Tecnología de DNA recombinante I

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1 Tecnología de DNA recombinante I Base: capacidad de manipular moléculas de DNA en un tubo de ensayo Enzimas: Purificadas, con actividades conocidas y controladas DNA polimerasas Síntesis de DNA Nucleasas Ruptura de uniones fosfodiester Ligasas Síntesis de uniones fosfodiester Modificación de extremos Introducción de cambios en los extremos del DNA 1

2 DNA polimerasas DNA pol I E.coli Holoenzima Fragmento Kleenow DNA pol T4 DNA pol T7 DNA pol termoestables Síntesis de ADN - Rellenado de extremos simple cadena - Sondas radioactivas - Secuencia -PCR Síntesis de ADNc Rev. Transcriptasas 2

3 Nucleasas Exonucleasas Endonucleasas Reconocimiento de secuencias específicas en el DNA. Corte en sitios específicos y reproducibles Tipo II: Herramientas claves en técnicas de DNA recombinante. Más de 3500 enzimas distintas Secuencias de reconocimiento de 4, 5, 6 pb Palindrómicas Corte en sitio de unión dejando extremos 5 P y 3 OH Requieren Mg2+ 3

4 Endonucleasas de Restricción -Rol en la naturaleza: protección de las bacterias contra la infección de virus -Usualmente en combinación con 1 o 2 enzimas de modificación (ADN metiltransferasas): reconocen la misma secuencia en el ADN y metilan una de las bases en ambas cadenas. Sistemas Bacterianos de Restricción- Modificación (R-M) -Proteínas separadas con actividades independientes -Actividades en subunidades separadas -Actividades en dominios separados 4

5 Enzimas Tipo I -Complejas, con múltiples subunidades, con actividad de clivaje y modificación en la misma proteína. -Cortan el ADN al azar desde su secuencia de reconocimiento (+ de 1000nt) Enzimas Tipo III -Complejas, grandes, combinan actividades de restricción y modificación -Cortan el ADN fuera de la secuencia de reconocimiento y requieren 2 secuencias en direcciones opuestas en el mismo ADN. 5

6 Enzimas Tipo II - Cortan el ADN en posiciones definidas cercanas o dentro de la secuencia de reconocimiento. - Colección de proteínas no relacionadas, origen evolutivo diferente -Tienden a ser pequeñas Clivaje dentro de la secuencia de reconocimiento La mayor parte reconocen secuencias simétricas (unión al ADN como homodímeros). Algunas reconocen secuencias asimétricas (heterodímeros) (CCTCAGC BbvCI) Secuencias continuas (GAATTC EcoRI) o discontinuas (GCCNNNNGGC Bgl I) Enzimas Tipo IIs - Cortan el ADN fuera de la secuencia de reconocimiento - 2 dominios: dominio de unión y de clivaje -Reconocen secuencias continuas y asimétricas 6

7 Modificación de extremos DNA transferasas polimerasas sin templado (polya, polyt) Ligasa (fago T4) Polinucleótido Kinasa (fago T4) Fosfatasa alcalina (CIP) 7

8 Purificación de DNA Ruptura de la célula Célula animal: SDS Cél. Vegetal: congelamiento + mortero Bacteria: tratamiento químico + enzimático Remoción selectiva del DNA Unión del DNA a sílica en presencia de agentes desnaturalizantes (alta sal y ph) Elución Degradación y remoción de todos los componentes distintos al DNA Precipitación del DNA de la fase acuosa con alcohol y sal Extracción con solventes Tratamiento con RNasas 8

9 Hibridización Capacidad de 2 cadenas de Ácidos nucleicos de renaturalizar, depende del apareamiento específico entre las 2 cadenas. En solución ADN inmovilizado De acuerdo a las condiciones de hibridización se pueden aparear secuencias que no son perfectamente complementarias. 9

10 Separación de fragmentos de ADN producidos por digestión del ADN genómico con enzimas de restricción Electroforesis Separación de fragmentos de DNA por tamaño sobre una matriz sólida en un campo eléctrico Velocidad de migración inversamente proporcional al log del PM 10

11 Identificación de fragmentos del ADN genómico que contienen una secuencia específica (gen) Southern Blot Identificación de fragmentos de DNA con una sonda radioactiva 11

12 Southern Blot 12

13 Evaluación de la expresión génica Northern Blot Muestras de ARN inmovilizadas en una membrana. Sonda específica para analizar expresión de 1 gen Microarreglos Matriz con oligonucleótidos o clones de cdna específicos para genes conocidos (> spots) Sonda: ARNm marcado 13

14 Northern Blot 14

15 Microarreglos 15

16 Plásmidos Información genética no esencial Información beneficiosa para la bacteria en determinadas circunstancias resistencia a agentes antibacterianos (antibióticos, metales pesados, etc) Bactericina (colicina) Degradación de compuestos de C (tolueno) Iniciación de tumor (Agrobacterium) Nodulación (Rhizobium) Factores de virulencia (toxinas, adhesinas, etc)) 16

