Control de Calidad para el Laboratorio Clínico

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1 Año 10 julio Comunicación Trimestral del Grupo de Diagnóstico Clínico (CDG) de Bio-Rad Latinoamérica Control de Calidad para el Laboratorio Clínico Discrepancias del Grupo sanguíneo ABO: Causas y resolución Determinación de la Viremia y de la Concentración de la Proteína No Estructural 1 (NS1) en Pacientes Infectados con el Virus del Dengue en México Detección, diagnóstico y control de la diabetes mellitus sobre la base de una tabla de nueve campos: GBA,HBa1c, GPT

2 Discrepancias del Grupo sanguíneo ABO: Causas y resolución Extraido de la Indian Journal of Tranfusion Medicine Con autorización de los autores y editores. Extraido de la Indian Journal of Tranfusion Medicine Por: Vijay Kumawat M.D. Neelam Marwaha M.D.FAMS, Ratti Ram Sharma M.D Introducción El sistema ABO contiene cuatro fenotipos principales de ABO: A, B, O y AB. Los cuatro fenotipos están determinados por la presencia o ausencia de dos antígenos (A y B) en los eritrocitos. El sistema ABO también se caracteriza por la presencia o ausencia de anticuerpos generados naturalmente y que son denominados isohemaglutininas, dirigidos contra los antígenos A y B ausentes. Se cree que la fuente de inmunización de dichos anticuerpos naturales está en el intestino y por bacterias ambientales que se ha demostrado poseen estructuras como el ABO en sus paredes de lipopolisacárido 1. Las muestras de donadores se tipifican rutinariamente para ABO en el momento de la donación. Las muestras de los receptores son tipificadas en ABO antes de la transfusión. Para la realización del grupo ABO se requiere de ambos antígenos A y B (grupo directo) y para la búsqueda de isoaglutininas Anti-A o Anti-B en suero o plasma (grupo inverso o grupo en suero). Tanto el grupo directo como el inverso son requeridos en pacientes y donadores debido a que cada grupo sirve como una verificación del otro. Existe una discrepancia cuando los resultados del tipaje de antígenos no concuerdan con el grupo sérico. La discrepancia puede surgir debido a errores técnicos o condiciones clínicas del paciente. Todos los factores técnicos que puedan haber dado lugar a una discrepancia ABO deberán ser revisados y corregidos. También es esencial obtener información sobre la edad del paciente, diagnóstico, antecedentes transfusionales, medicamentos y antecedente de embarazo. Si existe una discrepancia puede ser debida a un error en la recolección o identificación de la muestra, por lo que deberá obtenerse una nueva muestra del paciente y repetir el grupo directo e inverso. Fuentes comunes de errores técnicos derivados de discrepancias de ABO Identificación inadecuada de la muestra de sangre, tubos de ensayo Mezcla de muestras Error administrativo Suspensión celular demasiado concentrada o demasiada diluida Falla en la adición de reactivo Falla en seguir las instrucciones del fabricante Reactivo de mala calidad, contaminado Falta de observación de hemólisis Centrífuga sin calibrar Material de vidrio sucio/contaminado Las discrepancias ABO pueden dividirse arbitrariamente en cuatro categorías principales: Grupo I Discrepancias Estos se asocian con reacciones inesperadas en el grupo inverso debido a reacciones débiles o falta de anticuerpos. Las discrepancias en este grupo incluyen: I. Bebés menores de 4 a 6 meses de edad 2,3 : Las aglutininas Anti-A y anti-b (IgM) producidas por el bebé se pueden observar en los primeros 3 a 6 meses 1,4. 1 El Anti-A y anti-b que están presentes en el suero del cordón son generalmente IgG de origen materno. El grupo inverso ABO en los bebés no se garantiza antes de los 6 meses de edad 2. II. Pacientes ancianos 5,6 : Estudios anteriores mostraron una disminución progresiva de los títulos de las aglutininas anti-a y anti-b con la edad, con bajos niveles (titulo de 4 o menos) siendo mas común en sujetos de 80 años de edad o más 5.7. Sin embargo en un estudio realizado por Maur et al 8 la disminución de títulos no fue observada. III. Severa hipogamaglobulinemia: El Anti A y Anti B están a menudo presentes en muy bajas concentraciones en pacientes con inmunodeficiencia hereditaria y en el raro Síndrome de Wiskott Aldrich ligado al cromosoma X 9. Anticuerpos anti-a y anti-b también pueden estar presentes en bajas concentraciones en pacientes inmunosuprimidos por terapia o enfermedad y en pacientes sometidos a intercambios intensos de plasma. IV. Transplante de HPC incompatible por ABO: transplante de Células Hematopoyéticas (HPC) incompatible por ABO con inducción de tolerancia por ejemplo un paciente de grupo A que recibe una médula ósea tendrá en circulación eritrocitos del grupo O pero únicamente producirá anticuerpos Anti B. V. En quimerismo: es decir, una persona con doble población de células de más de un cigoto. La presencia de dos poblaciones de glóbulos rojos de diferente grupo ABO puede llevar a la ausencia de anticuerpos 1. El Quimerismo de gemelos ocurre cuando las células madre hematopoyéticas migran entre puentes vasculares los cuales permiten la mezcla de sangre entre dos fetos. Los gemelos quiméricos tienen tolerancia inmunológica; no generan anticuerpos contra antígenos A ni B que estén ausentes de sus propios glóbulos rojos pero presentes en los eritrocitos del gemelo implantado. VI. Pacientes pediátricos recibiendo nutrición enteral o parenteral a largo plazo que es estéril y libre de bacterias 10. Se cree que la fuente inmunizante para que se

