Introducción Principio del test
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- Aarón Arroyo Río
- hace 7 años
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1 El equipo ImmunoComb II VIH 1 & 2 TriSpot Ag-Ab es una prueba Inmuno Ensayo Enzimático para la determinación cualitativa y diferencial de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 y 2 (HIV-1 y HIV-2) y la detección simultánea del antígeno HIV-1 p24 en suero y plasma humano. Pueden realizarse treinta y seis pruebas con un equipo. Introducción El Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente del etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirido (SIDA). Se han distinguido dos tipos, VIH-1 y VIH-2, exhibiendo diferente prognosis y tasa de transmisión. Las rutas mayores de transmisión de VIH son el contacto sexual, la contaminación por sangre o los productos de sangre, y madre-a-recién nacido. El VIH infecta predominantemente los linfocitos CD4 los cuales juegan un papel importante en el sistema inmunológico humano. La disminución progresiva del nivel de CD4 durante el desarrollo de la enfermedad genera una condición de inmuno suprimido, facilitando las infecciones oportunistas con consecuencias fatales. El virus de VIH consiste en una molécula de ARN genómico asociada con una transcriptasa reversa, protegida por una cápsula y una envoltura. La envoltura del virus es el blanco mayor para la respuesta humoral de anticuerpos. El diagnostico serológico de la infección por HIV se basa en la detección especifica de la proteína de la envoltura de anticuerpos de HIV Recientemente se introdujeron estudios de de cuarta generación, donde se combinaron dos ensayos (test de anticuerpos y detección del GAG p24 del antígeno viral), La determinación simultanea de los dos marcadores reduce el periodo de seroconversión de 7 a 10 dias, ayudando a la detección temprana de la infección por HIV. Principio del test La prueba ImmunoComb II VIH 1 & 2 TriSpot Ag-Ab es un ensayo inmunoenzimático indirecto (EIA). La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente esta sensibilizado en cuatro puntos: Primer punto (bajo)- HIV-1 proteína recombinante de la envoltura ( la glicoproteína gp41 env) Segundo punto- HIV-2 péptido de la envoltura ( la glicoproteína gp36 env) Tercer punto- Anticuerpo monoclonal para la proteína p24 del HIV-1 Punto superior- Suero albumina bovina biotinilada (Control Interno) La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F), cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, moviendo el peine de una fila a otra, con un periodo de incubación en cada paso. Para comenzar la prueba, se agrega suero o al diluyente en los pozos de la fila A de la Bandeja de desarrollo. El peine se inserta entonces en los pozos de fila A. Los anticuerpos de Anti-VIH, en caso de estar presentes en las muestras, se unirán específicamente a los antígenos de VIH en los dientes del peine (Figura 1). Simultáneamente si está presente el antígeno p24 en la muestra este debe ser capturado por los anticuerpos antip24 en el tercer punto.los componentes no unidos son eliminados con el lavado en la fila B. En la fila C, los analitos capturados en los dientes deben reaccionar con antígenos HIV 1 y HIV 2 y anticuerpos anti-hiv 1 p 24 marcados con biotina. En la fila D un conjugado secundario (fosfatasa alcalina-estraptividina) debe reaccionar con el complejo biotina y con el control interno en el punto superior de cada diente. En la fila E se remueven los componentes no ligados. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con componentes cromogénicos. Los resultados son visibles como las manchas gris-azules en la superficie de los dientes del Peine. El equipo incluye un Control Positivo (que contiene anticuerpos a VIH-1, VIH-2 y antígeno anti HIV 1 p 24) y un Control Negativo que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente usado con el Control Positivo debe mostrar todas las 3 manchas grisazules y el diente usado con el Control Negativo debe mostrar la mancha del Control interno solamente. Este punto también debe aparecer en los demás dientes para confirmar que la muestra fue agregada, que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente.
