11 Número de publicación: Int. Cl.: 72 Inventor/es: Wald, Nicholas John. 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: G01N 33/68 (06.01) A61B 8/08 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Cribado prenatal para el síndrome de Down. Prioridad: GB GB Titular/es: Nicholas John Wald 22 Staverton Road Oxford, OX2 6XJ, GB 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Wald, Nicholas John 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Elzaburu Márquez, Alberto ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 Cribado prenatal para el síndrome de Down. DESCRIPCIÓN Esta invención se refiere a un método y a un aparato para determinar, con fines de cribado, si una mujer embarazada presenta un riesgo incrementado de síndrome de Down fetal. Se sabe que el riesgo de síndrome de Down en un feto se incrementa con la edad de la madre. Además, se sabe que unas concentraciones anormalmente altas o bajas de determinadas sustancias en el suero materno (marcadores bioquímicos), y unas determinaciones anormalmente grandes o pequeñas de determinados signos ultrasonográficos (marcadores de ultrasonidos) están asociadas con un riesgo incrementado de síndrome de Down en el feto. La información sobre uno o más de estos marcadores bioquímicos o de ultrasonidos (denominados colectivamente marcadores de cribado) puede combinarse con el riesgo de síndrome de Down asociado a la edad para formar la base de un ensayo de cribado. El objeto de un ensayo de cribado es identificar a las mujeres que presentan un riesgo de síndrome de Down lo suficientemente alto como para justificar un ensayo adicional que es diagnóstico del síndrome de Down. Dichos ensayos de diagnóstico adicionales, por ejemplo, muestra del villus coriónico o amniocentesis, implican procesos de toma de muestras que conllevan un cierto riesgo para la madre y/o el feto siendo la inducción de aborto y de defectos en las extremidades del feto algunos de los peligros reconocidos. Existe, por lo tanto, una necesidad de ensayos de cribado que maximicen la posibilidad de identificar los embarazos que presentan un riesgo muy alto de síndrome de Down, de manera que se justifiquen ensayos de diagnóstico adicionales con sus riesgos concomitantes. La eficacia de un ensayo de cribado depende de su capacidad para discriminar entre embarazos con síndrome de Down y embarazos no afectados. El poder discriminatorio de un ensayo se especifica habitualmente en términos del índice de detección conseguido para un índice de falsos positivos determinado, o en términos del índice de falsos positivos requerido para conseguir un índice de detección determinado. El índice de detección es la proporción de embarazos con síndrome de Down con un resultado positivo. El índice de falsos positivos es la proporción de embarazos no afectados con un resultado positivo. Los diferentes marcadores de cribado proporcionan generalmente más poder discriminatorio a un ensayo de cribado en una fase del embarazo que en otras. Los ensayos de cribado utilizados actualmente se basan en determinadas combinaciones de marcadores bioquímicos y de ultrasonidos que han sido identificados como eficaces cuando se utilizan conjuntamente en una fase específica, única del embarazo. Por ejemplo, el ensayo combinado que se lleva a cabo en el primer trimestre utilizando translucencia nucal y β- hcg libre y PAPP-A como marcadores de cribado puede conseguir un índice de detección del 80% con un índice de falsos positivos del %. El ensayo triple que se lleva a cabo en el segundo trimestre utiliza AFP, ue 3 y hcg como marcadores de cribado. El ensayo cuádruple que se lleva a cabo en el segundo trimestre utiliza los marcadores de cribado del ensayo triple más inhibina-a. El ensayo triple y el ensayo cuádruple pueden conseguir un índice de detección del 80% con un índice de falsos positivos del % y 6,6%, respectivamente. Sin embargo, sería deseable un ensayo de cribado con un poder discriminatorio mayor. Una índice alto de falsos positivos significa que un gran número de mujeres con resultados de cribado positivos tienen, de hecho, embarazos no afectados. Para estas mujeres no afectadas el resultado de cribado positivo, además de producir una ansiedad considerable, puede dar lugar a un procedimiento diagnóstico tal como amniocentesis o muestra del villus coriónico que presentan un riesgo de aborto de aproximadamente 1 en 0. La presente invención se basa en marcadores de cribado obtenidos a partir de dos o más fases diferentes del embarazo. En particular, según el primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para determinar si una mujer embarazada presenta un riesgo incrementado de tener un feto con síndrome de Down, método que comprende las etapas de: medir el nivel de al menos un marcador de cribado del primer trimestre del embarazo mediante: (i) el ensayo de una muestra obtenida de la mujer embarazada en dicho primer trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos realizado en dicho primer trimestre de embarazo; medir el nivel de al menos un marcador de cribado del segundo trimestre del embarazo mediante: 6 (i) el ensayo de una muestra obtenida de una mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos realizado en dicho segundo trimestre de embarazo; y 2