3 generen tales anticuerpos naturales esta en el intestino y las bacterias ambientales que se sabe poseen estructuras como el ABO sobre sus capas de polisacáridos 1. Resolución de discrepancias del Grupo I a. se puede resolver resaltando las reacciones débiles o sin reacción mediante la incubación del suero del paciente con células A1 y B a temperatura ambiente durante minutos. b. si no hay todavía ninguna reacción después de la centrifugación, la mezcla del suero-células se incuba a 40 C durante minutos. Nota: un autocontrol y control celular O siempre deben probarse para detectar la reactividad de otras aglutininas frías frecuentes ejemplo: anti I Grupo II discrepancias Estas se asocian con reacciones inesperadas en el tipaje directo debido a reacciones débiles de un antígeno o porque no esta presente. Las discrepancias en este grupo incluyen: I. Subgrupos de A o B 11 : subgrupos del antígeno A (Ax, Am, Ay, Ael) que no aglutinan o aglutinan déblimente por la mayoría de los anti A. Subgrupos del antígeno B(Bx, Bm, Bel) que no son aglutinados o aglutinan débilmente por la mayoría de los anti B. Ambos se presentan como discrepancias del grupo II. II. Leucemia puede debilitar un antígeno A o B 12 : en la leucemia aguda, el antígeno A puede debilitarse 13. A veces la sangre parece contener una mezcla de células del grupo A y Grupo O 14,15 ó de A1 y A débil 14. En otros casos los eritrocitos reaccionan débilmente con anti-a, incluso comportándose como A3 o Am 15. En un paciente con eritroleucemia, del grupo B, el 60% de las células no fueron aglutinadas por anti-b y parecían ser grupo O, pero eran realmente un B débil cuando se separó de las células B normales que absorben el anti-b 12. III. B Adquirido 16,17, fenotipos B(A) y A (B): El B adquirido resulta de la acción de la deacetilasa de bacterias que convierte la N- acetilgalactosamina a?-galactosamina, que es muy similar a la galactosa, el principal determinante de B. El segundo tipo de B adquirido que podría llamarse el antígeno pasajero es causado por adsorción de productos bacterianos tipo-b sobre las células A u O pero ocurre solamente in vitro 18. IV. Transfusión de grupo diferente o transplante de HPC con diferencias de grupo ABO: transfusiones de eritrocitos ABO compatibles pero no idénticos (ejemplo, eritrocitos del grupo O transfundidos a una persona de grupo A o B) dan como resultado un quimerismo inducido artificialmente. Transplante de células madre hematopoyéticas no compatibles con ABO (ejemplo, persona de grupo O trasplantada con médula ósea de grupo A o B, persona de grupo A o B transplantada con médula ósea de grupo O). V. Neutralización de reactivo anti A y anti B por altas concentraciones de sustancias solubles de A o B en suero con glóbulos rojos suspendidos en suero o plasma. VI. Quimerismo en gemelos fraternales, mosaicismo derivado de polispermia: quimeras tetra-gaméticas o dispérmicas presentes con quimerismo en todos los tejidos, se identifican más con frecuencia debido a infertilidad y raramente por poblaciones mixtas de glóbulos rojos. Resolución de Grupo II de discrepancias a. Las reacciones débiles con antisueros pueden ser resueltas mejorando la reacción del antígeno con su antisuero respectivo con incubación de la prueba a temperatura ambiente durante minutos. b. Subgrupos que causan discrepancias de grupo pueden resolverse mediante estudios de elución adsorción. c. El fenómeno de B adquirido puede resolverse mediante una disminución del PH del antisuero monoclonal. El Anti B en el suero de la persona B adquirido no aglutina con glóbulos rojos autólogos (autocontrol negativo). El estado secretor de una persona puede resolver el B adquirido, la saliva de una persona B adquirido contiene substancia A y no substancia B. El suero de una persona B adquirido contiene sustancia A. d. Alta concentración de sustancia A o sustancia B causante de discrepancias de grupo puede resolverse mediante el lavado de los glóbulos rojos con solución salina. Grupo III discrepancias Estos están asociados con anormalidades proteicas o de plasma, formación de rouleaux y pseudoaglutinación. Las discrepancias en este grupo incluyen: I. Elevado nivel de globulina de por ejemplo mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstorm o Linfoma de Hodgkin. II. Elevado nivel de fibrinógeno. III. Pequeños coágulos de fibrina en plasma o suero parcialmente coagulado puede ser confundido con aglutinaciones de eritrocitos en el grupo inverso. Muestra de paciente con una concentración anormal de proteínas en suero, suero alterado en el cociente de proteínas o expansores de volumen de alto peso molecular pueden causar agregación de glóbulos rojos y aparentar una aglutinación. El Rouleaux consiste en agregados de glóbulos rojos que se adhieren a lo largo de sus superficies planas, dando una apariencia al microscopio de monedas apiladas. Este Rouleaux se dispersará cuando se resuspenda en solución salina. Una aglutinación verdadera es estable en presencia de solución salina. Grupo IV discrepancias Estas discrepancias son debido a diversos problemas. Estos pueden ser debido a: I. Transfusión reciente de plasma de grupo diferente que contiene componentes. II. Aloanticuerpos fríos (Ej. anti M) o autoanticuerpos (Ej. anti I), autoanticuerpos dependientes de ph, anticuerpo dependiente de reactivo (por ejemplo EDTA, Parabenos) resultando en una reacción positiva inesperada.

