Columnas Acquity UPLC & Nuevos Rellenos LC Bàrbara Bagó Facultad Química - Universidad de Sevilla 3 de Noviembre 2011

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1 Columnas Acquity UPLC & Nuevos Rellenos LC Bàrbara Bagó Facultad Química - Universidad de Sevilla 3 de Noviembre Waters Corporation

2 Agenda Columnas Acquity UPLC HILIC Nuevos Rellenos en Fase Reversa HSS CN HSS PFP Nuevas columnas 2.5 um extended Performance [XP] 2011 Waters Corporation 2

3 Columnas Waters ACQUITY UPLC BEH Amide ACQUITY UPLC BEH Glycan ACQUITY HSS HPLC Columns µbondapak Styragel Spherisorb PrepPak DeltaPak 1986 SymmetryShield Symmetry ACQUITY UPLC BEH SunFire Columns XTerra XTerraPrep ACQUITY UPLC HSS C 18 and HSS C 18 SB XBridge Nova-Pak ProteinPak TM Pico-Tag TM AccQTag TM Atlantis Atlantis T3 ACQUITY UPLC HSS T3 AccQTag TM Ultra Symmetry 300 Atlantis HILIC Silica Prep OBD Intelligent Speed TM BioSuite NanoEase XBridge HILIC ACQUITY UPLC BEH200 SEC XSelect CSH HPLC columns ACQUITY CSH Columns Viridis SFC Columns ProteinPak High Rs IEX 2011 Waters Corporation 3

4 La oferta más amplia en Columnas UPLC Hasta los K PSI 5 partículas base 130Å, 200Å and 300Å BEH [Ethylene Bridged Hybrid], HSS [High Strength Silica] and CSH [Charged Surface Hybrid] Todos disponibles en tamaños de partícula HPLC y UPLC Amplia y creciente selección de rellenos de columna 15 fases estacionarias BEH 130Å C 18, C 8, Shield RP 18, Fenil, HILIC y Amida BEH C 18 BEH C 8 BEH Fenilo BEH Shield RP18 BEH HILIC BEH 300Å C 18 y C 4 BEH 200Å SEC HSS C 18, T3, C 18 SB, HSS CN & HSS PFP CSH C 18, Fluoro-Fenilo y Fenilo-Hexilo Contrastadas soluciones para aplicaciones específicas AAA, OST, PST, PrST y Glicanos Escalabilidad entre HPLC y UPLC Columnas XBridge HPLC y ACQUITY UPLC BEH Columnas HSS HPLC y ACQUITY UPLC HSS Columnas XSelect HPLC y ACQUITY CSH Precolumnas VanGuard Tecnología ecord BEH Amida HSS T3 HSS C 18 HSS C 18 SB CSH C 18 CSH Fluoro-Fenilo CSH Fenilo-Hexilo O 2011 Waters Corporation 4 O O Si O O O Si O O O Si F F F F F

5 Precolumnas VanGuard Diseñadas para aplicaciones UPLC Las primeras y únicas precolumnas desarrolladas para trabajar en rutina a presiones de hasta psi ( bar) Diseño de muy baja dispersión Protección de la columna de UPLC, manteniendo su eficacia 2011 Waters Corporation 5

6 Dimensiones Columnas ACQUITY UPLC Diámetro interno (1.0 mm, 2.1 mm y 3.0 mm) Como recomendación genérica usar 2.1 mm Usar sólo 1 mm en situaciones específicas o Volumen de muestra muy pequeño Nuevas columnas de 3.0 mm id o Recomendadas en separaciones isocráticas o Superior capacidad de carga Longitud (30 mm, 75 mm, 50 mm, 100 mm y 150 mm) Si el objetivo prioritario es RAPIDEZ o Empezar con 50 mm de longitud Si el objetivo prioritario es RESOLUCION o Empezar con 100 mm de longitud 2011 Waters Corporation 6