3 2 3 determinar, utilizando un programa de ordenador ejecutado en un ordenador, una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down comparando los niveles determinados tanto del al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo como del al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo con las distribuciones de frecuencia relativa observadas de los niveles de los marcadores en los embarazos con síndrome de Down y en los embarazos no afectados. La estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down puede determinarse obteniendo el índice de la probabilidad de síndrome de Down utilizando un análisis multivariante de los niveles determinados de los marcadores de cribado tanto del primer como del segundo trimestre de embarazo tomando como base parámetros de distribución obtenidos a partir de un conjunto de datos de referencia, que puede obtenerse de estudios existentes o futuros. Dicho método puede proporcionar un ensayo de cribado único integrado que es más eficaz para identificar los embarazos afectados que los ensayos que están basados en muestras recogidas en una única fase del embarazo, es decir, proporciona un índice de detección mayor para el mismo índice de falsos positivos o un índice de falsos positivos menor para un mismo índice de detección. Por ejemplo, si el riesgo de síndrome de Down se determina mediante un método que integra la determinación de translucencia nucal y PAPP-A en el primer trimestre y el ensayo cuádruple utilizando AFP, ue 3, hcg e inhibina-a como marcadores en el segundo trimestre, se estima que para un índice de detección del 80%, el índice de falsos positivos se disminuirá por debajo del 1%. Esto representa una mejora considerable respecto al índice de falsos positivos del % obtenido con el ensayo combinado solo. Esto significa que se clasificarán menos embarazos no afectados como positivos en el cribado. Además, con un índice de detección del 80%, si el gasto de las determinaciones de cribado adicionales es, por ejemplo, EEUU$0, no existirá un gasto global extra debido a que los costes de los cribados adicionales se compensarán con el ahorro que supone realizar un número sustancialmente menor de ensayos diagnósticos invasivos. La presente invención utiliza el hecho de que la capacidad de los diferentes marcadores de cribado para discriminar entre los embarazos con síndrome de Down y los embarazos no afectados varía según la fase del embarazo. Por ejemplo, el marcador de cribado PAPP-A es más útil antes de 14 semanas, pero no después, y viceversa con el marcador de cribado inhibina-a, como se resume en Wald NJ, Kennard A, Hackshaw A, McGuire A. (1997); Antenatal screening for Down s syndrome. J Med Screen 4, La presente invención también puede proporcionar la ventaja importante de permitir la utilización de la AFP del suero materno para cribar defectos abiertos del tubo neural (que es mejor realizar antes de semanas de embarazo) así como utilizar los resultados más tempranos del ensayo para el cribado del síndrome de Down. El procesamiento de las determinaciones de los niveles de los marcadores de cribado puede conseguirse mediante un sistema procesador de datos como, de manera adecuada, un ordenador de uso común ejecutando un programa apropiado. Por lo tanto, según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un programa de ordenador que cuando se ejecuta en un ordenador hace que el ordenador lleve a cabo un proceso para determinar el riesgo de una mujer embarazada de tener un feto con síndrome de Down, proceso que comprende las etapas de: introducir una determinación del nivel de al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo obtenido mediante: 4 0 (i) el ensayo de una muestra obtenida de una mujer embarazada en dicho primer trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos realizado en dicho primer trimestre de embarazo; introducir una determinación del nivel de al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo obtenido mediante: (i) el ensayo de una muestra obtenida de una mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos realizado en dicho segundo trimestre de embarazo; y 6 determinar una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down comparando los niveles introducidos tanto del al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo como del al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo con las distribuciones de frecuencia relativas observadas de los niveles de los marcadores en los embarazos con síndrome de Down y en los embarazos no afectados. Para permitir una mejor comprensión, se proporciona la descripción siguiente de un método y de un aparato para el cribado el síndrome de Down fetal según la presente invención mediante un ejemplo no limitativo con referencia a los dibujos en los que: 3

4 Las Fig. 1, 2, 3 y 4 muestran las distribuciones del riesgo en (a) embarazos con síndrome de Down y (b) embarazos no afectados utilizando diferentes conjuntos de marcadores en dos fases del embarazo; La Fig. es una diagrama de flujo que ilustra un método específico según la presente invención, en particular, un ensayo de cribado que implica obtener una estimación del riesgo a partir de las determinaciones realizadas en muestras bioquímicas y/o imágenes de ultrasonidos recogidas en diferentes fases del embarazo; La Fig. 6 es un diagrama de flujo que ilustra el proceso para calcular múltiplos de la mediana (MoM) para los marcadores bioquímicos y de ultrasonidos; La Fig. 7 es un diagrama de flujo que ilustra el proceso para ajustar los valores de MoM para tener en cuenta otros factores, además de la edad gestacional, que pueden afectar los niveles de los marcadores bioquímicos; La Fig. 8 es un diagrama de flujo que ilustra el proceso para seleccionar los parámetros apropiados de las distribuciones de los marcadores de cribado en embarazos afectados y no afectados; y La Fig 9. es un diagrama de flujo que ilustra el proceso para calcular el riesgo de síndrome de Down específico de la edad. Las determinaciones realizadas en muestras bioquímicas pueden incluir el ensayo de uno o más de los marcadores bioquímicos del síndrome de Down siguientes en el suero o plasma materno, entre otros: - alfa feto-proteína (AFP) 2 - estriol sin conjugar (ue 3 ) - gonadotropina coriónica humana (hcg) - subunidad alfa libre de hcg (α-hcg libre) - subunidad beta libre de hcg (β-hcg libre) - inhibina, preferiblemente inhibina-a dimérica (inhibina-a) 3 - proteína A plasmática asociada al embarazo (PAPP-A). Las determinaciones realizadas en muestras bioquímicas también pueden incluir el ensayo de uno o más de los marcadores bioquímicos del síndrome de Down siguientes en la orina materna, entre otros: - beta hcg - estriol total. 