AMPLIFICACIÓN DE ADN POR REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR)

Transcripción

1 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Fajardo Departamento de Ciencias y Tecnología AMPLIFICACIÓN DE ADN POR REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR) Trasfondo La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica de amplificación del ADN que ha revolucionado case todos los aspectos la investigación biológica. Inventada en el 1984 por el Dr. Kary Mullis, y reconocida mediante de un premio Nobel en La técnica permite que una cantidad pequeña de ADN pueda ser amplificada más de un millón de veces. Se ha utilizado para diagnosticar enfermedades de origen genético y también para crear clones. Se utilizó en el Proyecto del Genoma Humano para crear un mapa de las secuencias de todos los genes humanos. Se utiliza extensamente en ciencias forenses, pruebas de paternidad y para identificar restos humanos. La reacción es posible debido a la estabilidad térmica de ciertos tipos de polimerasas de ADN. La más utilizada es la Taq polimerasa obtenida de la bacteria Thermus aquaticus que habita en los baños termales. Esta enzima se mantiene estable a temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua. Esta carácterística le permite a la bacteria reproducirse en ambientes de temperatura extrema lo que no ocurre con las polimerasas de la mayoría de especies que viven en la Tierra incluyendo los humanos. Sin embargo, puede ser utilizada para amplificar ADN de cualquier origen incluyendo el ADN humano. La reacción también requiere los cuatro deoxinucleótidos utilizan los organismos para formar ADN, datp, dttp, dctp y dgtp. Además se requiere iniciadores (primers) que facilitan que la polimerasa se pegue al ADN que se va a amplificar. Típicamente se utilizan un par de oligonucleótidos sintéticos de pares de bases de largo para la reacción en el laboratorio. Estos iniciadores son sintetizados in vivo (dentro de organismos vivos) por una enzima llamada primasa y consisten de pedazos de ARN. Todos estos componentes se incuban en presencia de un amortiguador que contiene Mg 2+. Los iniciadores se diseñan y sintetizan para que correspondan al principio y final de la secuencia que se quiere amplificar, conocido como el templado. Lo ideal es 1 PCR

2 utilizar ADN aislado recientemente para evitar que sea degradado en especimenes más viejos. El proceso de PCR se realiza en tres pasos a distintas temperaturas (figura 1). Luego de mezclar la polimerasa con el amortiguador, los nucleótidos, iniciadores y el templado se somete dicha mezcla a distintas temperaturas. Los cambios en temperatura facilitan los pasos de denaturación, hibridización y extensión. A continuación se describen los tres pasos: 1) Denaturación: se hierve cerca del punto de ebullición (92-96 C) para denaturar o derretir el ADN. Este paso rompe los puentes de hidrógeno entre las hebras complementarias de ADN lo que ocasiona que se separen totalmente. 2) Hibridización (annealing): la mezcla se enfría entre C esto permite que se mantengan separadas las hebras complementarias para que se peguen los iniciadores que incluye la mezcla y que están diseñados para pegarse a la secuencia del gene que se quiere amplificar. 3) Extensión: las temperaturas se elevan a un valor intermedio que generalmente es de 72 C. A esa temperatura la polimerasa Taq esta en su punto de actividad máxima lo que facilita que se añadan los nucleótidos a los iniciadores para completar la síntesis de las hebras complementarias. La temperatura exacta al igual que el tiempo de incubación depende de factores tales como: el largo de la secuencia que se quiere amplificar, el contenido de enlaces GC y la relación de iniciador a templado. Hay casos donde se pueden combinar los últimos dos pasos (hibridación y extensión) en uno solo por ciclo de PCR. Los tres pasos de PCR constituyen un ciclo y resultan en la duplicación del número de copias del templado en la mezcla. Este proceso se repite de veces o ciclos. Teóricamente si se permite que la reacción se repita n veces el número de copias del templado que se formarán es 2 n (vea final de figura 1). Por ejemplo, luego de 20 ciclos tendrás un millón de copias. El máximo que se produce realmente ocurre cerca de los 40 ciclos ya que se acaban los reactivos y la polimerasa pierde actividad. Un problema común que ocurre durante el PCR es la amplificación de productos no deseados. Esto se debe a la contaminación de las muestras con iniciadores no específicos (mal diseñados). Para reducir la contaminación los tubos, puntas de pipetas y agua deben estar autoclaveados. También deben utilizarse guantes todo el tiempo. Para minimizar productos no deseados la concentración de iniciadores debe minimizarse si es posible. Otra técnica común se llama hot start donde se añaden todos los componentes de la reacción después que se denatura el ADN a 90 C. 2 PCR