4 III. Infusión reciente de Inmunoglobulina intravenosa (IvIg) que pueda contener isoaglutininas ABO. IV. Aglutinación de campo mixto con glóbulos rojos de más de un grupo ABO. V. Poliaglutinación resultante de anormalidades heredadas o adquiridas de la membrana de los glóbulos rojos con exposición de auto criptoantígeno 20 (Ej. activación T). La determinante T esta cubierta normalmente por ácido Nacetilneuramínico y por lo tanto puede ser descrita como criptoantígeno. El antígeno puede ser expuesto por la acción de neuraminidasas bacterianas o virales a Anti-T y anti-tn presentes en el suero de todos los sujetos excepto bebés, presumiblemente se forman como una reacción al T y Tn presente en muchas Vacunas y bacterias gramnegativas 20. Muchos organismos, incluyendo los neumococos, estreptococos, estafilococos, Clostridium, E. coli, Vibrio cholerae y el virus de la influenza son capaces de producir este efecto in vitro. La activación T puede ocurrir in vivo. Generalmente, esta poliaglutinabilidad se presenta como un fenómeno transitorio, desapareciendo dentro de pocas semanas o meses de la vez que se observó por primera vez, la activación T casi siempre se detectada al encontrar discrepancias entre los resultados de las pruebas de glóbulos rojos y los sueros durante el tipaje ABO. En la actualidad, los antisueros monoclonales anti-a y -B son ampliamente utilizados y así la activación T rara vez causa problemas durante un tipaje sanguíneo. Resolución de discrepancias Grupo IV a. Los autoanticuerpos fríos que causan reacciones falsas positivas en el tipaje directo pueden eliminarse mediante el lavado de eritrocitos con solución salina caliente. Si no se logra resolver con esto, se puede utilizar glicina ácida con EDTA o cloroquina para eliminar los autoanticuerpos. b. Autoaglutinación causante de reacciones falsas positivas en la prueba inversa pueden resolverse con la incubación a 37 C durante minutos. También puede ser resuelto con la incubación de los eritrocitos en presencia de Ditiotreitol o 2- Mercaptoetanol. c. Los aloanticuerpos inesperados en el suero del paciente aparte de las isoaglutininas causantes de discrepancias ABO se resuelve tan pronto sea identificado el anticuerpo (Ej. anti M), el grupo inverso debe ser repetido con células A1 y B que sean negativas para ese antígeno. d. Isoaglutininas ABO inesperadas que producen discrepancias de grupo (Ej.anti A1 en A2 o A2B) puede resolverse mediante la repetición del grupo inverso usando al menos 3 células A1, A2, B, O junto con un autocontrol. Los eritrocitos del paciente pueden ser tipificados con lectina anti A1 de dolichos biflorus para determinar los subgrupos del antígeno A. e. Un anticuerpo dependiente de reactivo (anticuerpo anti-acriflavina contra acriflavina utilizado en Anti B) causante de discrepancias de grupo deberá resolverse mediante el lavado de los glóbulos rojos de la persona con solución salina normal por lo menos 3 veces. Conclusión La principal razón de la importancia clínica del sistema sanguíneo ABO es la presencia obligatoria de isoaglutininas, anticuerpos naturales potentes dirigidos contra los Antígenos A y B ausentes en las membranas de los glóbulos rojos de los propios individuos (RBC). Por lo tanto, el fenotipo ABO de un individuo deberá ser determinado realizando tanto la prueba directa de los antígenos sobre la membrana RBC y la prueba en suero para analizar la presencia de isoaglutininas. Una discrepancia ocurre cuando los resultados de los antígenos de los glóbulos rojos no coinciden con el grupo en suero. Cuando una discrepancia es encontrada, los resultados deberán ser registrados, pero la interpretación del tipaje ABO deberá ser postergado hasta que se resuelva la discrepancia. Si la muestra discrepante proviene de un receptor de transfusión potencial y existiera una urgencia clínica, es mejor emplear del grupo O Rh compatible a sus glóbulos rojos en lo que la discrepancia se resuelve. Bibliografía 1. Race RR, Sanger R (1975) Blood Groups in Man, 6th edn. Oxford: Blackwell Scientific Publications 2. Fong SW, Qaqundah BY, Taylor WF. Developmental patternsof ABO isoagglutinins in normal children correlated with the effects of age, sex and maternal isoagglutinins. Transfusion 1974; 14(6): Grundbacher FJ. Genetics of anti-a and anti-b levels. Transfusion 1976; 16(1): Yliruokanen A. Blood transfusions in premature infants. Ann Med Exp Biol Fenn 1948; 26(Suppl.): 6 5. Somer H, Knhus WJ. Blood group antibodies in old age. Proc Soc. Exp. Biol. Med. 1974; 141: Grundbacher FJ. 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6 Determinación de la Viremia y de la Concentración de la Proteína No Estructural 1 (NS1), en Pacientes Infectados con el Virus del Dengue en México Resumen de los autores del artículo: Determination of Viremia and Concentration of Circulating Nonstructural Protein 1 in Patients Infected with Dengue Virus in Mexico. Por: Sergio I de la Cruz-Hernández, Hilario Flores-Aguilar, Silvia González-Mateos, Irma López-Martínez, Celia Alpuche-Aranda, Juan E Ludert y Rosa M del Angel. Am J. Trop. Med. Hyg., 88(3), 2013, pp La infección por el virus del dengue (DENV) cursa con 3 formas clínicas diferentes, fiebre por dengue (FDy las formas más severas de la enfermedad, fiebrehemorrágica por dengue (FHD) que puede progresar a síndrome de choque por dengue (SCD). Al no haber una vacuna o terapia antiviral eficiente para combatir la enfermedad por dengue, existe interés en identificar indicadores de riesgo para FHD. A este respecto, se han reportado niveles más elevados de NS1 en pacientes con FHD que en pacientes con FD, sugiriendo que los niveles de NS1 podrían funcionar como un indicador de FHD. El objetivo de este trabajo fue comparar los niveles de NS1 y carga viral en muestras de suero de pacientes mexicanos diagnosticados con FD y FHD y además, buscar correlaciones entre los niveles de NS1 circulante, carga viral y estatus inmunológico del paciente. La serotipificación y la carga viral se determinó por qrt-pcr; mientras que los niveles de NS1 se determinaron cuantitativamente por ensayos de ELISA, utilizando Platelia (BioRad) y una NS1 recombinante. Las muestras se clasificaron como FD y FHD con base al criterio clínico y a su vez, se clasificaron como infecciones primarias y secundarias mediante la identificación de anticuerpos anti-dengue de tipo IgG, utilizando Dengue IgG Capture ELISA (PanBio). Los resultados muestran que de 225 muestras, 126 fueron positivas a DENV1 y 99 positivas a DENV2. La carga viral fue más baja en FHD que en FD; sin embargo, los niveles de NS1 de DENV1 fueron más elevados en FHD que en FD. La mayor parte de las infecciones por DENV1 y DENV2 fueron primarias. A este respecto en pacientes infectados con DENV2, los niveles de NS1 y carga viral, fueron más elevados en infecciones primarias que en secundarias. Los resultados sugieren que los niveles de NS1 y carga viral en muestras de suero de pacientes infectados con DENV, varían de a cuerdo al cuadro clínico, al serotipo infectante y al tipo de infección.