4 Las determinaciones realizadas en imágenes de ultrasonidos pueden incluir uno o más de los marcadores de ultrasonidos del síndrome de Down siguientes, entre otros: - espesor de la translucencia nucal (NT), pliegue nucal 0 - longitud del fémur - longitud del húmero - intestino hiperecogénico - pielectasia renal - latido cardiaco fetal 6 - determinadas anormalidades cardiacas. La utilización de los marcadores de cribado anteriores y de otros en una única fase del embarazo es conocida por lo que no es necesario describir en la presente memoria las técnicas específicas mediante las que se obtienen las determinaciones. En los métodos conocidos los niveles de los marcadores bioquímicos y de ultrasonidos se interpretan en combinación con la edad materna para obtener una estimación del riesgo. La estimación del riesgo se lleva a cabo utilizando técnicas estadísticas estándar. Por ejemplo, se describen métodos conocidos en Wald NJ, Cuckle HS, Densem JW, et al (1988); Maternal serum screening for Down s syndrome in early pregnancy. BMJ 297, y en Royston P, Thompson SG (1992); Model-based screening by risk with application to Down s syndrome. Stat Med 11,

5 En el presente método se obtiene una estimación única del riesgo a partir de determinaciones de los niveles de marcadores en muestras bioquímicas (por ejemplo, suero o plasma u orina o células) y/o de imágenes de ultrasonido que se obtienen de manera secuencial en dos o más fases diferentes del embarazo. Por lo tanto, el cálculo puede integrarse como un único ensayo en una fase. Las determinaciones individuales se obtienen utilizando métodos conocidos. Puede utilizarse uno o más marcadores de cribado de cada una de las fases del embarazo. Puede seleccionarse cualquier marcador que sea eficaz en cada fase particular. Por ejemplo, en una realización de esta invención, los marcadores del primer trimestre entre 8 y 13 semanas de embarazo son los marcadores del ensayo combinado (NT, β-hcg libre y PAPP-A) y los marcadores del segundo trimestre entre 14 y 22 semanas son los marcadores del ensayo cuádruple AFP, ue 3, hcg total e inhibina-a. Preferiblemente, no se utilizarán juntas β-hcg libre del primer trimestre y hcg total del segundo trimestre debido a la alta correlación esperada entre estos marcadores. Por lo tanto, la realización preferida es utilizar NT y PAPP-A del primer trimestre y los marcadores del ensayo cuádruple del segundo trimestre. En las Tablas 4a y 4b siguientes se muestran otras posibles combinaciones de marcadores. En la práctica, puede ser necesario omitir la utilización de NT en algunos centros de ensayo que no tienen experiencia en su determinación u omitir la utilización de inhibina-a en algunos centros de ensayo que prefieren mantener la utilización actual de los marcadores del ensayo triple en lugar de los marcadores del ensayo cuádruple. Los niveles determinados de los marcadores se utilizan en combinación, preferiblemente conjuntamente con la edad materna, para obtener una estimación del riesgo de tener un embarazo afectado Se sabe que los niveles de la mayoría de los marcadores de cribado varían con la edad gestacional. Para tener en cuenta esta variación cada nivel del marcador puede expresarse como un múltiplo del nivel de la mediana (MoM) para embarazos no afectados de la misma edad gestacional. Especialmente, en el caso de los marcadores obtenidos de escaneos con ultrasonidos, la determinación de la longitud craneocaudal (CRL) o del diámetro biparietal (BPD) son determinaciones alternativas de la edad gestacional. Los MoM pueden ajustarse de una manera conocida para tener en cuenta los factores que se sabe que afectan los niveles de los marcadores, tales como peso materno, grupo étnico, estado diabético de la madre y número de fetos. Cuando se utilizan varios marcadores en combinación para el cribado de un trastorno particular, es deseable tener en cuenta la correlación entre los marcadores. Si dos marcadores se correlacionan perfectamente, uno no aporta nada al otro en cuanto a la evaluación del riesgo de tener el trastorno, mientras que si no se correlacionan, cada uno proporciona una determinación del riesgo independiente. Si se correlacionan parcialmente, cada uno proporcionará una información independiente. Las correlaciones entre marcadores que se sabe son adecuados para utilizarse en la misma fase del embarazo son conocidas, por ejemplo, como se resume en la Tabla 1 siguiente para los marcadores preferidos. En el presente método, se asume que los marcadores de diferentes fases del embarazo son independientes entre sí entre los embarazos afectados y no afectados. Puede existir algún grado de correlación entre estos marcadores pero esto es improbable que tenga un efecto material en el rendimiento estimado del cribado. En cualquier caso, si se requiere, dichos coeficientes de correlación pueden incorporarse en el cálculo de las estimaciones del riesgo de la misma manera que se utilizan los coeficientes de correlación en el presente método. El cálculo del riesgo a partir de los niveles determinados de los marcadores se basa en la distribución de la frecuencia relativa observada del nivel del marcador