BASES EN INMUNOLOGÍA

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Esteban Ponce Padilla
hace 7 años
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1 J. Monserrat. Dto Medicina. Prácticas 2008/2009 CUADERNILLO DE PRACTICAS DE CITOMETRÍA DE FLUJO TIPOS DE ANÁLISIS BASES EN INMUNOLOGÍA Inmunología. Curso Jorge Monserrat Sanz E. Reyes, A. Prieto, D. Díaz. Departamento de Medicina Facultad de Medicina Universidad de Alcalá

TIPOS DE ANÁLISIS BASES EN INMUNOLOGÍA Inmunología.

2 J. Monserrat. Dto Medicina. Prácticas Biología 2007/2008 Tema : Fenotipo: Ideas Generales de Análisis En esta práctica hay 0 ejercicios de análisis. Cada pregunta tiene un número que le relaciona con la hoja de análisis sobre la cual tenéis que trabajar para responder a las preguntas. Las hojas de análisis se encuentran detrás del grupo de preguntas, y tienen en su margen inferior izquierda números para saber a que preguntas pertenecen. Primero leer la pregunta y el número, después localizar la hoja de análisis y estudiar sobre ella lo que se os pida. Ideas generales que hay que conocer para realizar la práctica: - Dot plots e Histogramas - Cuadrantes de los dots plots - Gates o puertas lógicas - Estadísticas: %, números, y MFI. Ejercicios de análisis: Indicar el porcentaje de las células leucocitarias que aparecen en el siguiente dot plot de tamaño (FSC) y granularidad (SSC) sabiendo que: a. Los linfocitos son más pequeños que los monocitos que a su vez tienen un tamaño menor o igual que los granulocitos. b. Los monocitos teñen un retículo endoplasmático más desarrollado que los linfocitos pero presentan menos granulos que los neutrofilos. NOTA: Una vez identificadas las poblaciones, recalcular los porcentajes como sí la población de leucocitos fueran el 00 % de la población. 2. Si el hemograma de una persona nos indica que tiene 0000 leucocitos por microlitro, Que número de células por microlitro tendrá de cada tipo leucocitario? (Puesta en común y Discusión) 3. Relacionar los siguientes histogramas de tamaño y granularidad con el dot plot anterior. Identificar las poblaciones leucocitarias.indicar su porcentajes sabiendo que pertenecen al dot plot anterior (es decir: son las mismas células usadas en el dibujo anterior pero vistas en histogramas en vez de dot plots). 4. Como demostrarías que cada nube de células identificadas en el dot plot anterior de tamaño (FSC) y complejidad celular (SSC) son realmente linfocitos, monocitos y granulocitos. Que técnica experimental usarías para identificar estos tipos linfocitarios?. Pensar que os podíamos estar engañando. (Puesta en común y Discusión) 5. Caracterizar según mareaje de superficie las principales poblaciones leucocitarias. (Puesta en común y Discusión)

Las hojas de análisis se encuentran detrás del grupo de preguntas, y tienen en su margen inferior izquierda números para saber a que preguntas pertenecen.

3 J. Monserrat. Dto Medicina. Prácticas Biología 2007/ Indicar los porcentajes y MFI (Intensidad Media de Fluorescencia) de las principales subpoblaciones celulares en que se dividen los linfocitos de sangre periférica que aparecen en los siguientes dot plots. 7. Relacionar los siguientes histogramas de fluorescencia con sus dot plots Comprobar los porcentajes y MFI (Puesta en común y Discusión) 8. Se presentan dos casos distintos para estudiar las diferencias entre ellos. Comparar el caso estudiado en el punto anterior (6) con el nuevo caso. Una vez identificadas las poblaciones, indicar las diferencias encontradas entre ellos (en porcentage y mfi). Pensar que:los porcentajes normales de los linfocitos en sangre son: 60-70% de linfocitos T, 5-5 % de linfocitos B, 0-5 % de células NK Una vez encontradas las diferencias comparar el caso estudiando si el número de linfocitos por microlitro es: En el caso 6 : 2000 linfocitos por microlitro En el caso 8 : A linfocitos por microlitro B linfocitos por microlitro (Puesta en común y Discusión) 9. Leucemia Linfática Crónica: Diagnóstico diferencial mediante la expresión de células CD5+ Estudio comparativo de dos muestras: Indicar solo el % de células B (CD9+) que expresan CD5+ sobre el 00% de las B (y no sobre el total de linfocitos, que es lo que hemos hecho en el ejercicio anterior) y el % de células B (CD9+) que expresan CD20+ sobre el 00% de las B. Cual de los dos ejemplos sugeriríais que tiene una leucemia linfática? (Puesta en común y Discusión) 0. Sida (HIV): Cuantificación de subpoblaciones linfocitarias para el diagnóstico y seguimiento de enfermos con HIV mediante el cálculo del ratio CD4/CD8. Estudio comparativo de dos muestras:indicar el porcentaje de T (CD3+) que expresan CD4+, CD8+ y dobles positivas. Calcular el ratio CD4/CD8 y sacar el número de cifras absolutas en función de los posibles hemogramas que el profesor de prácticas proponga. Caso : 2000 linfocitos/ul. Caso 2: 800 linfocitos/iu Cual de los dos ejemplos sospecharías una infección con un HIV? Nota: El manejo clínico de estos pacientes en la actualidad se hace con el número absoluto de CD4+ y con la cuantificación de la carga viral (PCR) (Puesta en común y Discusión)

