2 Congreso Nacional de Química Médica Carbajal-Franco y col.

Transcripción

1 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL mrna DE LAS CITOCINAS INMUNOMODULADORAS IFN-γ, TGF-β 1 E IL-4 Y SUS IMPLICACIONES EN EL DESARROLLO DEL CÁNCER CÉRVICO UTERINO Carbajal-Franco E, Terán-Porcayo MA, Illades-Aguiar B, Madrid-Marina V, Fernández- Tilapa G.. Laboratorio de Investigación Clínica, Unidad Académica Facultad de Ciencias Químico Biológicas (UA-FCQB), Universidad Autónoma de Guerrero (UAG). Instituto Estatal de Cancerología Dr. Arturo Beltrán Ortega. Laboratorio de Biomedicina Molecular UA-FCQB- UAG. Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas (CISEI), Instituto Nacional de Salud Pública (INSP). ebzadrel@gmail.com. RESUMEN Objetivo. Semicuantificar la expresión del mrna de IFN-γ, IL-4 y TGF-β1 y establecer su relación con el grado de lesión cervical y la infección por el VPH. Material y métodos. Estudio transversal realizado en ochenta muestras cervicales con los siguientes diagnósticos; negativo a lesión intraepitelial o malignidad (CN) (n=20), lesión escamosa intraepitelial de grado bajo (LEIGB) (n=20), de grado alto (LEIGA) (n=20) y cáncer cérvico uterino (CaCU) (n=20). En todas las muestras se buscó DNA del VPH mediante PCR/RFLPs, empleando RT-PCR semicuantitativa se determinó el nivel de expresión del mrna de los genes IFN-γ, IL-4 y TGF-β1. Resultados. De todas las muestras, el 55% (18/33) y 75% (3/4) de las muestras con VPH-16 y VPH-18 respectivamente, expresaron el mrna de IFN-γ; el 36% (12/33) de las muestras con VPH-16 expresaron el mrna de IL-4; el 95% (57/60) de las muestras VPH positivas, expresaron el mrna de TGF-β1. La semicuantificación reveló que el nivel de expresión del mrna del IFN-γ fue mayor en CaCU en comparación con LEIGA (p=0.035) y CN (p=0.018). La expresión del mrna de IL-4 fue significativamente mayor en CN al compararlo únicamente con CN (p=0.018). No se encontraron diferencias en el nivel de expresión del mrna de TGFβ1 entre los cuatro grupos de estudio. Un patrón de citocinas tipo 1, determinado por la expresión del mrna de IFN-γ pero negativos al de IL-4 se observó con mayor frecuencia en CaCU (9/20). El patrón de citocinas tipo 2, determinado por la expresión del mrna de IL-4 y la ausencia de IFNγ, se observó preferentemente en CN (7/20). Conclusión. Debido a la disminución del mrna de IL-4 (citocina tipo 2) en el microambiente del CaCU, la expresión de citocinas tipo 2 probablemente no es un factor importante para la progresión de las lesiones premalignas a CaCU asociadas al VPH. Palabras clave. Cáncer cérvico uterino (CaCU), virus del papiloma humano (VPH), citocinas. INTRODUCCIÓN La infección persistente de los queratinocitos cervicales por el VPH y el consecuente desarrollo de lesiones escamosas intraepiteliales de bajo (LEIGB) y alto grado (LEIGA), son requisitos indispensables para el desarrollo de CaCU. 1 Las infecciones virales son eliminadas por la respuesta inmune celular (RIC) que consiste del reconocimiento y la lisis de la célula infectada por los linfocitos T (LT) CD8+, un evento favorecido por el IFN-γ secretado por esas mismas células, también por las células asesinas naturales (NK) y la subpoblación Th1 de los LT CD4+, 2,3,4,5 existen sin embargo dos subpoblaciones más denominadas Th2 y Th3 que secretan IL-4 y TGFβ 1, respectivamente. 6 Las citocinas IFN-γ e IL-4 antagonizan mutuamente sus funciones. Dentro de las funciones principales de IL-4 y TGF-β 1 están inhibir la RIC,