en (a) embarazos con síndrome de Down y (b) embarazos no afectados. Puede utilizarse cualquiera de las técnicas estadísticas conocidas. Preferiblemente, se utiliza el modelo Gaussiano multivariante, que resulta apropiado cuando las distribuciones observadas son razonablemente Gaussianas. Dicho análisis Gaussiano multivariante es conocido, por ejemplo, a partir de Wald NJ, Cuckle HS, Densem JW, et al (1988) y Royston P, Thompson SG (1992) a los que se ha hecho referencia anteriormente. Por lo tanto, no es necesaria una discusión detallada aunque se proporciona un resumen a continuación. Si se utiliza una representación en matriz, la altura H de la distribución Gaussiana para un determinado conjunto de niveles determinados la proporciona la ecuación: 6 en la que p es el número de marcadores, π (σ) es el producto de las desviaciones estándar para cada distribución, Z es una matriz que contiene el nivel determinado de cada marcador expresado en unidades de desviación estándar, es decir, ((nivel determinado - media)/desviación estándar), y R es una matriz que contiene las correlaciones entre los ensayos. Para cada ensayo se calculan dos alturas Gaussianas, (a) una para la distribución del síndrome de Down y (b) la otra para la distribución no afectada. Para este cálculo los parámetros necesarios de la distribución estadística que especifican la distribución Gaussiana son la media, desviación estándar y correlaciones para las dos distribuciones. Éstos son conocidos, pueden obtenerse a partir de distribuciones observadas y se proporcionan para algunos marcadores, por ejemplo, en Wald NJ, Hackshaw AK (1997); Combining ultrasound and biochemistry in first-trimester screening for

6 Down s syndrome. Prenat Diagn 17, ; en Wald NJ, Densem JW, George L, Muttukrishna S, Knight PG (1996); Prenatal screening for Down s syndrome using inhibin-a as a serum marker. Prenat Diagn 16, 143-3; y en Wald NJ, Densem JW, George L, Muttukrishna S, Knight PG (1997) Inhibin-A in Down s syndrome pregnancies: revised estimate of standard deviation. Prenat Diagn 17, , como se resume en la Tabla 1 siguiente para los marcadores preferidos. Los parámetros de la distribución se almacenan como datos de referencia para utilizarse en el análisis. TABLA 1 Desviaciones estándar, coeficientes de correlación, y medias (log MoM) para embarazos no afectados y con síndrome de Down para marcadores de cribado (tomando como base la estimación de la edad gestacional utilizando un examen de escáner con ultrasonidos, con ajuste de los marcadores séricos en función del peso materno) Desviaciones estándar Embarazos no afectados Embarazos con síndrome de Down Translucencia nucal 0,1717 0,2396 PAPP-A 0,269 0,3471 β-hcg libre 0,2833 0,2870 AFP 0,1789 0,1821 ue 3 0,12 0,12 hcg total 0,2239 0,2 Inhibina-A 0,24 0,1986 Coeficientes de correlación Translucencia nucal PAPP-A 0,0000 0,0000 PAPP-A β-hcg libre 0,17 0,0648 β-hcg libre Translucencia nucal 0,0000 0,0000 AFP ue 3 0,0901 0,1770 AFP hcg total 0,096 0,2148 AFP Inhibina-A 0,0780 0,4 ue 3 hcg total -0,086-0,0474 ue 3 Inhibina-A 0,017-0,24 hcg total Inhibina-A 0,1882 0,2493 Medias Translucencia nucal 0,0000 0,3118 PAPP-A 0,0000-0,3704 β-hcg libre 0,0000 0,2 AFP 0,0000-0,1427 ue 3 0,0000-0,1411 hcg total 0,0000 0,23 Inhibina-A 0,0000 0,222 6 La proporción de las dos alturas Gaussianas proporciona el índice de probabilidad. El índice de probabilidad es una medida del riesgo incrementado de tener un trastorno para una combinación dada de resultados del ensayo, comparada con el riesgo basal (es decir, el riesgo en ausencia de los resultados del ensayo). El índice de probabilidad se multiplica por el riesgo basal conocido, que es preferiblemente el riesgo específico de la edad, para calcular la estimación mejorada del riesgo. El riesgo específico de la edad puede calcularse utilizando la distribución de la edad materna de Inglaterra y Gales para (obtenida a partir de Office of Population Censuses and Surveys ( ); Birth Statistics, Serie FM1, Nos, 11, 12, -17, Londres: HMSO) y la proporción de síndrome de Down en nacidos vivos (obtenida a partir de Cuckle HS, Wald NJ, Thompson SG (1987); Estimating a woman s risk of having a pregnancy associated with Down s syndrome using her age and serum alpha-fetoprotein level, Br J Obstet Gynaecol 94, 387-2). El riesgo estimado se clasifica como cribado positivo o cribado negativo tomando como base una comparación con un punto de corte predeterminado. El valor del punto de corte puede alterarse para variar el índice de detección y el índice de falsos positivos. 6

7 Se han estimado los índices de detección y los índices de falsos positivos esperados del síndrome de Down utilizando la presente invención. Estos muestran un rendimiento mejorado respecto a los ensayos en una única fase del embarazo. Las Tablas 2, 3 y 4 ilustran este rendimiento mejorado. El rendimiento se muestra en las Tablas 2a, 3a y 4a en términos del índice de detección conseguido para índices especificados de falsos positivos y en las Tablas 2b, 3b y 4b en términos del índice de falsos positivos conseguido para índices especificados de detección. Las estimaciones se basan en una estimación de la edad gestacional utilizando un escaneo con ultrasonidos, ajustando los marcadores séricos en función del peso materno. Las Tablas 2a y 2b muestran el rendimiento de diferentes ensayos de cribado realizados actualmente entre las semanas y 13 de embarazo. Las Tablas 3a y 3b muestran el rendimiento de diferentes ensayos de cribado realizados actualmente entre las semanas 14 y 22 de embarazo. Las Tablas 4a y 4b muestran el rendimiento de cuatro ensayos de cribado diferentes integrados según la presente invención. Las Tablas a y b muestran el