Centro de investigación microbiológica. Instituto de Ciencia. Universidad de Puebla. (imágenes)

Documentos relacionados

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Microbiología de los Alimentos Ingeniería en alimentos

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Microbiología de los Alimentos Ingeniería en alimentos 2015 Desarrollada por Kary Mullis en 1986 Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente una región