2 otra función de IL-4 es activar la respuesta inmune humoral (RIH), sin embargo, la activación de la RIH puede permitir la progresión de tumores causados por virus, por lo tanto, el tipo y nivel de expresión de citocinas determina el curso de la respuesta inmune y el resultado final de la infección viral y la carcinogénesis. En las LEIGB y LEIGA, la alteración de la RIC es un factor favorable para la progresión a CaCU tal y como se ha demostrado en pacientes coinfectadas con VIH, 2,3,4,5,7,8 actualmente se desconoce el papel de la respuesta inmune en el desarrollo del CaCU y la relación existente entre el tipo y nivel de expresión del RNA mensajero (mrna) de IFN-γ, TGFβ 1 e IL-4 en el microambiente cervical con cada una de las etapas de la carcinogénesis ni con el genotipo de VPH causante de la infección. El objetivo de este trabajo fue semicuantificar la expresión del mrna de IFN-γ, IL-4 y TGF-β 1 y establecer su relación con el grado de lesión cervical y la infección por el VPH. METODOLOGÍA De diciembre de 2002 a diciembre de 2004 se realizó un estudio transversal, se tomaron ochenta raspados y biopsias cervicales de mujeres guerrerenses referidas al Instituto Estatal de Cancerología Dr. Arturo Beltrán Ortega, las muestras presentaron los siguientes diagnósticos; negativo a lesión intraepitelial o malignidad (CN) (n=20), LEIGB (n=20), LEIGA (n=20) y CaCU (n=20). En todas las muestras se extrajo el DNA y RNA total. El DNA se utilizó para el diagnóstico y genotipificación del VPH mediante PCR-RFLPs. El RNA se empleó para la síntesis de DNA complementario (cdna), durante la síntesis de cdna se introdujo un control negativo de la retrotranscripción; una muestra se procesada por duplicado pero a una de ellas no se le adicionaba retrotranscriptasa para descartar amplificación a partir de DNA contaminante. Mediante PCR se analizó de manera cualitativa/semicuantitativa la expresión del mrna del gen constitutivo β-actina seguido del mrna de IFN-γ, IL-4 y TGF-β 1. En cada PCR de citocinas se introdujo un control positivo con cdna derivado de células mononucleares de sangre periférica estimuladas con PHA para IFN-γ e IL-4, y de células HeLa para TGF-β 1, se introdujo además un control negativo sustituyendo el templete de cdna por agua estéril. Los productos de PCR se analizaron en el fotodocumentador Gel Documentation Systems (Gel Doc 2000TM) (BIO-RAD) previa tinción con bromuro de etidio. La densidad de las bandas se determinó utilizando el programa Gel-Pro Analyzer Version 3.1 for WindowsTM (Media Cybernetics). La densidad del producto de PCR de cada citocina se normalizó con la densidad del producto de PCR de β-actina. Se calculó la proporción unidades de densidad de citocinas/unidades de densidad de β-actina Utilizando el programa estadístico SPSS 12.0 se calcularon las frecuencias de los genotipos de VPH. El nivel de expresión de citocinas entre CN, LEIGB, LEIGA y CaCU se comparó usando la prueba de Kruskal-Wallis, los niveles entre dos grupos se comparó usando la prueba de Mann-Whitney. RESULTADOS Todas las muestras de CN fueron negativas al VPH y todas las muestras analizadas expresaron el mrna de β actina (figura 1). Las 60 muestras con diagnóstico de LEIGB, LEIGA y CaCU fueron positivas al VPH, de las cuales, el 58% no expresó el mrna de IFN-γ y el 42% si lo hizo, sin embargo, al revisar por genotipos se observó que el 55% (18/33) y 75% (3/4) de las muestras con VPH-16 y VPH-18 respectivamente, expresaron el mrna de IFN-γ. El 72% de las muestras VPH positivas fueron negativas al mrna de IL-4 y el 28% positivas, el alto porcentaje de muestras negativas al mrna de IL-4 se mantuvo incluso después de analizar por