rendimiento de la realización preferida (utilizando NT y PAPP-A del primer trimestre y los marcadores del ensayo cuádruple del segundo trimestre), y también con la omisión de inhibina-a, NT y ambos. Puede apreciarse que el rendimiento de los ensayos integrados del presente método es superior, debido a que para cada índice de falsos positivos el índice de detección del presente método es mayor que el de cada uno de los ensayos disponibles actualmente que se basan en una única fase del embarazo, y para cada índice de detección el índice de falsos positivos del presente método es menor que el de los ensayos disponibles actualmente. Como se muestra en las Tablas a y b, incluso cuando se omite inhibina-a, NT o ambos, resulta ventajoso integrar los marcadores del primer y segundo trimestres en un único ensayo de cribado. TABLA 2a 2 Índice de detección (%). Edad materna con: Índice de falsos AFP y hcg total AFP, ue 3 y hcg total AFP, ue 3, α-hcg AFP, ue 3, hcg total positivos (%) libre y β-hcg libre e inhibina-a TABLA 2b 4 0 Ínrlce de falsos positivos (%). Edad materna con: Índice de AFP y hcg total AFP, ue 3 y hcg total AFP, ue 3, α-hcg AFP, ue 3, hcg total detección (%) libre y β-hcg libre e inhibina-a 4,0 1,9 1,2 1,1,4 2,7 1,8 1,6 6 7,1 3,8 2,7 2,2 70 9,4,2 4,0 3, ,3,9 4, ,9 6, ,

8 TABLA 3a Índice de detección (%). Edad materna con: Índice de falsos positivos (%) NT β-hcg libre y PAPP-A NT, β-hcg libre y PAPP-A TABLA 3b Índice de falsos positivos (%). Edad materna con: Índice de detección (%) NT β-hcg libre y PAPP-A NT, β-hcg libre y PAPP-A 2,8 3,1 0, 4,2 4,4 0,8 6,9 6,2 1,3 70 8,7 8,6 2, , , , TABLA 4a Índice de detección (%). Edad materna con: 0 Índice de falsos A las -13 PAPP-A y NT y PAPP-A NT, PAPP-A y positivos (%) semanas: β-hcg libre β-hcg libre PAPP-A A las AFP, ue 3 e AFP, ue 3, hcg AFP, ue 3 e semanas: AFP, inhibina-a total e inhibina-a inhibina-a ue 3, hcg total e inhibina-a

9 TABLA 4b Índice de falsos positivos (%). Edad materna con: Índice de A las -13 PAPP-A y NT y PAPP-A NT, PAPP-A y detección (%) semanas: β-hcg libre β-hcg libre PAPP-A A las AFP, ue 3 e AFP, ue 3,hCG AFP, ue 3 e semanas: AFP, inhibina-a total e inhibina-a inhibina-a ue 3, hcg total e inhibina-a 0,4 0,4 0,1 0,1 0,6 0,6 0,1 0,1 6 0,9 1,0 0,2 0,2 70 1,4 1, 0,3 0,3 7 2,1 2,3 0, 0, ,2 3, 0,9 1,0 8,1,6 1,7 1,9 90 8,8 9, 3,4 3, ,2 8,8 3 TABLA a Índice de detección (%). Edad materna con: Índice de falsos Realización Omitiendo Omitiendo NT Omitiendo NT e positivos (%) preferida inhibina-a inhibina-a TABLA b Índice de falsos positivos (%). Edad materna con: Índice de Realización Omitiendo Omitiendo NT Omitiendo NT e detección (%) preferida inhibina-a inhibina-a 0,1 0,2 0,6 1,0 70 0,3 0, 1,4 2,2 80 0,9 1, 3,2, ,4,0 8,8 12,6 9

10 Las Fig. 1 a 4 muestran las distribuciones del riesgo estimado de un embarazo con síndrome de Down en embarazos no afectados y en embarazos con síndrome de Down utilizando diferentes marcadores según la presente invención. En estas figuras, las líneas verticales ilustran el índice de detección (que corresponde al área bajo la curva de distribución del síndrome de Down a la derecha de la línea vertical) que se puede conseguir con un índice de falsos positivos del % (que corresponde al área bajo la curva de distribución no afectada a la derecha de la línea vertical). Las líneas de puntos indican incertidumbres en las estimaciones precisas del riesgo. La Fig. 1 muestra las distribuciones cuando se utiliza PAPP-A entre las semanas y 13 y AFP, ue 3 e inhibina-a entre las semanas 14 y 22. La Fig. 2 muestra las distribuciones cuando se utiliza PAPP-A y β-hcg libre entre las semanas y 13 y AFP, ue 3 e inhibina-a entre las semanas 14 y 22. La Fig. 3 muestra las distribuciones cuando se utiliza NT y PAPP-A entre las semanas y 13 y AFP, ue 3, inhibina- A y hcg total entre las semanas 14 y 22. La Fig. 4 muestra las distribuciones cuando se utiliza NT, PAPP-A y β-hcg libre entre las semanas y 13 y AFP, ue 3 e inhibina-a entre las semanas 14 y Como alternativa, puede llevarse a cabo un ensayo secuencial. En este caso, el riesgo se determina inicialmente tomando únicamente como base los niveles de los marcadores en la primera fase del embarazo. Esta primera estimación del riesgo se compara con un punto de corte del riesgo predeterminado como se conoce para una clasificación inicial como cribado positivo o cribado negativo. Las mujeres con un resultado de cribado positivo se someten a un ensayo diagnóstico y pueden no someterse a ensayo para determinar los niveles de marcadores de cribado en la segunda fase del embarazo. Las mujeres clasificadas inicialmente como cribado negativo se vuelven a someter a ensayo para determinar los marcadores en la segunda fase del embarazo. El riesgo del síndrome de Down se determina de nuevo utilizando los marcadores tanto de la primera como de la segunda fase del embarazo. Para determinar el riesgo, el índice de la probabilidad puede calcularse de la misma manera que en el ensayo no secuencial descrito anteriormente. De nuevo, es deseable tener en cuenta cualquier correlación entre los marcadores. Las Fig. a 9 son diagramas de flujo que ilustran un método específico según la presente invención que se explica con detalle a continuación. En el primer trimestre aproximadamente en las semanas 8 a 13, o preferiblemente aproximadamente en las semanas a 13 se obtiene un escaneo con ultrasonidos en la etapa 1 y en la etapa 2 se determinan y registran el marcador de la translucencia nucal (NT) y la longitud craneocaudal (CRL). En la misma fase, se toma una muestra de sangre en la etapa 3, y el suero separado se refrigera en la etapa 4, después de lo cual no se hace nada durante una espera en la etapa hasta que se toma una