Dra. Mónica Saracco Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)

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Eduardo Martín Robles
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1 CUANTIFICACIÓN EN CITOMETRÍA DE FLUJO Dra. Mónica Saracco Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)

2 CONCEPTO DE CUANTIFICACIÓN Medición de células presentes en el organismo normalmente, cuyo valor relativo y/o absoluto tendrá suma importancia para la toma de decisiones diagnósticas y/o terapéuticas

relativo y/o absoluto tendrá suma importancia

3 QUÉ SE CUANTIFICA? Poblaciones y sub-poblaciones linfocitarias Células CD 34 GB para depletar UGR y/o plaquetas en transfusión

4 CONSIDERACIONES PARA CUANTIFICAR DOBLE PLATAFORMA PLATAFORMA SIMPLE CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD CONTROLES EXTERNOS DE CALIDAD CRITERIOS PARA INFORMAR

5 METODOLOGÍA DOBLE PLATAFORMA MEDICIONES SIMULTÁNEAS MUESTRAS SIN LAVADO TODOS LOS EQUIPOS CONTROLADOS SIMPLE PLATAFORMA MUESTRAS SIN LAVADO EVALUACIÓN DE LAS BEADS

6 CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS Estado de la muestra Calibración de pipetas Control del contador hematológico Reproducibilidad en los hemogramas Control del citómetro (Limpieza, canales de fluorescencia, óptica) EXTERNOS Controles de calidad con reconocimiento nacional e internacional (QASI-Program, CAP, ProgBA) Evaluar y modificar los parámetros en base a ellos

canales de fluorescencia, óptica) EXTERNOS Controles de calidad con reconocimiento

7 FUENTES DE HPC MO SP movilizada Sangre de cordón Movilización con factores de crecimiento GMCSF, GCSF Movilización con QT Recolección con leucoaféresis

8 PBSC MO Autóloga Menor contaminación tumoral Engraftment más corto Recolección fácil Menos efectos adversos (vol. menores) Procesos ex-vivo (manipulación genética, purga tumoral, selección + de CD34) Mayor contaminación Mayores volúmenes Recolección más compleja

menores) Procesos ex-vivo (manipulación genética, purga tumoral,

9 IDENTIFICACIÓN DE HPC Propiedades funcionales CFU-GM días para la lectura de resultados CD34 proteína glicosilada tras-membrana PM: KD, rol protector contra daño proteolítico (mediado por ENZ.), por su gran n de sitios glicosilados Marcador confiable para reconocer células mononucleares de MO (1%) que incluyen a las HPC

contra daño proteolítico (mediado por ENZ.

10 HPC HPC CD34+ es una población heterogénea que incluye a las stem cell pluripotentes así como a los precursores diferenciados a linaje Monitoreo de CD34+ en SP permite establecer el momento óptimo de recolección por leucoaféresis, el pico depende del protocolo utilizado N de células CD34+ infundidas es predictivo de la sobrevida del paciente post-transplante

el momento óptimo de recolección por leucoaféresis, el pico depende del protocolo

11 FUNDAMENTOS MÉTODO ISHAGE Control Isotipo Puede enmascarar CD34+ auténticos No se recomienda para establecer región de positividad Se recomienda CD45 FITC/ Isotipo PE AC. Anti CD34 Selección del clon adecuado Selección de Fluorocromos PE, PECY5, APC Menor autofluorescencia, menor unión a FC

12 Método ISHAGE R1 R2 R3 R4

13 ASPECTOS TÉCNICOS N de eventos analizados = eventos CD45+ (mínimo 100 células CD34+) Asegura precisión WCB <10X10 9 l, 100 ul de SP/ Aféresis. Incubar min. 4 C Incluir todas las células nucleadas y se pueden eliminar las muertas con tinciones nucleares 24hs 98% viabilidad

<10X10 9 l, 100 ul de SP/ Aféresis. Incubar 20 30 min.

14 CD45 Antígeno CD45 Pan Leucocitario Negativo en GR y plaquetas Denominador de leucocitos para el recuento absoluto de CD34 Lisis de GR Mejor recuperación celular Menor tiempo Lavados pérdida de CD34+

15 RECUENTO ABSOLUTO Más sencillo SIMPLE PLATAFORMA Mayor estandarización inter-laboratorio Se evitan errores inherentes al uso de un 2 equipo Errores de 0.06% a 0.1% Calibración de partículas fluorescentes utilizadas Exactitud y reproducibilidad del pipeteo

al uso de un 2 equipo Errores de 0.06% a 0.