2 Figura 1. Principio del test CONTENIDO DEL KIT PEINES El kit contiene 3 peines. Cada peines tiene 12 dientes (Fig 2). Cada peine esta sensibilizado en cuatro areas reactivas: Primer punto (bajo)- HIV-1 proteina recombinante de la envoltura ( la glicoproteína gp41 env) Segundo punto- HIV-2 peptido de la envoltura ( la glicoproteína gp36 env) Tercer punto- Anticuerpo monoclonal para la proteína p24 del HIV-1 Punto superior- Suero albumina bovina biotinilada (Control Interno) Los peines vienen en una envoltura de aluminio con un bolsa desecante BANDEJAS DE DESARROLLO El equipo contiene 3 bandejas de desarrollo cubiertos con una lámina aluminio. Cada bandeja de desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La bandeja de desarrollo consiste en 6 filas (A-F) de 12 pozos cada uno. Cada fila contiene lo siguiente: Fila A diluyente de muestra Fila B Solución de lavado Fila C antígeno biotinilado de la envoltura de HIV 1 y HIV 2 y anticuerpo biotinilado para HIV 1 p24 Fila D Streptavidin conjugada con fosfatasa alcalina Fila E solución de lavado Fila F sustrato cromogénico conteniendo 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato (BCIP) y nitro tetrazolio azul (NBT) Control positivo - 1 vial (tapa roja) de 1 ml plasma humano diluido inactivado por calory adicion de ß-propiolactona, positivo para anti-hiv1, anti-hiv2 y antígeno p4 recombinante. Control negativo -1 vial (tapa verde) de 0.15ml de plasma humano diluido inactivado con calor negativo para anticuerpos al HIV. Perforador - para la perforación de la lámina de aluminio que cubren los pozos en la bandeja de desarrollo.
3 Seguridad y Precauciones Este equipo sólo es para en el uso de diagnóstico de vitro. Los materiales Humanos usados en la preparación del equipo fueron analizados y se encontraron no-reactivos para antígeno de la hepatitis B, anticuerpos a VIH y a HCV. Ningún método da completa seguridad de ausencia de contaminación viral, todas las soluciones y todos los espécimenes humanos son potencialmente infecciosos. Utilice guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos aceptados en el laboratorio al trabajar con suero humano o plasma. No pipetee con la boca. Deseche de todos los espécimenes, Peines usados, bandejas de desarrollo, y los materiales usados con el equipo como bio peligrosos. No mezcle los reactivos de lotes diferentes. No use el equipo después de la fecha del vencimiento. Almacenamiento del Equipo El equipo se debe transportar entre 2-8 C. Durante su transporte el equipo se puede mantener a 30 C pero por periodos de tiempo que no excedan 48 horas. El control interno indicara que el equipo no sufrió daño durante su transporte. Guarde el equipo en su caja original a 2-8 C. Bajo estas condiciones, el equipo permanecerá estable hasta la fecha del vencimiento en la etiqueta. No congele el equipo. Despues de abiertos los peines y las bandejas no pueden usarse mas de tres veces Manejo de Espécimenes Usted puede analizar suero o plasma. Pueden guardarse los espécimenes durante 7 días a las 2-8 C antes de procesarlos. Para guardar por más de 7 días: congele los espécimenes a -20 C o más frío. Después de que los espécimenes de suero han descongelado centrifúgelos. Utilice el sobrenadante. Evite repetir congelado y descongelado. Procedimiento de la Prueba Equipos Necesitado Pipetas de precisión con puntas disponibles por distribuir 50 µl. Tijeras Cronómetro o reloj Preparando la Prueba Lleve todos los componentes, peines, reactivos y espécimenes a temperatura ambiente. Preparando las bandejas de desarrollo 1. Incube la bandeja de desarrollo en una incubadora a 37 C durante 20 minutos; o manténgala a temperatura ambiente (22-26 C) durante 3 horas. 2. Proteja la mesa de trabajo con papel absorbente para ser desechado como material bio peligroso al final de la prueba. 3. Los reactivos se mezclan invirtiendo la bandeja de desarrollo varias veces. Nota: No quite la lámina de la bandeja de desarrollo. Rompa la lámina usando la punta desechable de la pipeta o el perforador sig uiendo las Instrucciones de la Prueba. Preparando el Peine Precaución: Para asegurar el funcionando apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Rompa la bolsa de aluminio. Remueva el peine. 2. Usted puede usar el Peine entero y la bandeja de desarrollo o sólo una parte. Para usar parte de un Peine: a. Determinan cuántos dientes usted necesita por procesar los espécimenes y los controles. Usted necesita un diente para cada prueba. Cada diente muestra el código "83" del equipo, para facilitar la identificación de dientes aislados. b. Rompa el peine verticalmente o con las tijeras (vea la Figura 4) para destacar el número requerido de dientes (No. de pruebas que incluyen 2 controles). c. Guarde la porción sin usar del Peine a la bolsa aluminio (con la bolsa desecante). Cierre la bolsa herméticamente, por ejemplo con un sujetapapeles para que se mantenga la sequedad. Guarde el Peine en la caja del equipo original a las 2-8 C para usarlo más tarde.
