Assurance GDS utiliza los últimos desarrollos en tecnología para lograr los mejores tiempos para resultados y precisión
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- Vanesa Hidalgo Córdoba
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2 Assurance GDS Assurance GDS utiliza los últimos desarrollos en tecnología para lograr los mejores tiempos para resultados y precisión Preparación de la muestra basada en IMS Sondas y primers altamente específicos Innovativa plataforma del instrumento giratoria
3 Avances en múltiples áreas Preparación de la muestra Sistema de reactivos Plataforma del Instrumento Precisión + Rapidez + Fácil de usar
4 Preparación de la Muestra
5 Separación Immunomagnética (IMS) Qué es IMS?: Separación Immunomagnética Anticuerpo específico captura y envuelve los organismos Captura anticuerpo cubierto con partículas paramagnéticas Separación imánes colectan y aislan partículas que cubrieron los organismos
6 Separación Immunomagnética (IMS) Mejora Ia pureza de la muestra: Reduce la microflora competitiva Aumento en especificidad Mejora la aislación del organismo target en cajas/platos con agar Mejora la selectividad de los enriquecimientos Remueve los inhibidores potenciales del PCR Residuos de alimento, sanitizantes, medios de cultivo, etc Incrementa la cantidad de ADN para el análisis Concentra los organismos target Provee 1-2 log de aumento en densidad de células post-enriquecimiento Mayor cantidad de ADN a analizar
7 Assurance GDS PickPen IMS PickPen IMS Muestra y partículas combinados en el pocillo del sample block La captura de partículas y envoltura del organismo es intrasolución Partículas son físicamente extraídas de la muestra Punta inmersa en la solución de lavado Partículas resuspendidas Transferencia al sistema de detección
8 Sistema de Reactivos
9 Amplificación Componentes requeridos : Target Secuencia específica de una cadena de ADN del organismo que estamos tratanto de detectar - ADN es la secuencia que es amplificada en el proceso de PCR A C T G A Primer - Cadena sencilla de la secuencia del ADN encontrada en el target - Responsable de iniciar el copiado de la secuencia del ADN target - Usado en pares Taq polymerasa -Enzima térmicamente estable y es la responsable de copiar el ADN target Nucleótidos (A, T, C, G) bloques constructores del ADN usados para juntar copias del ADN target
10 Amplificación Proceso Una reacción (ciclo): Paso 1 Desnaturalización del ADN A C T G A T G A C T Separación de las 2 cadenas cuando se calienta (95 C) A C T G A Step 2 - Primers T G A C T Los primers se unen a la secuencia complementaria del target cuando se enfría (55 C) Step 3 - Extensión A C T G A A C T A C T T G A C T La enzima Taq elabora nuevas cadenas de ADN (72 C) Step 4 Se repite el ciclo El proceso completo se repite con los cambios de temperatura.
11 Detección Análisis de Curvas de Fusión Detección es post amplificación No hay secuencia específica Todo el ADN produce señal con el Sybr Green Targets identificados por el punto de fusión; y en función a la secuencia de la longitud de la cadena Interferencia de primers y un alto grado de ruido de fondo
12 Detección Detección basada en la sonda Amplificación y detección coexistentes Secuencia específica Especificidad Adicional No es afectado por primers No es afectado por ADN extraños Señal discreta por el target y el Control Interno
13 Cómo funciona la sonda MGB Eclipse? h v Sonda en solución Acomodada al azar Marcador fluorescente inhibido Sonda ligada al target Se vuelve lineal Marcador fluorescente se expone MGB = Fluoróforo = Inhibidor = MGB Correlacion directa entre la cantidad de fluorescencia y la cantidad del target
14 Assurance GDS Sistema de Reactivos Beneficios de la sonda del Assurance GDS MGB mejora especificidad Permite secuencias mas cortas del target Previene uniones no deseadas Mejor discriminación del target No hay curvas de fusión Ahorras > 1 hora en tiempo de instrumento No hay interpretación subjectiva
15 Assurance GDS Sistema de Reactivos Beneficios de la sonda del Assurance GDS Detección específica del Target Control Interno Verdadero Juego de primer y sondas independientes Señales separadas Detección directa del target Relación 1:1 sonda-target
16 Plataforma del Instrumento
17 Termocicladores Tradicionales Formato Tradicional Bloque de Peltier basado calentar / enfriar Detección en un solo canal Limitaciones ciclos lentos aumentan el gradiente de temperatura Ciclos con temperatura inconsistente entre los pocillos Dependientes de un colorante no específico y del análisis de curvas de fusión
18 Assurance GDS Plataforma del Instrumento Assurance GDS Rotor-Gene TM Muestras acomodadas en un formato rotativo para calentamiento / enfriamiento directo Movimiento centrífugo con intercambio constante de aire Asegura temperatura uniforme a través de todas las reacciones Elimina los tiempos largos de gradiente de temperatura requeridos por los sistemas basados en bloques
19 Assurance GDS Plataforma del Instrumento Precisión mejorada Rotor-Gene controla las reacciones de PCR ya que es altamente consistente Produce resultados precisos y confiables Genera confianza # of cycles Test #
20 Assurance GDS Plataforma del Instrumento Resultados mas rápidos Paso del PCR Rotativo Bloque Tiempo ahorrado Tiempo que empieza la desnaturalización 3 min 10 min 7 min Tiempo típico de un ciclo <2 min 4 min -- Tiempo total ciclo (42 ciclos) 70 mins 170 min 100 min Curva de fusión 0 60 min 60 min TOTAL 75 min 240 min >2.5 horas!