segunda muestra en el segundo trimestre. El escaneo con ultrasonidos 1 y la muestra de sangre 3 pueden realizarse como alternativas o conjuntamente dependiendo de si se desea utilizar marcadores de ultrasonidos, marcadores bioquímicos, o ambos. En el segundo trimestre aproximadamente a las 14 a 22 semanas, se toma una segunda muestra de sangre en la etapa 6. Posteriormente, en la etapa 7 se ensayan la primera y segunda muestras para los marcadores bioquímicos respectivos seleccionados. El procesamiento de las determinaciones de las etapas 2 y 7 se describe a continuación y se ilustra en los bloques con el número 8 y números mayores en las Fig. a 8. Este procesamiento se lleva a cabo en un ordenador programado apropiadamente. Por lo tanto, los bloques con el número 8 y mayores también ilustran elementos del programa de ordenador o métodos de programación que realizan el procesamiento. En particular, los bloques del proceso representan el procesamiento realizado por el procesador del ordenador. Los bloques de entrada de datos representan el procesamiento de la entrada de datos que puede realizarse utilizando los campos de entrada de datos apropiados mostrados en un monitor en el que pueden introducirse los datos mediante el teclado del ordenador. Los bloques de los números de los datos representan datos utilizados por el programa. Los bloques de datos almacenados representan datos de referencia almacenados que pueden almacenarse en la memoria del ordenador en archivos con referencia asignada por el programa del ordenador. Los medios de entrada de datos se utilizan para introducir las concentraciones (niveles) de los marcadores séricos en la etapa 8 y el nivel del marcador NT y la determinación de CRL en la etapa 9. Si los niveles del primer trimestre se introducen inmediatamente después de la determinación puede generarse automáticamente un mensaje y mostrarse en un momento apropiado del segundo trimestre para recordar al usuario que deben realizarse las determinaciones a partir de una segunda muestra. En la etapa, cada nivel de los marcadores se vuelve a expresar como múltiplo del nivel de la mediana (MoM) para los embarazos no afectados de la misma edad gestacional y se genera como dato número 11.

11 La etapa se ilustra con más detalle en la Fig. 6. El dato almacenado LMP 27 y el escaneo 28 específicos de los métodos respectivos para estimar la edad gestacional se utilizan para seleccionar una ecuación que estima las concentraciones medias esperadas para las diferentes edades gestacionales de cada marcador en la etapa 29. El dato LMP 27 es específico para la estimación de la edad gestacional tomando como base el primer día del último periodo menstrual. El dato del escaneo 28 es específico para estimar la edad gestacional a partir de una determinación con ultrasonidos del feto, habitualmente BPD o CRL. Las ecuaciones seleccionadas basadas en el dato almacenado 27 ó 88 pueden ser ecuaciones lineales simples o pueden ser más complicadas. Por ejemplo, en el caso de la inhibina-a en el segundo trimestre. Como los niveles de inhibina-a disminuyen al comienzo del segundo trimestre, y empiezan a subir de nuevo después de 17 semanas de gestación, es preferible utilizar una regresión log-cuadrática para calcular el nivel de la mediana de inhibina-a en diferentes edades gestacionales. La ecuación siguiente se sugiere en Watt HC, Wald NJ, Huttly WJ (1998); The pattern of maternal serum inhibin-a concentrations in the second trimester of pregnancy. Pregnat Diagn 18, : log I = k + 0, x (a 1) 2 en la que I es la concentración de inhibina-a, a es la edad gestacional en días y el coeficiente k se obtiene de manera independiente en cada centro de cribado. Tomando como base una entrada en la etapa de la edad gestacional en la fecha de la muestra, para cada marcador en la etapa 31 los niveles medios esperados en embarazos no afectados de la misma edad gestacional se calculan utilizando la ecuación seleccionada en la etapa 29. En la etapa 32, cada entrada del nivel del marcador en la etapa 8 se divide por la mediana esperada para ese marcador para generar MoM como dato número 11. En la etapa 12, el marcador NT se vuelve a expresar como un MoM y se genera como dato número 13. El cálculo específico de la etapa 12 se ilustra en la Fig. 6 y se corresponde con el cálculo de MoM para los marcadores bioquímicos, salvo que la entrada de la determinación de CRL en la etapa 9 se utiliza como la estimación de la edad gestacional. El dato 33 almacenado representa las medianas de NT para diferentes determinaciones de CRL, preferiblemente como una ecuación. Puede existir una variación sistemática considerable en las determinaciones de la translucencia nucal (NT) de un ultrasonógrafo a otro. Por lo tanto, el dato 33 almacenado puede representar, opcionalmente, las medianas de NT que son específicas del ultrasonógrafo en los casos en los que ha sido posible basar este dato en un número de determinaciones lo suficientemente grande obtenido a partir de ultrasonógrafos individuales. En la etapa 34 el dato 33 almacenado se utiliza para calcular los niveles esperados de la mediana de NT en embarazos no afectados de la misma CRL, es decir, de la misma edad. En la etapa 3, la entrada de la determinación de NT de la etapa 9 se divide por la mediana esperada de NT para proporcionar el MoM de NT que se genera como dato número 13. Opcionalmente, los MoM 11 para los marcadores bioquímicos pueden ajustarse en la etapa 14 que se ilustra con detalle en la Fig. 7. Tomando como base una entrada de uno cualquiera o más de peso materno, grupo étnico, estado diabético y número de fetos en las etapas 36 a 39, respectivamente, en la etapa 44 se utilizan para ajustar los MoM 11 