3 genotipos virales. Prácticamente todas las muestras con VPH (95%, 57/60) expresaron el mrna de TGF-β 1. Por otra parte, la expresión del mrna de IFN-γ se observo con mayor frecuencia (13/20, 65%) en muestras de CaCU comparado con LEIGA, LEIGB y CN, el porcentaje de muestras positivas al mrna disminuyó gradualmente conforme disminuía el grado de la lesión alcanzando solo el 25% (5/20) en las muestras de CN (figura 2). La expresión del mrna de IL-4 se observo con mayor frecuencia en muestras de CN, la frecuencia de positividad disminuyó en las lesiones y cáncer, entre las muestras de LEIGB, LEIGA y CaCU el porcentaje de muestras que expresaron el mrna de TGF-β 1 fué idéntica, el porcentaje de positividad al mrna de TGF-1 disminuyó solamente en CN (figura 2). La semicuantificación reveló que el nivel de expresión del mrna del IFN-γ fue mayor en CaCU en comparación con LEIGA (p=0.035) y CN (p=0.018) (figura 3 y 4). La expresión del mrna de IL-4 fue significativamente mayor en CN al compararlo únicamente con CN (p=0.018) (figura 3 y 5). 615 pb 492 pb 540 pb β-actina Figura 1: Expresión del mrna del gen β-actina de expresión constitutiva. MPM: Marcador de peso molecular DNA ladder de 123 pb. carril 1: CN, carril 2: LEIGB, carril 3: LEIGA, carril 4: CaCU, carril 6: control negativo de la retrotranscripción en el que se utilizó RNA sin transcriptasa reversa, carril 7: control negativo de la PCR en el que se sustituyó cdna por agua. Figura 2: Frecuencia de la expresión del mrna de IFN-γ, IL-4 y TGF-β 1 con respecto al diagnóstico citológico o histopatológico de las muestras analizadas.

4 246 pb 123 pb 246 pb 492 pb 369 pb 243 pb 197 pb 391 pb TGF-β 1 IL-4 IFN-γ Figura 3: Expresión del mrna de los genes TGF-β 1 (243 pb), IL-4 (197 pb) e IFN-γ (391 pb): MPM; Marcador de peso molecular DNA ladder de 123 pb; carril 1; CN; carril 2; LEIGB; carril 3 y 4; LEIGA; carril 5 y 6; CaCU; carril 7; control positivo de la PCR correspondiente a cdna sintetizado a partir de RNA de células HeLa para TGF-β 1 y de CMSP estimuladas con PHA para IL-4 e IFN-γ. Figura 4: Análisis comparativo de la expresión del mrna de IFN-γ en muestras de CN, LEIGB, LEIGA y CaCU. La expresión del mrna de IFN-γ se normalizó a la expresión del mrna de β actina. Un valor de p menor a 0.05 se consideró estadísticamente significativo. ] Valores indetectables No se encontraron diferencias en el nivel de expresión del mrna de TGF-β 1 entre los cuatro grupos de estudio (figura no mostrada). Un patrón de citocinas tipo 1, determinado por la expresión del mrna de IFN-γ pero negativos al de IL-4 se observó con mayor frecuencia en CaCU (9/20). El patrón de citocinas tipo 2, determinado por la expresión del mrna de IL-4 y la ausencia de IFN-γ, se observó preferentemente en CN (7/20) (figura 6). Figura 5: Análisis comparativo de la expresión del mrna de IL-4 en muestras de CN, LEIGB, LEIGA y CaCU. La expresión del mrna de IL-4 se normalizó a la expresión del mrna de β- actina. Un valor de p menor a 0.05 se consideró estadísticamente significativo. ] Valores indetectables