plots. 7. Relacionar los siguientes histogramas de fluorescencia con sus dot plots Comprobar los porcentajes y MFI (Puesta en común y Discusión) 8.

4 FSC FSC-Height Región Statistics File: FSC.00 SamplelD:SP0BASAL Tube: tube # Acquisition Date: 2-Apr-99 Gated Events: X Parameter FSC-H FSC-Height (Linear) Log Data Units: Linear Valúes Patient ID: 2/4/99 Panel: MODS Gate: No Gate Total Events: Y Parameten SSC-H SSC-Height (Linear) Región Events % Gated % Total XMear. XGeoMaan Y Mean YGeoMean Px.Py RÍ 2006 Ü Í7Í* R ,2 R Page

Units: Linear Valúes Patient ID: 2/4/99 Panel: MODS Gate: No Gate Total Events: 56643 Y Parameten SSC-H SSC-Height (Linear) Región

5 Counts Counls Counts Counls A Counts Counts Counts 200 o- a (O (D

6 SE APLICA LA REGIÓN R FSC.04 ",ÓP io io2 3 Ó4 C05 SE APLICA LA REGIÓN R2 FSC.04 co o ü o o To2 CD5 03 0* SE APLICA LA REGIÓN R3 FSC.04 0 FSC FSC-Height FSC.04 "o. csi 8 *" *-c o 0v,2" "lt« % 0' CD4S 0 FSC.04 co o J Q o- o o. 0" 0' 0 CD45 FSC.04 FSC.04 CD45 FSC.04 03

7 fscspii ' FSC-Height fscspi.034 File: fscspi.034 Sample ID: sp basal Patient ID: 26/6/99 Gate: G Total Events: 2270 Acquisition Date: 26-Apr-99 Gated Events: 2449 Quad Location: 7,4 LU ^i% Quad Events % Gated % Total XMean XGeoMean Y Mean YGeoMean UL UR LL LR o. fscspi ' '2 '3 CD3RTC P o- 0 0 CD3FITC fscspi.034 File: fscspi.034 Patient ID: 26/6/99 Gate: G Total Events: 2270 Sanrtple ID: sp basal Acquisition Date: 26-Apr-99 Gated Events: 2449 Quad Location: 2, 0 Quad Events % Gated % Total XMean XGeoMean Y Mean Y Geo" Mean UL UR LL LR CD56 PE Page

YGeoMean UL UR LL LR 256 260 435 498 0.45 0.62 7.76 6.7.20.22 2.05 7.04 2.96 270.06 3.26 254.45 2.73 220.57 220.62 407.66 99.74 4.48 3. 308.30 08.8 3.79 2.3 o. fscspi.

8 fscspi.034 File: fscspi.034 Patient ID: 26/6/99 Gate: G Total Events: 2270 Sample ID: spi basal Acquisrtion Date: 26-Apr-99 Gated Events: 2449 Marker Le», Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean AÜ, M , CD3FITC fscspi CD56PE fscsp..034 CD9TC 0 Page Z

Date: 26-Apr-99 Gated Events: 2449 Marker Le», Right Events % Gated % Total Mean Geo

9 F_S_C.OO3 O FSC-Height F_S_C.OO3 0" F_S_C.OO3 Total Events: 497 Gated Events: 9686 Quad Location: 5,22 Quad Events % Gated % Total XMean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR F_-S_C.G03 OJ CD3FTC 4 Page

Gated % Total XMean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL 7600 78.46 50.95 4.