21 Ventajas del Assurance GDS Preparación Muestra Sistema de reactivos Plataforma del Instrumento Velocidad IMS concentra el target = tiempos enriquecimientos mas cortos Sonda elimina curvas de fusión Eficiencia térmica disminuye tiempos del ciclo Especificidad IMS provee especificidad de Primer nivel Primer solo el target es amplificado Sonda - solo el target es detectado Sistema Multi Canal permite el uso de sondas altamente específicas Fácil de usar PickPen preparación de la muestra en tan solo Reactivos Liofilizados en los tubos de amplificación Resultados Definitivos sin la interpretación de 20 min Curvas de fusión Precisión IMS separa al target de los inhibidores del PCR Especificidad Dual de primers y sondas PCR Consistente reacción en cada tubo
22 Definición regulatoria de las Top STEC o Big Six La definición regulatoria de las Top STEC indica que son las E.coli que presentan una combinación del serogrupo O y los genes que definen la patogenicidad de las E.coli enterohemorrágicas. O Serogroups O45 O157 O103 Pathogenicity Genes O121 Serogroup O26 eae stx 1 or stx 2 STEC O111 O145 Immunological Genetic
23 Cómo definir el método de análisis?
24 Métodos Inmunológicos Serogrupos O Immunological Methods Solo EIA / la Lateral mitad de Flow la definición / ELFA O group does not indicate pathogenicity Métodos tipo ELISA, flujo lateral o tipo ELFA Many non-e. coli will cross react El E. grupo coli with O no correct indica patogenicidad O group may not Muchas contain no-e.coli one or more pueden of dar the reacción pathogenicity genes E.coli con el correcto grupo O puede no Only ½ of the definition contener uno o mas genes de patogenicidad. High rate of false positives Alta tasa de falsos positivos O157 O45 O103 Serogroup O121 O26 O111 O145 Immunological
25 Método Genético - PCR Genetic Methods PCR Solamente la mitad de la definición > >200 serotipos other serotypes de E.coli of E. tienen coli that uno contain o mas 1 de or los more genes of the terget. target genes stx genes are phage-encoded and highly mobile Muchas no E.coli pueden contener los genes Many target. non-e. coli can contain target genes Multi-Organism Alta tasa de falsos effect positivos no way to determine if all targets are present in a single organism Efecto multiorganismo, no hay forma de Only ½ of the definition determinar si todos los targets están High rate of false positives presentes en un solo organismo Genes de Patogenicidad eae Genetic stx 1 or stx 2
26 La solución es combinar los dos métodos Aislar los serogrupos O O157 O45 O103 Detectar los Genes de patogenicidad O121 Serogroup O26 eae stx 1 or stx 2 STEC O111 O145 Immunological Genetic
27 La solución de BioControl Building Block Immunomagnetic Separation (IMS) Top 7 IMS Capture (O26, O45, O103, O111, O121, O145 and O157) Top 6 IMS Capture (no O157) O157 IMS Capture No IMS Gene Target Combinations eae stx 1 + stx 2 eae + stx 1 + stx 2 eae + stx 1 + stx 2 + E. coli O157:H7
28 Assurance GDS MPX Top 6/7 STEC TOP 7 Enrichment: C in mehec IMS sample TEXT TEXT preparation* TEXT TEXT O103, O26, O145, O111, O121, O45, O157 PCR analysis for eae, stx 1, stx 2, and E. coli O157:H7 TOP 6 Enrichment: C in mehec IMS sample preparation* O103, O26, O145, O111, O121, O45 PCR analysis for eae, stx 1, and stx 2 * IMS Sample Prep concentrates target serogroups 12 hours min. TTR
29 Detección de Patógenos en la Práctica
30 Assurance GDS familia de pruebas: Salmonella Listeria spp. Listeria monocytogenes Cronobacter sakazakii E. coli O157:H7 (EHEC) Shiga Toxin Genes O157 MPX Top 7 STEC MPX Top 6 STEC
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32 Muchas gracias por su atención Karla Celada Ugalde Gerente México, AC y El Caribe Tel. (722) Nextel (55) karla@biocontrolsys.com BIOCONTROL Results Right Now
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