las ecuaciones de ajuste del peso almacenadas, los ajustes del grupo étnico 41, los factores de corrección de la diabetes 42 y los factores de corrección de nacimientos múltiples 43. Los MoM ajustados se generan como dato número. En la etapa 16, se realiza un análisis Gaussiano multivariante del MoM para todos los marcadores de cada fase del embarazo. Para utilizarse en este análisis, los parámetros de distribución 18 se seleccionan en la etapa 17 que se describe con mayor detalle en la Fig. 8. Para cada marcador, los parámetros de la distribución se almacenan como datos de referencia 4 a 48 para diferentes métodos de estimación de la edad gestacional (LMP o escaneo) y tomando como base si MoM ha sido ajustado o no en función del peso materno. En la etapa 49, los parámetros de la distribución apropiados se seleccionan y generan como dato número 18. El análisis Gaussiano multivariante 16 genera un índice de probabilidad como dato número 19. Éste necesita multiplicarse por un riesgo basal para obtener el riesgo estimado de síndrome de Down. Aunque puede utilizarse un riesgo global de la población, el presente método utiliza riesgos específicos de la edad calculados en la etapa que se describe con mayor detalle en la Fig. 9. La edad gestacional de la entrada de la muestra en la etapa 0 (ó ) y la fecha de la entrada de la muestra en la etapa 1 se utilizan para calcular la fecha de parto esperada (EDD) en la etapa 2. La fecha de nacimiento materna se introduce en la etapa 3 y se combina con la EDD para calcular la edad en la EDD como dato número 6. Esto se utiliza en la ecuación almacenada del riesgo específico de la edad 7 para generar el riesgo específico de la edad como dato número 21. El índice de probabilidad 19 y el riesgo específico de la edad 21 se multiplican en la etapa 22 para generar el riesgo estimado de síndrome de Down como dato número 23. El riesgo estimado 23 se compara con un punto de corte predeterminado en la etapa 24 para producir un resultado de cribado positivo 2 cuando el riesgo es igual a o mayor que el punto de corte, o por el contrario un resultado de cribado negativo 26. El aparato puede configurarse para proporcionar estimaciones del rendimiento esperado del cribado (es decir, el índice de detección, índice de falsos positivos y las probabilidades de que se vean afectados con un resultado positivo), teniendo en cuenta la distribución de la edad de la población sometida a cribado, la combinación utilizada de los 11

12 marcadores de cribado, el punto de corte de riesgo utilizado y otros factores. El rendimiento observado en la práctica puede compararse entonces con el rendimiento esperado como soporte a la monitorización. Los valores de los datos almacenados utilizados en el método descrito anteriormente dependen de qué marcadores de las dos fases del embarazo se han seleccionado para utilizarse. Los valores apropiados de los datos para cada marcador se conocen, por ejemplo, a partir de las referencias

13 REIVINDICACIONES Un método para determinar si una mujer embarazada presenta un riesgo incrementado de tener un feto con síndrome de Down, método que comprende las etapas de: medir el nivel de al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo mediante: (i) el ensayo de una muestra obtenida de una mujer embarazada en dicho primer trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos obtenido en dicho primer trimestre de embarazo; medir el nivel de al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo mediante: (i) el ensayo de una muestra obtenida de una mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos obtenido en dicho segundo trimestre de embarazo; y determinar, utilizando un programa de ordenador ejecutado en un ordenador, una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down comparando los niveles determinados tanto del al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo como del al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo con las distribuciones de frecuencia relativas observadas de los niveles de los marcadores en los embarazos con síndrome de Down y en los embarazos no afectados. 2. Un método según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinar una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down comprende obtener el índice de la probabilidad de síndrome de Down utilizando un análisis multivariante de los niveles determinados de los marcadores de cribado tanto del primer como del segundo trimestre de embarazo tomando como base los parámetros de distribución obtenidos a partir de un conjunto de datos de referencia. 3. Un método según la reivindicación 2, en el que dicho análisis multivariante es un análisis Gaussiano multivariante. 4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que la etapa de determinar una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down comprende además multiplicar el índice de la probabilidad por un riesgo específico de la edad.. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de volver a expresar cada nivel determinado de un marcador de cribado como un múltiplo del nivel de la mediana del marcador de cribado respectivo en embarazos no afectados de la misma edad gestacional que la del feto de la mujer embarazada. 6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa de medir el nivel de al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo incluye ensayar una muestra de suero obtenida de la mujer embarazada en dicho primer trimestre de embarazo para determinar PAPP-A, β-hcg libre o ambos. 7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa de medir el nivel de al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo incluye ensayar una muestra de suero obtenida de la mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo para determinar AFP, ue 3, inhibina-a, β-hcg libre, α-hcg libre hcg total o cualquier combinación de éstos. 