7 Columnas UPLC - Nuevas dimensiones: 75 mm longitud 2011 Waters Corporation 7

8 Columnas Acquity CSH [Charged Surface Hybrid]: Tecnología CSH Amplio rango de selectividades con un elevado nivel de reproducibilidad Superior forma de pico/capacidad de carga para compuestos básicos Idealmente adecuadas para fases móviles con baja fuerza iónica, sin tamponar o bien tamponadas Rápido equilibrado de columna al cambiar entre diferentes ph s Excepcional reproducibilidad lote - a - lote Escalabilidad entre plataformas tecnológicas HPLC y UPLC 2011 Waters Corporation 8

9 Columnas Acquity CSH [Charged Surface Hybrid]: CSH C 18 Mid/high coverage trifunctional C 18 Particle size: 1.7 µm [UPLC]; 3.5 and 5 µm [XSelect HPLC Columns] ph range: 1 11; Temp. limit: 80 C Superior peak shape for bases in buffered and low ionic strength mobile phases Lower retentivity for bases (vs. BEH C 18 ) CSH Fluoro-Phenyl Non end-capped trifunctional pentafluorophenyl (PFP) Particle size: 1.7 µm [UPLC]; 3.5 and 5 µm [XSelect HPLC Columns] ph range: 1 8; Temp. limit: 60 C Exceptional peak shape and lower retentivity for bases with exceptional selectivity differences Market-leading reproducibility CSH Phenyl-Hexyl Trifunctional phenyl-hexyl Particle size: 1.7 µm [UPLC]; 3.5 and 5 µm [XSelect HPLC Columns] ph range: 1 11; Temp. limit: 80 C Exceptional peak shape for bases Complementary selectivity for aromatic species 1.7 µm UPLC HPLC 3.5, 5 µm 2011 Waters Corporation 9

10 Tecnología CSH: Controlled Surface Charge Yields High Performance ACQUITY CSH C µm 0.05 % formic acid Peak capacity =71 AU AU Minutes Fused Core C µm 0.05 % formic acid Peak capacity = 26 Column: 2.1 x 50 mm MP A: water MP B: acetonitrile MP C: 2% formic acid Gradient: 25-35%B in 2 min, 35 95%B from 2-3 min; [2.5% C held constant] Inj. Vol.: 5 µl Sample Conc.: 10 µg/ml Detection 254 nm Sampling rate: 20 Hz Filter: 0.1 sec System: ACQUITY UPLC H-Class with ACQUITY UPLC PDA and SQD Tricyclic antidepressants: 1. Doxepin 2. Desipramine 3. Imipramine 4. Nortriptyline 5. Amitriptyline 6. Trimipramine Minutes 2011 Waters Corporation Comparative separations may not be representative of all applications 10

11 Columnas Acquity BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: Tecnología BEH Columnas de aplicación general Amplio rango de compuestos Fases móviles tamponadas Estabilidad a ph elevado es lo más importante Excepcional comportamiento cromatográfico en cualquier plataforma tecnológica Elevada eficiencia, forma de pico y estabilidad Combinación exclusiva de rango de ph, límite de temperatura y presión Escalabilidad entre plataformas tecnológicas HPLC y UPLC Amplio rango de fases estacionarias Tecnología de partícula híbrida adecuada para el desarrollo de métodos 2011 Waters Corporation 11

12 Columnas Acquity BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: Químicas Fase Reversa BEH C 18 Enlace trifucnional - ligando C18 Tamaño partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5, 5 y 10 µm [Columnas HPLC XBridge] Rango ph: 1 12; Límite temp.: 80 C Excepcional eficacia y forma de pico BEH C 8 Enlace trifuncional- ligando C8 Tamaño partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5, 5 y 10 µm [Columnas HPLC XBridge] Rango ph: 1 12; Límite temp.: 60 C Menor hidrofobicidad que C 18 BEH Shield RP18 Enlace monofuncional, grupo carbamato embebido [ph 2 11] Tamaño partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5, 5 y 10 µm [Columnas HPLC XBridge] Rango ph: 2 11; Límite temp.: 50 C Selectividad alternativa 1.7 µm UPLC HPLC 2.5, 3.5, 5 & 10 µm BEH Fenilo Enlace trifuncional ligando C 6 -Fenilo Tamaño partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC XBridge] Rango ph: 1 12; Límite temp.: 80 C Selectividad complementaria para compuestos aromáticos 2011 Waters Corporation 12