7 Detección, diagnóstico y control de la diabetes mellitus sobre la base de una tabla de nueve campos: GBA, HBa1c, GPT Versión actualizada del artículo publicado en la Revista Latinoamericana de Patólogía Clínica, Volúmen 59, Número 2, pp 69-79, Abril-Junio 2012 Por: Dr. Arturo M Terrés-Speziale Resumen Antecedentes: Ha pasado medio siglo desde el descubrimiento de HBa1 como un componente diabético en las subfracciones de la hemoglobina. Grandes mejoras han ocurrido en los sistemas diagnósticos desde 1977 cuando se introdujo HBa1 en los laboratorios clínicos. Pasaron más de 30 años hasta que HBa1c% fue estandarizado por el National Glycohemoglobin Standardization Program, para que finalmente la Asociación Americana de Diabetes lo aceptara en el año 2010 como el método de elección para el diagnóstico de diabetes mellitus, siempre y cuando se utilicen métodos certificados por NGSP. Objetivo: Revisar la importancia de glicación de proteínas en la fisiopatología de las enfermedades cronicodegenerativas asociadas a la diabetes mellitus, además de la aplicabilidad y utilidad de HBa1c% en el diagnóstico conforme a las recomendaciones de la Asociación Americana de Diabetes 2010, aplicando una tabla de contingencia de 3 x 3. Material y métodos: Se trata de un artículo de revisión en el que se recopila la información disponible en la literatura para establecer metas analíticas específicas, medibles, alcanzables, retadoras, para las pruebas fundamentales para la detección, diagnóstico y control de diabetes mellitus, incluyendo a 1) HBa1c%, 2) Glicemia basal en ayuno: GBA mg/dl y 3) Glicemia promedio trimestral: GPT mg/dl. Resultados: HBa1c > 6.5% en combinación con GBA > 126 mg/dl tiene una sensibilidad de 47% y una especificidad de 98% para la detección de la diabetes, por lo que para incrementar la sensibilidad diagnóstica es conveniente que la detección de la diabetes mellitus se realice en todos los pacientes que tengan una GBA >100 mg/dl, aun cuando no presenten las «4-P» del síndrome diabético: poliuria, polidipsia, polifagia, pérdida de peso. Discusión: La certificación de la trazabilidad analítica de los sistemas de diagnóstico de la NGSP. permitió que HBa1c% alcanzara los niveles de confiabilidad y aplicabilidad básicos para permitir el uso de esta prueba en el diagnóstico clínico. La aplicación de los nuevos criterios diagnósticos de la Asociación Americana de Diabetes 2010 resultan relativamente simples, sobre todo cuando se les compara con las pruebas de tolerancia a la glucosa en términos de confiabilidad y aplicabilidad. Valdrá la pena vigilar y evaluar el impacto en los pacientes y en el sistema de salud para valorar el costo-beneficio a corto, mediano y largo plazo. Abstract Background: It s been half a century since the discovery and confirmation of HBa1 as a diabetic component in the subfractions of hemoglobin. Major improvements have occurred in diagnostic systems since 1977 when HBa1 was introduced in clinical laboratories. It took more than thirty years until HBa1c% was certified by the National Glycohemoglobin Standardization Program until 2010 when the American Diabetes Association accepted HBa1c% as the method of choice for the diagnosis of diabetes mellitus as long as certified methods are used in order to meet NGSP requirements. Objective: To review the importance of glycation of proteins and specifically of HBa1c% in the pathophysiology of chronic degenerative diseases associated with diabetes mellitus in addition to its applicability and usefulness in the diagnosis and management in accordance with the recommendations of the American Diabetes Association 2010 using a table contingency of 3 x 3. Material and methods: This paper is a review which collects the information available in the literature in order to establish analytical, specific, measurable, achievable, challenging goals for three fundamental tests for the detection, diagnosis and control of diabetes mellitus including 1) HBa1c%, 2) Basal Fasting Glucose: BFG mg/dl and 3) QAG Quarterly Average Glucose mg/dl. Results: HBa1c% > 6.5% in combination with BFG > 126 mg/dl has a sensitivity of 47% and a specificity of 98% for diabetes mellitus diagnosis. To improve diagnostic sensitivity detection of diabetes mellitus should be performed in all patients who have a GBA > 100 mg/dl even when the diabetic syndrome: Polyuria, polydipsia, polyphagia, and weight loss is absent. Discussion: NGSP certification of analytical systems for diabetes mellitus diagnosis of HBa1c% has allowed basic applicability in order to recommend the use of this test in clinical grounds. The implementation of the new diagnostic criteria of the American Diabetes Association 2010 are relatively simple, especially when compared with tests of glucose tolerance in terms of reliability and applicability. It will be worth monitoring and evaluating the impact on patients and the health systems to assess the cost / benefit in the short, medium and long term.