17 Características DNAdc circular (super-enrollamiento negativo) Tamaño 1 a 200kb Replicación autónoma Regulación de la replicación Número de copias definido + de 1 tipo de plásmido / célula (incompatibilidad) Rango de Huésped definido 17

18 Rango de huésped Bacterias en las que el plásmido puede replicar Definido por el ori Rango Estrecho (puc, pbr, pet) Amplio Rango (RK2, RSF1010) Capaces de expresar sus genes en distinto tipo de bacterias Codifican para todas las proteínas requeridas para la iniciación de la replicación 18

19 Plásmidos relajados Alto número de copias Número de copias Inhiben la replicación cuando se alcanza un cierto número de copias Plásmidos no relajados ( stringent ) Mecanismo preciso de regulación Col E1 RNA Plásmido R RNA + proteína Plásmido F Iterones 19

20 Vectores de clonado Pequeño facil aislamiento e introducción en células Alto número de copias Marcadores de selección selección de células Sitios únicos de reconocimiento de endonucleasas Sistemas de selección de vectores con y sin inserto pbr322 20

21 Vectores de clonado Basados en plásmidos de E.coli Basados en Bacteriófago lambda Copias/célula Tamaño inserto 0,1-12 kb kb Cósmidos kb Cromosoma artif. de levadura: YAC kb Basados en bacteriófago P kb BAC kb PAC kb Fósmidos kb 21

22 Bacteriófago lambda 22

23 Cósmidos 23

24 Yac 24

25 Bibliotecas Genómicas Una biblioteca genómica es un conjunto de clones, cada uno de los cuales contiene un fragmento del genoma de un organismo dado Representación completa de secuencias genómicas Construcción de una Biblioteca Genómica Clivado del Genoma en fragmentos Ligado de cada fragmento en un vector Introducción de cada vector recombinante en una bacteria 25

26 Tamaños de Bibliotecas genómicas humanas preparadas en distintos vectores Tipo de Vector Tamaño de inserto (kb) Número de clones* P = 95% P = 99% replacement Cosmid, fosmid P BAC, PAC YAC Mega-YAC

27 Representatividad de una biblioteca Genómica El tamaño de una biblioteca, necesario para que una determinada secuencia de interés esté representada, está determinado por el tamaño de los fragmentos clonados y el tamaño del genoma N= ln (1-P) / ln (1-I/G) N= número de clones que deben ser analizados P= Probabilidad de que un determinado segmento este representado en la biblioteca I= Tamaño promedio de los fragmentos insertos en el vector G= Tamaño del genoma En general: para aislar un fragmento de interés con una probabilidad del 99% se deben analizar un número de clones tal que I x N =4,6 veces el genoma 27

28 Mapa génico El mapeo genético está basado en la utilización de técnicas genéticas para construir mapas que muestran la posición de marcadores genéticos o de marcadores moleculares. Las técnicas genéticas incluyen experimentos de recombinación y estudio de pedigrees en humanos. Armado del mapa genético de un organismo (localización de genes en el genoma) por análisis de ligamiento entre distintos caracteres. Distancia génica basada en el porcentaje de ligamiento entre genes. Identifica la distancia entre mutaciones en términos de la frecuencia de recombinación Se asume crossing over al azar en todo el genoma, sin embargo no es asi. 28

29 Marcadores Génicos Alelos diferenciables fenotípicamente Visualmente Limitado número de fenotipos distinguibles visualmente Bioquímicamente Ej: grupos sanguíneos ABO, HLA Marcadores de DNA Características que no son genes, con al menos 2 alelos Sitios de restricción polimórficos (RFLP) Repeticiones de secuencias simples polimórficas Posiciones en el genoma con diferencias en 1 nucleótido (SNP) 29

30 RFLP Sitios de restricción polimórficos Solo 2 alelos posibles 30

31 RFLP screening 31

32 SSLP Fragmentos de secuencias repetidas de longitud polimórfica (número de repeticiones variable) Múltiples alelos Minisatélites (VNTR) Microsatélites (STR) 32

33 Minisatélites (VNTR) 33

34 34

35 SNP Posiciones en el genoma con diferencias en 1 nucleótido Potencialmente 4 alelos posibles Generalmente 2 alelos Genoma humano 1,42 x10 6 SNP ( RFLP) 35

36 SNP screening 36

37 Mapa Físico El mapeo físico utiliza técnicas de Biología Molecular para examinar directamente las moléculas de ADN para la construcción de mapas que muestran la posición de fragmentos de ADN (en general de secuencia desconocida) en el genoma. Mapa de restricción FISH: Hibridación in situ con sonda fluorescente STS: (sequence tag site) sondas de fragmentos pequeños sobre Biblioteca de DNA 37

38 38

39 39

40 40

41 Transferencia horizontal de información genética en bacterias 41

42 42

43 Transferencia del cromosoma bacteriano 43

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