13 Columnas Acquity HSS [High Strength Silica] 1.8 µm HSS T3 Baja densidad de ligando, enlace trifucnional - ligando C 18 [ph 2 8] Tamaño de partñicula: 1.8 µm [UPLC]; 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC HSS] Rango ph: 2 8; Límite temp.: 45 C C 18 compatible con fases móviles acuosas con elevada vida de columna Recomendada para máxima retención de compuestos polares en fase reversa UPLC HPLC 3.5 and 5 µm HSS C 18 Elevada cobertura, enlace trifuncional ligando C 18 [ph 1 8] Tamaño de partícula: 1.8 µm [UPLC]; 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC HSS ] Rango ph: 1 8; Límite temp.: 45 C Universal, elevado comportamiento C 18 Proprietary endcapping technique for superior peak shape and lifetime HSS C 18 SB [Selectivity para Bases] Baja densidad de ligando, enlace trifuncional - ligando C 18 [ph 2 8] Tamaño de partícula: 1.8 µm [UPLC]; 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC HSS] Rango ph: 2 8; Límite temp.: 45 C C 18 sin endcapping diseñada para in teracción silanólica y selectividad alternativa 2011 Waters Corporation 13

14 Analitos Polares Límitaciones en la Aproximación por Fase Reversa Inferior sensibilidad en la detección por MS Los analitos se retienen en un elevado contenido acuoso en la fase móvil Más difícil desolvatar fases móviles acuosas en MS Retención inadecuada si el analito está cargado Los analitos con elevado pka se retendrán menos en las fases móviles habituales a ph ácido Qué opciones existen para mejorar la retención de compuestos polares? Probar HILIC 2011 Waters Corporation 14

15 Qué es HILIC? HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography Retención de compuestos altamente polares no retenidos por fase reversa Menor interferencia de componentes de la matriz Selectividad complementaria a la fase reversa Los pesticidas polares se retienen más que las interferencias Hidrofóbicas Sensibilidad superior en MS Fases móviles con elevado contenido orgánico (> 80% ACN) favorece la respuesta ESI-MS Inyección directa de extractosaltamente orgánicos sin dilución Facilita el uso de pequeños volúmenes de muestra Elevado procesamiento de muestras Inyección directa de extractos de elevado contenido orgáncio que provienen de PPT, LLE o SPE sin necesidad de diluir o bien evaporar y reconstituir 2011 Waters Corporation 15

16 Columnas Acquity BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: Químicas HILIC BEH HILIC Partícula híbrida puente etileno sin funcionalizar Tamaño de partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC XBridge] Rango ph: 1 9; Límite temp.: 45 C Excepcional forma de pico y retención para analitos básicos polares 1.7 µm UPLC BEH Amida Selectividad alternativa para separaciones HILIC Tamaño de partícula: 1.7 µm [UPLC]; 3.5 µm [Columnas HPLCXBridge] Rango ph: 2 11; Límite temp.: 90 C Diseñada para la retención de analitos polares ácidos, neutros y básicos Columna ideal para carbohidratos/azúcares y glicanos HPLC 2.5, 3.5, 5 & 10 µm 2011 Waters Corporation 16

17 Comparación Selectividad BEH Amida vs. BEH HILIC AU ACQUITY UPLC BEH HILIC 2.1 x 100 mm, 1.7 µm Compounds 1. Methacrylic Acid 2. Cytosine 3. Nortriptyline 4. Nicotinic Acid ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 x 100 mm, 1.7 µm AU Minutes Isocratic mobile phase of 90/5/5 ACN/EtOH/10 mm CH 3 COONH 4 in H 2 O with 0.02% CH 3 COOH, flow rate 0.5 ml/min, column temp. 25 C, 1.5 µl injection, 60 µg/ml each compound, sample diluent 75/25 ACN/MeOH, UV 210 nm 2011 Waters Corporation 17