8 Introducción Patología Clínica es la disciplina médica a través de la cual la ciencia y la tecnología del laboratorio se aplican para la toma de decisiones médicas en tres elementos bien definidos, incluyendo el diagnóstico, el pronóstico y la vigilancia del tratamiento. 10 El laboratorio es un elemento fundamental de los servicios de salud ya que en éste se desarrollan labores asistenciales, docentes y de investigación. El motivo por el que el médico solicita apoyo del laboratorio se puede resumir en uno solo. Necesita información confiable y oportuna para tomar decisiones seguras en beneficio del paciente en términos de efectividad, eficiencia y eficacia. El médico observa en el paciente una serie de manifestaciones de enfermedades, incluyendo signos y síntomas, los cuales, para ser objetivos y cuantitativos, requisito básico del método científico, deben ser traducidos a datos cuantitativos. El diagnóstico oportuno, basado en evidencia, es la piedra angular del manejo efectivo y eficaz de las enfermedades, dentro del cual el laboratorio clínico juega un rol fundamental. Se calcula que, en los países desarrollados, más de 80% de las decisiones médicas se toman sobre la base de las pruebas de laboratorio con un costo de menos de 30% y que esta tendencia se sigue incrementando. Para utilizar el laboratorio de manera adecuada es necesario: Saber específicamente qué estamos buscando: detección, diagnóstico, pronóstico o control? Conocer el laboratorio al que solicitamos estudios: con qué equipo cuentan? Qué preparación tiene el personal que labora en él? Cómo es su programa de control de calidad? Conocer los exámenes disponibles: en muchas ocasiones se emplean recursos rutinarios por desconocer que se dispone de estudios especiales. Del mismo modo, se pueden solicitar pruebas con las que no se cuenta y que podrían ser sustituidas por otras determinaciones igualmente útiles. Conocer los límites de referencia: éstos varían, dependiendo del tipo de metodología que emplea el laboratorio. Las cifras normales se deben establecer con bases estadísticas en la población atendida. Conocer los niveles de decisión clínica: organismos internacionales se reúnen periódicamente para establecer el riesgo de los diferentes niveles de pruebas como glicemia, glicohemoglobina, colesterol, triglicéridos, etcétera. Estableciendo recomendaciones de tipo preventivo las cuales se esperan tengan un impacto benéfico en el riesgo individual de los pacientes y en la salud pública. 24,25 7 Conocer las limitaciones de las pruebas: debemos reconocer que el laboratorio clínico no puede reemplazar a la buena clínica, ya que no existen pruebas 100% sensibles ni 100% específicas. Existen pruebas capaces de orientar hacia la etiología del padecimiento, mientras que otras pruebas evalúan los procesos fisiopatológicos. Prestar atención a los resultados: existe evidencia de que en muchos casos no se presta la atención debida a los datos de laboratorio. Solicitar aclaración oportuna sobre los datos que parezcan cuestionables: los médicos y los químicos del laboratorio clínico son las personas más indicadas para revisar los datos que requieran verificación. En el contexto antes mencionado es oportuno señalar que en muchas instituciones de atención médica se desconoce o subestima la importancia de contar con métodos avanzados para evaluar el estado bioquímico de los pacientes diabéticos utilizando glicohemoglobina HBa1c%, una prueba que es capaz de reflejar el estado de la glicemia promedio de varias semanas previas al estudio, por lo que consideramos conveniente revisar, clarificar y difundir los conceptos sobre este importante tema. 1-4 Está plenamente demostrado que la diabetes mellitus representa un serio problema de salud pública en México, 15 donde es ya la primera causa de muerte en la población general. Se calcula que en nuestro país hay más de cuatro millones de pacientes, de los cuales más de un millón aún no han sido diagnosticados. Se estima que existe intolerancia a la glucosa en 20% y que hay diabetes mellitus en cerca de 10% de la población adulta mayor 40 años, y que por cada diabético conocido existe uno desconocido, destacando que la frecuencia en las zonas metropolitanas supera hasta en dos veces la de las zonas rurales. Diabetes mellitus es un padecimiento conocido hace más de 3,000 años del cual se encuentra descripción en el papiro egipcio de Smith que data de 1,500 a.c. Es el trastorno metabólico más frecuente del ser humano; su frecuencia en la población general es difícil de establecer ya que ha ido aumentando con el paso del tiempo y con la edad, sin dejar de lado que los criterios diagnósticos también han ido cambiando con el progreso de la medicina. Se considera que su frecuencia global es mayor de 1%. Está bien demostrado que la combinación de glicación de proteínas, hiperlipidemia, inflamación subclínica y oxidación por radicales libres representa en conjunto un riesgo aterogénico y coronario que debe ser perfectamente identificado y controlado de manera temprana antes de que surjan complicaciones cronicodegenerativas. 5,8 Hoy sabemos que la diabetes mellitus es un trastorno metabólico caracterizado por deficiencia real o relativa de insulina, hiperglicemia y alto riesgo para el desarrollo de problemas sistémicos que se manifiestan preferentemente en ojos, riñones, nervios periféricos, corazón y vasos sanguíneos. Diabetes mellitus es una enfermedad que evoluciona silenciosamente durante más de 20 años, a través de un síndrome de envejecimiento prematuro hasta producir una serie de problemas y complicaciones que pueden llevar a la muerte a través de entidades: Neurológicas: neuropatía periférica y accidente vascular cerebral. Oftálmicas: retinopatía y cataratas. Cardiacas: arteriosclerosis e infarto.