8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa de medir el nivel de al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo incluye ensayar una muestra de orina obtenida de la mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo para determinar β-hcg o estriol total o ambos. 9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una de dichas etapas de medir el nivel de al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo incluye ensayar una muestra de células obtenida de la mujer embarazada para determinar al menos un marcador bioquímico de cribado.. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además ajustar cualquiera o todos los niveles determinados de los marcadores de cribado para tener en cuenta uno o más factores seleccionados del grupo de raza materna, peso materno, parto múltiple y estado diabético. 13

14 11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a, en el que se obtiene una primera muestra de la mujer embarazada en dicho primer trimestre de embarazo; se almacena la primera muestra en frío; y se obtiene una segunda muestra de la mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo, y 2 3 en el que la primera y segunda muestras se ensayan al mismo tiempo. 12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además medir el nivel de al menos un marcador de cribado adicional de al menos una fase más del embarazo y adicionalmente comparar el nivel determinado de dicho al menos un marcador de cribado adicional con las distribuciones de frecuencia relativa observadas de los niveles del marcador en embarazos con síndrome de Down y en embarazos no afectados en dicha etapa de determinar una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down. 13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además comparar la estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down con un punto de corte predeterminado para clasificar a la mujer embarazada como cribado positivo o cribado negativo tomando como base la comparación. 14. Un programa de ordenador que cuando se ejecuta en un ordenador hace que el ordenador lleve a cabo un proceso para determinar el riesgo de una mujer embarazada de tener un feto con síndrome de Down, proceso que comprende las etapas de: introducir una determinación del nivel de al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo obtenido mediante: (i) el ensayo de una muestra obtenida de la mujer embarazada en dicho primer trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos obtenido en dicho primer trimestre de embarazo; introducir una determinación del nivel de al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo obtenido mediante: (i) el ensayo de una muestra obtenida de la mujer embarazada en dicho segundo trimestre de embarazo para al menos un marcador bioquímico de cribado; y/o (ii) la determinación de al menos un marcador de ultrasonidos de cribado a partir de un escaneo con ultrasonidos obtenido en dicho segundo trimestre de embarazo; y determinar una estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down comparando los niveles introducidos tanto del al menos un marcador de cribado del primer trimestre de embarazo como del al menos un marcador de cribado del segundo trimestre de embarazo con las distribuciones de frecuencia relativas observadas de los niveles del marcador en los embarazos con síndrome de Down y en los embarazos no afectados.. Un programa de ordenador según la reivindicación 14, en el que dicha determinación de la estimación cuantitativa del riesgo de síndrome de Down se realiza obteniendo el índice de la probabilidad de síndrome de Down mediante la utilización de un análisis multivariante de los niveles determinados de los marcadores de cribado tanto del primer como del segundo trimestre de embarazo tomando como base los parámetros de distribución obtenidos a partir de un conjunto de datos de referencia. 16. Un programa de ordenador según la reivindicación, en el que dicho análisis multivariante es un análisis Gaussiano multivariante. 17. Un programa de ordenador según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el proceso comprende además la etapa de volver a expresar cada entrada del nivel de un marcador de cribado como un múltiplo del nivel de la mediana del marcador de cribado respectivo en embarazos no afectados de la misma edad gestacional que la del feto de la mujer embarazada, utilizándose el nivel reexpresado del marcador de cribado en dicha determinación del riesgo de síndrome de Down. 18. Un programa de ordenador según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el proceso comprende además introducir una determinación del nivel de al menos un marcador de cribado adicional de al menos una fase más del embarazo y en el que dicha determinación del riesgo de síndrome de Down se realiza adicionalmente comparando el nivel introducido de dicho al menos un marcador de cribado adicional con las distribuciones de frecuencia relativa de los niveles del marcador en embarazos con síndrome de Down y en embarazos no afectados. 14

15 19. Un programa de ordenador según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el proceso comprende además la etapa de comparar la estimación cuantitativa del riesgo con un nivel de punto de corte predeterminado para clasificar a la mujer embarazada como cribado positivo o cribado negativo tomando como base la comparación.. Un soporte de registro de un programa de ordenador que almacena un programa de ordenador según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a

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