4 INSTRUCCIONES DE LA PRUEBA Reacción de Antígeno-Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de desarrollo) 1. Tome 50 μl de muestra con la pipeta. Perfore bien la cubierta de aluminio de la fila A de la Bandeja de desarrollo con la punta de la pipeta o con el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución de la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 2. Repita paso 1 para los otros sueros, incluyendo uno para el control Positivo y el control Negativo proporcionado por el equipo. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta de cambio para cada muestra o control. 3. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia usted) en los pozos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pozos varios veces. b. Deje el Peine en la fila A durante exactamente 30 minutos. Ponga el cronómetro. Cerca del fin de 30 minutos, perfore la lámina de la fila B usando el perforador. No abra más pozos de los que necesite. c. Al final de 30 minutos, saque el Peine de fila A. Absorba el líquido adherido de las puntas de los dientes apoyándolos al papel absorbente limpio. No toque la superficie delantera de los dientes. Primer Lavado (Fila B) 4. Inserte el Peine en los pozos de la fila B. Agite: Vigorosamente retire e inserte el Peine en los pozos durante por lo menos 10 segundos para lograr el lavado apropiado. Repita la agitación varios veces durante el curso de 2 minutos; entretanto perfore la lamina de fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido como en el paso 3c. Unión del Conjugado Biotinilado (Fila C) 5. Inserte el Peine en los pozos de fila C. Mezcle como en paso 3a. Ponga el cronómetro durante 10 minutos. Perfore la lámina de la fila D. Después de 10 minutos, retire el peine y absorba el líquido. Unión Segundo conjugado ALP-Streptavidina (lfila D) 6. Inserte el Peine en los pozos de fila C. Mezcle como en paso 3a. Ponga el cronómetro durante 30 minutos. Perfore la lámina de la fila D. Después de 30 minutos, retire el peine y absorba el líquido. Tercer Lavado (Fila E) 7. Inserte el Peine en los pozos de fila que E. Agite durante 2 minutos. Entretanto perfore la lamina de fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorbe el líquido. Reacción de color (Fila F) 8. Inserte el Peine en los pozos de la fila F. Coloque el cronómetro por 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 9. Inserte el Peine de nuevo en la fila E. Después de 1 minuto, retire el Peine y permita secar al aire. Almacenamiento de Partes No usadas del Kit Bandeja de Desrrollo Si no uso todos los pozos de la bandeja de desarrollo, usted puede guárdelo para el uso futuro: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Equipo Vuelva a colocar la(s) Bandeja(s) de Desarrollo(s), Peine(s), perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperatura de 2 a 8 C. Resultados de la Prueba Validación Para confirmar que la prueba funciona propiamente y demostrar que los resultados son válidos, lo siguiente tres condiciones deben cumplirse (vea Figura 5): 1. El Control Positivo debe producir cuatro puntos coloreados gris-azules en el par de dientes del Peine. 2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control interno) en el diente izquierdo del par y ninguna otra punto. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior Control Interno) en el diente izquierdo del par. Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados no son válidos y las muestras y los controles deben ser reexaminados. Interpretación de los resultados 1. La sola apariencia del Control Interior indica que la muestra correspondiente es negativo para los anticuerpos a VIH-1 o VIH-2 y antígeno HIV- 1 p24 (figura 6a) 2. Una muestra con el punto bajo coloreado indica presencia de HIV-1 ( figura 6b) 3. Una muestra con el segundo punto coloreado indica presencia de HIV-2 ( figura 6c). A veces, altas concentraciones de anticuerpo anti HIV-2 pueden producir un punto secundario pueden considerarse resultados infectados con HIV-2 o co infección de HIV-1/HIV-2 ( figura 6d) 4. Una muestra con el tercer punto coloreado, indica presencia de antígeno HIV-1 p24 (figura 6e). El punto del antígeno p24 puede aparecer con el punto de anti-hiv 1 ( figura 6f) con el punto de HIV-2 ( figura 6g) o ambos (figura 6h)
5 Importante: Algún punto débilmente coloreado en un diente debe ser interpretado como reactivo En caso de un resultado indeterminado, recolectar nueva muestra y repetir el test Documentación de Resultados Cuando el color en el Peine es estable, los Peines pueden ser guardados para la documentación. Limitaciones El ImmunoComb II VIH 1 & 2 TriSpot Ag-Ab es un ensayo de tamizaje. La reactividad a los anticuerpos HIV-1/HIV-2 no debe ser considerada como un diagnostico de Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) o de la infección por HIV. La no reactividad no deber ser conclusiva del que paciente no se ha expuesto a la infección. Eficacia de la Prueba La característica del ImmunoComb II VIH 1 & 2 TriSpot Ag-Ab ha sido determinada en cuatro lugares de evaluación analizando pacientes con HIV- 1 y HIV-2 infección primaria aguda (PHI) y paneles de seroconversión comercial y con no infectados, donadores saludables y con otras enfermedades. Resultados tablas 1 y 2
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