9 La detección temprana y el diagnóstico confiable de la diabetes mellitus es un reto prioritario en medicina preventiva y salud pública. La diabetes es un problema que puede ser aparentemente silencioso por un lapso de 10 o más años. Esperar a que se presenten signos neurológicos, ceguera, cardiopatía, insuficiencia renal, insuficiencia vascular periférica, etcétera, es un error imperdonable desde el punto de vista individual y de salud pública. Es necesario que los médicos y la población en general estemos más y mejor informados ya que de seguir esperando a que crezca la epidemia silenciosa de la diabetes mellitus, seguiremos propiciando que en un futuro nuestro país caiga en una situación catastrófica que resulte incapaz de cubrir los elevados costos inherentes al manejo médico y quirúrgico de las complicaciones cronicodegenerativas. Glicación de proteínas, aterogénesis, oxidación e inflamación La glicación de las proteínas es un proceso bioquímico que ocurre en todo el cuerpo humano, dependiendo del nivel de la glicemia, y que puede ser fácilmente evaluado en el torrente sanguíneo a través de la medición de los niveles de HBa1c. Ocurre en forma pasiva por mecanismos no enzimáticos, de manera continua e irreversible, influyendo decisivamente en el proceso de envejecimiento celular y tisular. El daño producido por la glicación puede ser potenciado por otros cuatro mecanismos asociados como son aterogénesis, oxidación, inflamación e hipercoagulabilidad, los cuales son en gran medida dependientes de la hiperlipidemia, los niveles de radicales libres y la presencia de diversos reactantes de fase aguda dentro de los que destaca la proteína C reactiva, respectivamente. Los cuatro procesos en conjunto condicionan daño y disminución progresiva del funcionamiento normal de células y tejidos, empezando por el sistema microvascular, lo que repercute en los sistemas nervioso, cardiovascular, renal y vascular periférico, lo que provoca que diabetes mellitus sea la primera causa de muerte dentro de las enfermedades cronicodegenerativas incluyendo, accidente vascular cerebral, infarto agudo del miocardio, insuficiencia renal, etcétera. Hemoglobina glicada HBa1c Han pasado cinco décadas desde que en 1962 Huisman y colaboradores 2 reportaron incremento en una de las fracciones menores de la hemoglobina en cuatro pacientes con diabetes mellitus. En 1968, para detectar hemoglobinas anormales en cerca de 1,200 pacientes de la Universidad de Cambridge, Samuel Rahbar y su grupo 3 se percataron que dos pacientes con antecedentes de diabetes mellitus mostraban movimiento anormal en una de las fracciones de la hemoglobina, esto los impulsó a estudiar a 47 personas con descontrol glucémico por diabetes mellitus y les permitió describir una banda anormal a la que llamaron «componente diabético» de la hemoglobina. 4 Posteriormente se demostró que el «componente diabético» tenía características cromatográficas muy similares a la hemoglobina glicada HBa1c% que ya había sido descrita por Schnek y Schroeder en 1961, 1 quienes en ese entonces no sospecharon que existía relación fisiopatológica con la hiperglicemia que le es característica. En la actualidad está plenamente demostrado que la glicación de las proteínas se puede evaluar de manera práctica y confiable a través de la cuantificación de la glicohemoglobina HBa1c%. La glucosa, al estar irreversiblemente unida la hemoglobina, genera las moléculas que denominamos «AGE» (Advanced Glycated End Products), los cuales, por ser los productos avanzados y terminales de la glicación no enzimática de las proteínas, permiten estimar el nivel promedio de glicemia 90 a 120 días previos a la toma de la muestra.5 La cuantificación porcentual de HBa1c permite una estimación rápida y confiable de la glicemia promedio trimestral, utilizando la fórmula: GPT = (HBa1c% x 30) 60. El análisis de los datos de DCCT (Diabetes Clinical Complications Trial) 7,9 demostró, en una muestra de 1,439 casos, que existe correlación lineal de Pearson de 0.82 con regresión lineal conforme la fórmula GPT = (HBa1c% x 35.6) - 77 (cuadro I). En tres estudios internacionales multicéntricos llevados a cabo en la última década del siglo XX en los Estados Unidos (DCCT), Inglaterra (UKPDS) y Japón (Kumamoto), 18 claramente se demostró que el riesgo para el desarrollo y la progresión de las complicaciones crónicas de diabetes mellitus está estrechamente relacionado con el grado de control de la glicemia, lo que se puede evaluar de manera confiable sobre la base de determinaciones de la glicohemoglobina HBa1c% en forma trimestral. En conjunto, en los tres estudios quedó demostrado que por cada cambio de 1% en HBa1c% ocurre un cambio de aproximadamente 30 mg/dl de glicemia promedio trimestral y que la disminución de 1% Cuadro I. Correlación de la glicohemoglobina HBa1c% con la glicemia promedio trimestral utilizando la fórmula simplificada GPT = (HBa1c% x 30) HBa1c% GPT mg/dl GPT = (HBa1c% x 30) - 60

10 en HBa1c% produce una reducción promediada de 25% en la morbilidad y mortalidad. De tal manera que ya no queda duda sobre la importancia de la evaluación de la glicohemoglobina HBa1c, la cual refleja la concentración promedio de glucosa sanguínea de los últimos tres meses: Tiene un enorme potencial para el diagnóstico de diabetes mellitus. Refleja el grado de control de la glicemia en el paciente con diabetes mellitus. Es el indicador temprano de enfermedades crónicas degenerativas. Es un excelente marcador biológico para la vigilancia epidemiológica. Certificación de la trazabilidad para la vigilancia epidemiológica y el diagnóstico clínico Establecer metas alcanzables y retadoras es el primer paso en cualquier sistema de control. Contar con métodos y herramientas adecuados es el siguiente: Una disposición del Código de la Salud de la Ciudad de Nueva York donde los ancianos, los negros, los hispanos y los miembros de algunos otros grupos étnicos son desproporcionadamente afectados entró en efecto en enero de 2006, obligando a los laboratorios clínicos a informar los resultados de HBa1c% al