18 Análisis azúcares en Columna 1.7µm BEH Amida ACQUITY ELSD using 0.29mL/min at 35 C, Isocratic with 0.2%TEA in 75% ACN 1 P-Toluamide Food Sugars (1mg/mL) Blueberry Jam Extract (5mg/mL) Minutes 1) Fructose, 2) Glucose, 3) Sucrose, 4) Maltose, 5) Lactose 2011 Waters Corporation 18

19 Agenda Columnas Acquity UPLC HILIC Nuevos Rellenos en Fase Reversa HSS CN HSS PFP Nuevas columnas 2.5 um extended Performance [XP] 2011 Waters Corporation 19

20 2 Plataformas en Columnas LC completamente escalables Familia diseñada y optimizada para Estabilidad ph Columnas LC más compatibles con detección MS en el mercado Familia diseñada y optimizada para Selectividad Múltiples sustratos de partícula para resolver múltiples problemas cromatográficos 1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 y 10 µm 1.7 [UPLC], 2.5, 3.5 y 5 µm CSH 1.8 [UPLC], 2.5, 3.5 y 5 µm HSS 2011 Waters Corporation 20

21 Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH: 2005 ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl ACQUITY BEH C8 XBridge C8 ACQUITY BEH C18 XBridge C18 ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP Waters Corporation 21

22 Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, HSS: 2008 ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl ACQUITY BEH C8 XBridge C8 ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18 ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3 ACQUITY BEH C18 XBridge C18 ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C Waters Corporation 22

23 Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, XSelect CSH & HSS: 2010 ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl ACQUITY BEH Phenyl XSelect CSH Fluoro-Phenyl XBridge Phenyl ACQUITY BEH C8 XBridge C8 ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18 ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3 ACQUITY BEH C18 XBridge C18 ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18 ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C Waters Corporation 23

24 Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, XSelect CSH & HSS: 2011 ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP ACQUITY HSS CN XSelect HSS CN ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl ACQUITY BEH Phenyl Xselect CSH Fluoro-Phenyl XBridge Phenyl ACQUITY BEH C8 XBridge C8 ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18 ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3 ACQUITY BEH C18 XBridge C18 ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18 ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C Waters Corporation 24

25 Nuevos Rellenos XSelect/ACQUITY UPLC HSS PFP Selectividad excepcional para isómeros posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares HSS Ciano Estable, compatible con RP & NP, química CN reproducible Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C Waters Corporation 25

26 Descripción Producto XSelect HSS/ACQUITY UPLC HSS CN Ofrece al cromatografista una fase para: Baja hiydrofobicidad para una rápida elución de los analitos hidrofóbicos Selectividad única Compatible con Fase Normal Beneficios Diferenciales: Significativa menor retención que C18 (típicamente requiere menor % orgánico en fase móvil) Compatible con fases móviles altamente acuosas Estable, bajo sangrado en separaciones LC-MS 2011 Waters Corporation 26

27 Mezcla Compuestos Básicos en columna CN Ambas Columnas: 2.1 x 50 mm, 1.7 μm ó 1.8 μm 2 ACQUITY UPLC HSS CN Zorbax SB-CN Compuestos: 1. Aminopyrazine 2. Pindolol 3. Quinine 4. Labetalol 5. Verapamil 6. Diltiazem 7. Amitriptyline Gradiente: 30% al 60% MeOH con Formiato Amónico 10 mm 2011 Waters Corporation 27

28 Descripción Producto: XSelect HSS/ACQUITY UPLC HSS PFP Ofrece al cromatografista mecanismos de selectividad múltiples que incluyen: puentes de hidrógeno dipolo-dipolo aromáticos (pi-pi) hidrofóbico (fase reversa) Análisis: Isómeros posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares Simple positioning vs. CSH Fluoro-Phenyl HSS PFP: SUPERIOR retención de compuestos básicos CSH Fluoro-Fenil: MENOR retención de compuestos básicos 2011 Waters Corporation 28