16 T.A.M.O Reconstitución Hematopoyética Neutrófilos > 0.5 X 10 9 l Células Plaquetas > 20 X 10 9 precursoras l primitivas CD34+/ 2X10 6 a 8 X10 6 células CD38 neg o débil, CD34+/Kg de peso HLA-DR neg/ débil Rango varía según CD90, CD133, patología y QT realizada CD13 Reconstitución tardía (precursoras 0.5 X 10 6 a 2.0 x 10 6 primitivas) células CD34+/Kg de peso Progenitores con diferenciación a linaje CD71, CD13 (H), TdT, CD19, CD10, MOP

débil, CD34+/Kg de peso HLA-DR neg/ débil Rango varía según CD90, CD133, patología y QT realizada CD13

19 RECUENTO ABSOLUTO LTCD3/CD4+ DOBLE PLATAFORMA Hemograma S/lavado CMF 3 colores/ 4 colores Más económica Requiere mayor control (2 equipos) PLATAFORMA ÚNICA Tubos Tru-Count 4 Colores S/Lavado Encarece el método Utiliza solo 1 equipo Evaluar reproducibilidad

control (2 equipos) PLATAFORMA ÚNICA Tubos Tru-Count 4 Colores

20 CONTROLES DE CALIDAD Control de calidad interno Trazabilidad y reproducibilidad de equipos utilizados Controles comerciales o Sangre periférica normal Control de calidad externo Sangre estabilizada

21 CDC RECOMENDACIONES Repetición de 1 MoAb en la determinación de CD3/CD4 y CD3/CD8 La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8 deberá ser igual al valor del CD3 +/- 5 a 10% La suma de LT CD3+, LB CD19+, células NK deberá ser igual al 100% +/- 5-10% en poblaciones linfocitarias periféricas No realizar lavados

22 MATERIALES Y MÉTODOS 5ml de SP con EDTA en tubos Vacutainer Marcación con 50 ul de sangre entera bien homogeneizada / 5 ul de MoAb Incubar 15 a 20 minutos, T ambiente Lisado con distintos métodos Hacer la CMF

23 EVALUACIÓN PREVIA CMF 1) SP sin presencia de coágulos 2) Dentro de las 24 hs de extracción 3) Hemograma con reproducibilidad 4) Evaluar todos los parámetros del mismo, GR, GB, Plaquetas 5) Repetir en caso de leucopenia o leucocitosis

24 EVALUAR DURANTE LA CMF Método de lisis Presencia de GR nucleados (Eritroblastos) Pureza de la región seleccionada (baja en monocitos) Evaluar la presencia de células dobles positivas

25 CUÁNDO SE DEBERÁ REPETIR UNA MUESTRA? Mala lisis de GR (no se puede establecer una clara diferencia entre linfocitos, monocitos y granulocitos) La suma de valores CD3/CD4 y CD3/CD8 supera ampliamente al CD3 (sin observar células dobles positivas) Valores de CD3 inferiores al 50% (sin alteraciones de lisis presentes)

26 CUÁNDO DEBO MEDIR TODAS LAS POBLACIONES Y SUB-POBLACIONES PERIFÉRICAS? Siempre sería lo correcto Indispensable, con valores bajos menores al 50% de CD3 total Evaluar células B (CD19 positivas) Evaluar células NK (CD56-16 positivas)

27 PROTOCOLOS DE ANÁLISIS Región morfológica FSC vs. SSC Región en base a MoAb (CD45) vs. SSC TRI-Test CD8/CD4/CD3 CD3/CD4/CD45 CD3/CD8/CD45 Multi-Check CD3/CD8/CD4/CD45

28 GATING: Estrategia de análisis Estudio de poblaciones heterogéneas Selección de eventos R1

29 Density Dot Plot Contour Plot Los colores informan la frecuencia de los eventos Identificación de las poblaciones mediante líneas de contorno

30 Análisis de 3 colores R1

31 COULTER EPICS XL Tri-Test CD4/CD8/CD3 Gate morfológico (FSC vs SSC) Simul-Test CD3/CD4/CD45 CD3/CD8/CD45 Gate en SSC vs. CD45

32 FACS CANTO 4 COLORES MULTI-TEST CD3/CD8/CD45/CD4 CD3/CD56-16/CD45/CD19 Se utilizan con Doble Plataforma (Hemograma+Citometría) Clinico Simple Plataforma con tubos Tru-Count DIVA

33 PROTOCOLO Donantes de banco de sangre Serología negativa 105 muestras obtenidas post-donación Vacutainer con EDTA Procesadas en el día

34 COMPARACIÓN DE CMF Y SOFTWARE CMF SOF T BDS P CD3 CD4 CD8 CD19 CD ( ) 898 ( ) 437 ( ) 234 ( ) 187 ( ) BDD P 1375 ( ) 883 ( ) 408 ( ) 229 ( ) 195 ( ) CL ( ) 894 ( ) 413 ( ) 236 ( ) 182 ( ) CLTT 1327 ( ) 837 ( ) 420 ( )

35 LEUCODEPLECIÓN Remover los leucocitos de una UGRD o de C. plaquetarios con el fin de prevenir la aloinmunización a antígenos HLA Previene la repetición de reacciones febriles no hemolíticas Utilizado en pacientes poli-transfundidos

36 METODOLOGÍAS DE LEUCODEPLECIÓN En etapa pre-almacenamiento por filtros integrados a equipos de recolección En etapa post-almacenamiento (bed-side) por medio de filtros

37 LEUCO-COUNT Muestras de sangre Pre y Post filtración Recuento de GB automático o manual con cámara de Nageotte Se marca para CMF con IP (tinción para DNA/RNA) presente en células nucleadas ausente en GR y plaquetas Tubos Tru-Count para recuento absoluto de GB presente en las muestras. Controles 1.9 GB/ul +/- 1.5 (bajo) y 2.5 GB/ul +/- 1.5 (alto)

38 MUESTRA PRE FILTRADA

39 MUESTRA POST FILTRADA

40 Muchas Gracias

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