Consejo de Salubridad de la ciudad como un método para llevar a cabo la vigilancia epidemiológica de diabetes mellitus, utilizando métodos certificados por el National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) 13,19 Sobre la base del impacto positivo que tendría la estandarización de las determinaciones de HBa1c% en el cuidado de pacientes diabéticos, la Asociación Americana de Química Clínica (AACC) estableció un subcomité para la estandarización de HBa1c% en abril de La meta del subcomité fue la de desarrollar un plan para la estandarización de HBa1c% que permitiera, en última instancia, que los laboratorios clínicos individuales relacionen sus resultados del análisis con las conclusiones de los Protocolos DCCT, donde se ha establecido que la correlación de los valores de HBa1c% con los de la glicemia correlacionan bien con el riesgo de desarrollar las complicaciones crónico-degenerativas que acompañan a la diabetes mellitus. El NGSP comenzó a mediados de 1996 y es patrocinado en parte por la ADA, para estandarizar determinaciones de la prueba de HBa1c% a los valores de la DCCT. Los fabricantes de sistemas para esta determinación deben obtener un certificado anual (figura 1) que certifique su trazabilidad al método de referencia de DCCT que es el método HPLC (figura 2). Este método, además de ser el de mayor confiabilidad dada su precisión y exactitud, permite detectar y cuantificar diversas fracciones de la hemoglobina, lo que con métodos menos confiables, como son los inmunométricos y bioquímicos, puede causar errores diagnósticos en pacientes con hemoglobinopatías (drepanocitosis y talasemias). Los resultados de la HBa1c% en pacientes con HbSS, HbCC y HbSC se deben interpretar con precaución cuando se utilizan métodos distintos al de referencia, que como se mencionó es HPLC. Es claro que los métodos cromatográficos en los que se pueden determinar todas las fracciones de la hemoglobina son más confiables que aquellos en los que sólo se reporta HBa1c como una cifra porcentual. Grandes mejoras han ocurrido en los sistemas de medición de HBa1c% desde que se introdujo en los laboratorios clínicos, alrededor del año En aquel entonces, los métodos utilizados mostraban imprecisión y no existían calibradores o materiales adecuados para realizar un buen control de calidad, por lo que pronto se hizo aparente la diferencia significativa en los resultados producidos por diferentes laboratorios. Era evidente que la disparidad en los resultados se debía a la gran gama de métodos utilizados; comparar los resultados entre los distintos laboratorios era imposible. Por lo que tuvieron que pasar más de tres décadas para que el método fuera estandarizado por el NGSP para que finalmente la Asociación Americana de Diabetes (American Diabetes Association, ADA) lo aceptara en enero del 2010 como el método diagnóstico de elección, siempre y cuando los laboratorios utilicen métodos certificados que cumplan los requisitos del NGSP antes descritos. 13,19,23,25 9

11 Figura 2. Diagrama de trazabilidad y validación de la National Glycohemoglobin. Standardization Program (NGSP). Para obtener el certificado anual de trazabilidad de la NGSP se debe cumplir con los siguientes requisitos: Ser específico para HBa1c. Estar libre de interferencias. Rango de referencia 4.0 a 6.0%. CV de < 5.0%. En la actualidad, para la vigilancia epidemiológica de la diabetes mellitus conforme a las disposiciones del estado de Nueva York 2006 y para el diagnóstico de diabetes mellitus clínico conforme a la Asociación Americana de Diabetes 2010, se exige la utilización de métodos con trazabilidad certificadas por NGSP Diagnóstico clínico Desde la perspectiva de la Norma ISO15189:2003 «Requisitos Particulares para la Calidad y la Competencia de los Laboratorios Clínicos» 16,17 en la que se enfatiza la importancia de la trazabilidad para los métodos de referencia, además de la medición de la variabilidad biológica y analítica 17,20,21 para alcanzar la relevancia médica, el punto clave para lograr el control confiable y oportuno de la diabetes mellitus se encuentra precisamente en el laboratorio clínico, donde es clara la necesidad de contar con metas analíticas para el control de calidad que estén basadas en la variabilidad biológica, ya que la relevancia médica de los resultados depende no sólo de un buen control de calidad analítico, sino sobre todo de la buena selección de la tecnología y de métodos diagnósticos capaces de alcanzar las metas analíticas hasta el nivel Six Sigma. 12,20-22 Establecer metas analíticas alcanzables y retadoras es el primer paso en cualquier sistema de control; es importante reconocer que las metas no sólo son útiles como herramientas de trabajo por los laboratorios clínicos para reducir el nivel de incertidumbre de los métodos diagnósticos, por lo que es indudable su relevancia médica desde el punto de vista clínico (cuadro II). Para establecer las metas analíticas en el laboratorio clínico es indispensable considerar a la variabilidad biológica como el marco de referencia fundamental sobre el cual se van a definir los requisitos de precisión. Como se puede observar en el cuadro I, partiendo de la base de los límites de referencia de las tres pruebas fundamentales para el diagnóstico y control de la diabetes mellitus, es posible establecer las metas analíticas de todas ellas en conjunto. En este cuadro 10