10 F_S_C.OO3 File: F_S_C.OO3 Patient ID: L-20 Gated Events: 9686 Sample ID: F. S.C. Total Events: 497 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M F_S_C.OO3 0 F_S_C.OO3 0 Page 2

11 FSC FSC-Height FSC noj UJ 0C o- 'o. FSC cd20fitc 0" o. FSC cd20fitc 03 0" Page

12 FSC M 0" CD20FITC 0" FSC File: FSC Patient ID: ED 24 h Gated Events: 964 Sample ID: fsc 20//98 Total Events: 4458 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M FSC Ríe: FSC Patient ID: ED 24 h Gated Events: 964 Sample ID: fsc 20//98 Total Events: 4458 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M Page 2

PeakCh M 964 400 568 00.00 20.37 79.84 3.58 2.77 0.85 8.58 3.94 47.55 42.88 3.53 80.73 2 2 203 FSC209.034 0 Ríe: FSC209.

13 F_S_C.O FSC-Height F_S_C.O22 8 u o- F_S_C.O22 OJ 2 CD20FITC Gde: G2 Total Events: 4836 Gated Events: 9900 Quad Location: 5,22 Quad Events % Gated % Total XMean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR ' F_S_C.O22 02 CD20FITC

5,22 Quad Events % Gated % Total XMean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL 68.70.

14 F_S_C.O22 M 0' 02 CD20FTC ""' A Ríe: F_S_C.O22 Patient ID: L-20 Gated Events: 9900 Sample ID: F. S.C. Total Events: 4836 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M F_S_C.O Ríe: F_S_C.O22 Patient ID: L-20 Gated Events: 9900 Sample ID: F. S.C. Total Events: 4836 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M F_S_C.O22 2 CD9PerCP 0 Ríe: F_S_C.O22 Patient ID: L-20 Gated Events: 9900 Sample ID: F. S.C. Total Events: 4836 Marker Events % Gated % Total Mean. GeoMean Peak PeakCh MI Page2

00 2.5 97.89 66.73.44 65.32 203.35 7.00 207.59 34.22 5.96 43.59 53 4 53 52 52 F_S_C.O22 2 CD9PerCP 0 Ríe: F_S_C.O22 Patient ID: L-20 Gated Events: 9900 Sample ID: F. S.C. Total Events: 4836 Marker Events % Gated % Total Mean.

15 fscleti.003 fscleti FSC-Height Total Events: 8897 Gated Events: 293 Quad Location: 6. S Quad Events % Gated % Total X Mean XGeoMean Y Mean YGeoMean UL UR LL LR fscleti CD8FITC OJ O. * 2 CD4PE fscleti.003 o o- '.- '., 02 CD8FITC 3 0* Page

S Quad Events % Gated % Total X Mean XGeoMean Y Mean YGeoMean UL 379 47.34 5.50 2.53 2.33 53.99 30.

16 fsclet.003 M File: fscleti.003 Patient ID: 26/6/99 Gated Events: 293 Sample ID: leti Total Events: 8897 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M fscleti.003 0' hile: fscleti.003 Patient ID: 26/6/99 Gated Events: 293 Sample ID: leti Total Events: 8897 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M fscleti File: fscleti.003 Patient ID: 26/6/99 Gated Events: 293 Sample ID: leti Total Events: 8897 to Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh Ail M Page 2

003 Patient ID: 26/6/99 Gated Events: 293 Sample ID: leti Total Events: 8897 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M 293 020 425 00.00 35.02 48.92 32.74.46 6.02 75.80 3.2 52.

17 GATED3FSC FSC-Height GATED3FSC.003 Total Events: 4667 Gated Events: 4 Quad Location: 6, 8 OJ üj Quad Events % Gated % Total XMean XGeoMean Y Mean YGeoMean tu* UL UR LL LR : o. o *.V"! ^ GATED3FSC.003 CD8FITC hí o. '.* ' 0' i CD4PE 3 '4 GATED3FSC.003 /O Page

Total XMean XGeoMean Y Mean YGeoMean tu* UL UR LL LR 5 0.32 0.25 3.09 8.62 0.04 38.

18 GATED3 FSC CD8FITC File: GATED3 FSC.003 Patient ID: 2/4/99 GatedEvents: 4 SamplelD:SP0BASAL Total Events: 4667 Marker Events %Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M GATED3 FSC.003 0' 0 File: GATED3 FSC.003 Patient ID: 2/4/99 GatedEvents: 4 SamplelD:SP0BASAL Total Events: 4667 Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh M GATED3 FSC.003 Page 2

856 258 00.00 76.84 23.6 2.39.84 0.55 52.75 2.5 220.66 5.3.92 32.82 00 00 5 305 GATED3 FSC.003 0' 0 File: GATED3 FSC.

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