29 UPLC Gama Selectividad Derivados Ácido Caféico CSH Fluoro-Fenil HSS PFP Condiciones : Columns: 2.1 x 50 mm Mobile Phase A: 0.1% CF 3 COOH in H 2 O Mobile Phase B: 0.08% CF 3 COOH in ACN Flow Rate: 0.5 ml/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B Injection Volume: 1.0 µl Sample Diluent: 50:50 H 2 O: MeOH with 0.05% CF 3 COOH Sample Conc.: 100 µg/ml Temperature: 40 o C Detection: 330 nm Sampling rate: 40 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters ACQUITY UPLC, with ACQUITY UPLC TUV Compuestos Ácidos 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid Minutes 2011 Waters Corporation 29

30 Comaparación: Antidepresivos Tricíclicos ACQUITY UPLC HSS PFP, 1.8 µm, 2.1 X 50mm 3 RPH Ave = Compounds 1. Trimethoprim 2. Nordoxepin 3. Doxepin 4. Nortriptyline 5. Imipramine 6. Amitriptyline 7. Trimipramine Kinetex PFP, 1.7 µm, 2.1X50 mm RPH Ave = System: ACQUITY UPLC H-Class with ACQUITY UPLC PDA Detector Mobile Phase A: 10mM NH4COOH, ph3.0 Mobile Phase B: ACN Isocratic Mobile Phase: 60:40; A:B Flow Rate: 0.5 ml/min Injection Volume: 1 µl Column Temperature: 30 C UV Detection: 254 nm Waters Corporation 30

31 Agenda Columnas Acquity UPLC HILIC Nuevos Rellenos en Fase Reversa HSS CN HSS PFP Nuevas columnas 2.5 um extended Performance [XP] 2011 Waters Corporation 31

32 Nuevas Columnas 2.5 um XP extended Performance [XP] Empaquetadas en hardware de baja dispersión hardware UPLC Diseñadas para trabajar hasta presiones de 18000psi Compatibles con tecnología HPLC, UHPLC & UPLC Configuraciones disponibles: Diámetros: 2.1 mm / 3.0 mm (4.6 mm Enero 2012) Longitudes: 30 mm / 50 mm / 75 mm / 100 mm 14 Fases Estacionarias Empaquetadas con partículas XBridge [BEH], XSelect [CSH&HSS] de 2.5 um con los siguientes ligandos: BEH C18, Shield RP18, C8, HILIC & Amide CSH C18, CSH Fenil-Hexil, CSH Fluoro-Fenil HSS C18, T3, C18 SB, Ciano & PFP 2011 Waters Corporation 32

33 Columnas 2.5 µm extended Performance [XP] Rápida Optimización de Métodos guiados por Farmacopea (USP, EP) Las columnas 2.5 µm XP ofrecen la flexibilidad para transferir métodos HOY (de acuerdo con las guías de reducción del 50% del tamaño de partícula; 5 µm-a-2.5 µm) Baja Contrapresión, Elevado Throughput, Incremento de la Productividad 40% menor contrapresión que las columnas de UPLC < 2 µm Aumento del caudal para aumentar throughput en cromatografía HPLC - NOTA: La sensibilidad y la resolución se reducirán Presión equivalente y comportamiento superior a las columnas core-shell Aumento de la productividad HPLC en 2-4X comparado con columnas HPLC µm Inigualable Disponibilidad de Selectividad 14 químicas que incluyen C 18, Fenil-Hexil, C 8, Grupo Polar Embebido, HILIC, Amide así como las nuevas columnas Ciano & PFP 3 partículas diferentes que incluyen sílice, híbrida y híbrida con carga en la superficie Directamente escalable a columnas UPLC 1.7/1.8 µm y columnas HPLC como 3.5/5 µm +160 configuraciones resultan en 380 referencias 2011 Waters Corporation 33

34 Aumento de la Productividad AU Tolmetin Naproxen Fenoprofen Indomethacin Diclofenac XSelect CSH C x 100 mm, 3.5 µm Sistema HPLC 3.5 µm Minutes AU XSelect CSH C 18 XP 4.6 x 75 mm, 2.5 µm HPLC System 2.5 µm XP X más rápido que 3.5 µm HPLC Minutes AU ACQUITY UPLC CSH C x 50 mm, 1.7 µm UPLC System 1.7 µm X más rápido que 3.5 µm HPLC 5X más rápido que 2.5 µm HPLC Minutes Waters Corporation 34