12 Cuadro III. Metas analíticas para la glicemia basal en ayuno, HBa1c% y glicemia promedio trimestral como requisitos para aplicar las tres pruebas en el diagnóstico de la diabetes mellitus. Metas analíticas para el diagnóstico de diabetes mellitus GBA HBa1c GPT = (HBa1c% x 30) - 60 Glicemia basal en ayuno Glicohemoglobina Glicemia promedio trimestral Pruebas de laboratorio mg/dl % mg/dl Límites de referencia Máximo Mínimo Variabilidad biológica grupal X Rango Desv.estándar CV%:Tonks 8.8% 9.1% 14.3% Variabilidad biológica individual Máximo Mínimo Metas analíticas Aspen 4.4% 4.5% 7.1% Six sigma 1.5% 1.5% 2.4% se puede observar que el nivel que denominamos Nivel Tonks corresponde a la variabilidad biológica grupal, la cual corresponde a 1/4 del rango normal, mientras que la meta analítica del «Nivel Aspen» corresponde a 1/2 del Tonks y la meta analítica del nivel Six Sigma equivale a 1/6 del mismo «Nivel Tonks». Es claro que mientras más precisa sea la prueba analítica más confiable será el diagnóstico clínico, por lo que resulta fundamental hacer una buena comparación de los sistemas disponibles para elegir el mejor en términos de confiabilidad y aplicabilidad, dejando el costo en segundo término porque lo «barato» puede salir «caro» a la larga. Como se puede observar, el requisito de precisión analítica la NGSP para HBa1c%, que es de menos de 5.0%, corresponde con la variabilidad biológica individual, que también es de 5.0%; por lo que la meta analítica del nivel Aspen, que es de 4.5%, aunque más exigente, resulta más conveniente. Sobre la base de las metas analíticas se debe exigir que las pruebas para determinar glucosa mg/ dl y HBa1c% sean capaces de lograr el nivel Aspen, lo que significa que deben ser capaces de alcanzar coeficientes de variación analítico de menos de 5.0% cuando se estén midiendo niveles dentro del rango normal, porque sólo de esta manera se podrá estimar una glicemia promedio trimestral con una precisión de menos de 8.0%. mg/ dl tiene sensibilidad de 47% y especificidad de 98% para la detección de la diabetes (Diabetes Online, Sept. 2010), por lo que para incrementar la sensibilidad diagnóstica es conveniente que la detección de la diabetes mellitus se realice en todos los pacientes que tengan glicemia basal en ayuno (GBA) mayor de 100 mg/dl, aun cuando no presenten las «4-P» del síndrome diabético: poliuria, polidipsia, polifagia, pérdida de peso. Etapa 1. Detección: Clínica 4-P: Presente o ausente GBA: Glicemia basal en ayuno > 100 mg/dl Etapa 2. Confirmación: Clínica 4-P: Presente GBA: Glicemia basal en ayuno > 126 mg/dl HBa1c: Hemoglobina glicada > 6.5% GPT: Glicemia promedio trimestral mg/dl > 135 mg/dl Para el diagnóstico diferencial sobre la base de los niveles de decisión clínica conforme al método descrito por Statland, 6,11 referimos al lector al cuadro III y a la figura 3. Cuadro III. Niveles de decisión clínica para el diagnóstico diferencial de la diabetes mellitus. Límites de referencia para tres pruebas: GBA mg/dl, HBa1c%, GPT mg/dl. Diagnóstico GBA mg/dl HBa1c% GPTmg/dL Diabetes mellitus > 125 > 6.5 > 135 Prediabetes intolerancia a la glucosa Sano < 100 < 6.0 < 120 Abreviaturas: GBA = Glicemia basal en ayuno. GPT = Glicemia promedio trimestral: (HBa1c% x 30) 60. Diagnóstico de diabetes mellitus: la tabla de los nueve campos El incremento en los costos de la atención médica obliga a valorar el costo/ beneficio de los estudios que se realizan a los pacientes. Dado que no siempre se cuenta con recursos económicos suficientes para aplicar todas las pruebas a todas las personas, es conveniente establecer una estrategia que permita obtener el máximo de información posible con lo que se dispone para hacer el diagnóstico en dos etapas, utilizando las pruebas más sensibles en la etapa de detección y dejando las pruebas más específicas para confirmar el diagnóstico. Resultados de los análisis poblacionales realizados en la Escuela de Salud Publica de John Hopkins en Baltimore, Maryland, Estados Unidos, indican que un nivel de HBa1c < 6.5% en combinación con una glicemia basal en ayuno (GBA) > Figura 3. Tabla de los nueve campos para el diagnóstico diferencial de la diabetes mellitus.

13 Conclusiones La certificación de la trazabilidad analítica de los sistemas de diagnóstico de la NGSP permitió que HBa1c% alcanzara los niveles de confiabilidad y aplicabilidad básicos para permitir el uso de esta prueba en el diagnóstico clínico. La aplicación de los nuevos criterios diagnósticos de la Asociación Americana de Diabetes 2010 resultan relativamente simples, sobre todo cuando se les compara con las pruebas de tolerancia a la glucosa en términos de confiabilidad y aplicabilidad. Es indispensable que los métodos del laboratorio seleccionados para el diagnóstico, control y vigilancia médica cumplan los requisitos de las metas analíticas en el nivel Aspen para que las decisiones médicas sean confiables y seguras en beneficio de los pacientes. Es necesario establecer programas que permitan vigilar y evaluar el impacto de las recomendaciones en el sistema de salud, pero sobre todo en los pacientes para valorar el costo-beneficio a corto,mediano y largo plazo. Retos 1. Diagnóstico más confiable y oportuno: En los laboratorios clínicos se debe mejorar la estandarización diagnóstica. Eficiencia en la detección y referencia de pacientes. Accesibilidad a exámenes de laboratorio. Equipamiento adecuado en las unidades de salud. Es importante que en cada institución de salud se realicen estudios para validar valor predictivo de la prueba desde el nivel del tamizaje incluyendo: a) Índice de falsos positivos: GBA > 125 mg/ dl con HBa1c% < 6.0% b) Índice de falsos negativos: GBA < 100 mg/ dl con HBa1c% > 6.5 % 2. Prevenir complicaciones: Los médicos deben realizar un mejor control para reducir la frecuencia y la gravedad de las enfermedades crónico-degenerativas. Promoción de actividad física en escuelas, fábricas, empresas, etcétera. Supervisión y control de calidad en los servicios. Abasto de medicamentos. Grupos de apoyo psicológico y nutricional. Educación a los pacientes. Automonitoreo efectivo. Alcanzar la adherencia terapéutica. Referencias 1. 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14 12

15 El contenido de los artículos publicados en este medio son responsabilidad de sus autores y no de Bio-Rad, S.A. takecontrol es un foro abierto a las diferentes opiniones del laboratorio clínico en Latinoamérica. TakeControl es una publicación de BIO-RAD S.A. Dirección: Avenida Eugenia No. 197 piso 10-A. Col. Narvarte Deleg. Benito Juárez, C-P , México D.F. (52) Responsable de la publicación: Jesús Alejandro Hernández (Gerente de Producto IHD). Comentarios o sugerencias:

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