5 Figura 6: Número de muestras que expresaron predominantemente un patrón de citocinas tipo 1 o 2. Patrón de citocinas tipo 1: IFN-γ sin IL-4, IFN- γ + TGF-β 1; patrón de citocinas tipo 2: IL-4 sin IFN- γ, IL-4 + TGF-β 1; citocinas asociadas a un patrón tipo 1: IL-4 + IFN- γ + TGF-β 1. DISCUSIÓN y CONCLUSIÓN En este estudio se encontró que las muestras cervicales con VPH de alto riesgo oncogénico como el VPH-16 y 18 expresaron con mayor frecuencia el mrna de IFN-γ, de acuerdo con esto, Fernandes 7 encontró que las biopsias cervicales con VPH- 16 expresaron niveles altos de IFN-γ al compararlas con las muestras sin VPH-16. El porcentaje de muestras y el nivel de expresión de IFN-γ fue mayor en cáncer comparado con las lesiones y CN, otros autores como de Gruijl, El-Sherif y Pao 2,3,4 reportaron que un alto porcentaje de muestras de LEI o CaCU no expresaron el mrna de IFN-γ o sus niveles fueron bajos comparados con CN, sin embargo, Pardo-Govea 8 apoya nuestros hallazgos pues reporta altos niveles de IFN-γ en pacientes con neoplasia intraepitelial cervical comparado con su grupo control normal, es probable que el incremento del nivel de IFN-γ en CaCU se deba a la infiltración de LT CD8+, LTh1 y células NK en el tejido tumoral. El porcentaje de muestras que expresaron el mrna de IL-4 así como el nivel de expresión fue mayor en CN, varios trabajos que analizan IL-4 en tejido cervical5, 2 reportan resultados inversos a los nuestros, solo Gey coincide con nosotros ya que reportan la expresión del mrna de IL-4 en el 48% de las biopsias provenientes de CaCU, el 52% restante no lo expresó. 5 La comparación de los resultados de IL-4 con los de IFN-γ, refleja la expresión preferencial de un perfil de citocinas en el microambiente cervical que favorecería la activación de la RIC y no la RIH. Con respecto a TGF-β1, el 95% de las muestras con diagnóstico de LEIGB, LEIGA y CaCU expresaron su mrna, el porcentaje de muestras disminuyó hasta 75% en las muestras de CN. El nivel de expresión del mrna de TGF-β1 fue mayor en CN seguido por LEIGB, CaCU y LEIGA, La proporción de muestras que expresaron el mrna de TGF-β1 en nuestro estudio semejan con los obtenidos por de Gruijl 2 quien reportó expresión de TGF-β1 en la totalidad de las biopsias cervicales normales, premalignas y malignas. Es importante considerar que el papel de TGF-β1 en la carcinogénesis depende mucho de otras citocinas expresadas a nivel local porque

6 dependiendo de esto puede inhibir la formación del tumor cuando se expresa con IFNγ o favorecer la carcínogénesis cuando se expresa con IL-4 al inhibir la RIC. Con los resultados obtenidos podemos sugerir que en el cérvix uterino premaligno y maligno con infección por el VPH no siempre existe un microambiente inhibidor de la respuesta inmune celular, por el contrario, este tipo de respuesta podría estar estimulada en el sitio de infección viral/lesión. REFERENCIAS 1. Waggoner SE. Cervical Cancer. Lancet (9376): de Gruijl TD, Bontkes HJ, van den Muysenberg AJC, van Oostveen JW, Stukart MJ, Verheijen RHM, et al. Differences in Cytokine mrna Profiles Between Premalignant and Malignant Lesions of the Uterine Cervix. Eur J Cancer (3): El-Sherif AM, Seth R, Tighe PJ, Jenkins D. Quantitative analysis of IL-10 and IFN-gamma mrna levels in normal cervix and human papillomavirus type 16 associated cervical precancer. J Pathol Sep;195(2): Pao CC, Lin CY, Yao DS, Tseng CJ. Differential expression of cytokine genes in cervical cancer tissues. Biochem Biophys Res Commun Sep 25;214(3): Gey A, Kumari P, Sambandam A, Lecuru F, Cassard L, Badoual C, et al. Identification and characterisation of a group of cervical carcinoma patients with profound downregulation of intratumoral Type 1 (IFNgamma) and Type 2 (IL-4) cytokine mrna expression. Eur J Cancer (5): Spellberg B, Edwards JE Jr. Type 1/ Type 2 Immunity in infectious Diseases. Clin Infect Dis (1): Fernandes AP, Goncalves MA, Duarte G, Cunha FQ, Simoes RT, Donadi EA. HPV16, HPV18, and HIV infection may influence cervical cytokine intralesional levels. Virology (2): Pardo-Govea T, Callejas D, Nunez-Troconis J, Araujo M, Costa L, Pons H, et al. Gamma interferon (IFN-gamma), tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukins 2, 4 and 6 (IL-2, IL-4, IL-6) in cervical-uterine cells of intraepithelial neoplasia: a preliminary report. Invest Clin (1):5-13.