35 Curvas van Deemter µm ACQUITY UPLC BEH C 18 Observaciones: Plate Height (H, 4 sigma) h = HETP d p 2. 5 µm XBridge BEH C 18 XP 2. 6 µm Core-Shell C Linear Velocity, u (cm/sec) v u d = D Acenaphthene, 2.1 x 50 mm columns m p 70/30 MeCN/H 2 O, 30 C, 254 nm Comportamiento similar de partículas core-shell 2.6 µm y partículas completamente porrosas 2.5 µm 1.7 µm ofrece una eficacia superior comparado con tamaños de partícula mayores 2011 Waters Corporation 35

36 Eficacia vs. Caudal Plate Count (4 sigma) Flow Rate (ml/min) 1.7 µm ACQUITY UPLC BEH C µm XBridge BEH C 18 XP 2.6 µm Core-Shell C 18 Acenaphthene, 2.1 x 50 mm columns 70/30 MeCN/H 2 O, 30 C, 254 nm Observaciones: Cuando se realiza un gráfico eficacia vs. caudal, se observa que un tamaño de partícula menor siempre ofrecerá mejor eficacia que uno superior Partículas completamente porosas 2.5 µm y partículas 2.6 µm core-shell ofrecen la misma eficacia Qué sucede con la presión? 2011 Waters Corporation 36

37 Comparación Contrapresión: Completamente Porosa vs. Core-Shell µm XBridge BEH C 18 XP Observaciones: Pressure (psi) µm Core-Shell C 18 Partículas completamente porosas 2.5 µm y partículas 2.6 µm porosas en la superficie produce n la misma contrapresión Flow Rate (ml/min) 2.1 x 50 mm columns 70/30 MeCN/H 2 O, 30 C, 254 nm 2011 Waters Corporation 37

38 Impacto de la Dispersión del Instrumento en el Rendimiento de la Columna AU Tolmetin Naproxen Fenoprofen Indomethacin Diclofenac Alliance 2695 HPLC XSelect CSH C 18 XP 4.6 x 75 mm, 2.5 µm Instrumento UPLC de Ultra-baja dispersión mejora el rendimiento de la columna, incluso con diámetros de 4.6 mm Minutes ACQUITY UPLC H-Class XSelect CSH C 18 XP 4.6 x 75 mm, 2.5 µm A: agua con 0.1% ácido fórmico B: acetonitrilo con 0.1% ácido fórmico Caudal: 1.4 ml/min Mezcla NSAID ( ug/ml) Detección UV a 270 nm AU % disminución anchura pico 30% aumento altura pico Gradiente (2.5µm): 35%B mantenido durante 2.37 min, rampa al 65%B en 9.05 min, mantenido durante 0.41 min, re-acondicionamiento al 35%B Minutes 2011 Waters Corporation 38

39 Resolución, Throughput y Sensibilidad: Comparación entre Columnas 2.5 µm XP y 1.7 µm UPLC AU Tolmetin Naproxen Fenoprofen Indomethacin Diclofenac XSelect CSH C 18 XP 2.1 x 75 mm, 2.5 µm Caudal: 0.54 ml/min Columna 1.7 µm ACQUITY UPLC ofrece 2X mayor velocidad y 20% mayor sensibilidad comparado con columnas 2.5 µm XP mientras se mantiene la selectividad AU Minutes ACQUITY UPLC CSH C x 50 mm, 1.7 µm Caudal: 0.8 ml/min Minutes A: agua con 0.1% ácido fórmico B: acetonitrilo con 0.1% ácido fórmico Mezcla NSAID ( ug/ml) Detección UV a 270 nm Gradient e(2.5µm): 35%B al 65%B en 4.85 min, mantenido durante 0.66 min, re-acondicionamiento al 35%B. Gradiente (1.7µm): 35%B al 65%B en 2.20 min, mantenido durante 0.3 min, re-acondicionamiento al 35%B. Las 2 columnas se usaron en un sistema ACQUITY UPLC H-Class 2011 Waters Corporation 39

40 Transferencia a UPLC 2011 Waters Corporation 40

41 2010 Waters Corporation

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