3 Después de completar la reacción los productos del PCR se siguen procesando dependiendo del objetivo del experimento. Generalmente el ADN se somete a electroforesis de gel en agarosa o poliacrilamida. En ciencias forenses el ADN de la escena del crimen se compara con el ADN del sospechoso siguiendo la técnica llamada fingerprinting. Si se pretende clonar el ADN, se pega a un vector que puede ser un virus. En experimentos de secuenciación, el ADN amplificado (generalmente marcado radioactivamente) se corre en una gel fina de secuenciación de poliacrilamida. Luego se coloca en una película que se activa con la radioactividad de las moléculas y se desarrolla para crear la imagen de los fragmentos de ADN en la gel. También puede teñirse con granos de plata que se pegan directamente al ADN para evitar utilizar radioactividad. Descripción del experimento En este experimento los estudiantes aprenderán los conceptos básicos de PCR observando el aumento en producto según aumentan los ciclos. El experimento se dividirá en tres módulos: preparando y corriendo la reacción de PCR, electroforesis de gel para separar los productos de la reacción y la visualización de los patrones y tamaños del ADN al compararlos con marcadores de ADN estándar. Objetivos: Al concluir el experimento los estudiantes podrán: 1. Determinar el número de moléculas de ADN que se pueden obtener en un PCR a base del número de ciclos 2. Determinar gráficamente el tamaño de productos de PCR Antes del experimento 3 PCR

4 1. Lee el trasfondo y todas las instrucciones antes de comenzar el experimento. 2. Escribe una hipótesis que refleje el experimento y prediga los resultados del mismo en tu libreta de laboratorio. 3. Resume el procedimiento en tu libreta de laboratorio. 4. Contesta las preguntas siguientes y estúdialas para la prueba corta: a. Qué característica tiene la polimerasa Taq que la hace ideal para amplificar pedazos de ADN? b. Haz una lista de los componentes que requiere la reacción. c. Indica los tres pasos que envuelve cada ciclo y describe cada uno. Pre- evaluación 1. Evalúa tu habilidad para formular una hipótesis para este experimento utilizando una escala del 1 al 5 según se indica: Valor Pre-avalúo de la habilidad para formular una hipótesis Significado 1 No tengo idea de dónde empezar 2 Puedo sólo señalar las variables del experimento. 3 Puedo identificar las variables del experimento pero desconozco cómo hacer inferencias o predicciones con éstas. 4 Sólo puedo señalar las variables y hacer una hipótesis en forma de pregunta. 5 Puedo formular una hipótesis que recoja las variables que considerará el experimento y unos resultados esperados. Auto preevaluación 2. Evalúa tu habilidad para correr una reacción de PCR y separar los productos por electroforesis con geles de agarosa antes de empezar el experimento. Coloca una marca bajo la alternativa que mejor describe tu habilidad o dominio de la destreza. 4 PCR

5 Pre-avalúo del grado de dominio de las destrezas Destrezas Grado de Dominio de la Destreza Uso de la micropipeta Preparar geles de agarosa Cargar geles y correr equipos de electroforesis horizontales Determinar el número de moléculas de ADN que se obtienen de un PCR a base del número de ciclos Preparar gráfica semilogarítmica en Xcel Determinar gráficamente el tamaño de productos de PCR 1. No tengo idea de cómo realizar la tarea. 2. Aunque completo la tarea me toma más tiempo del asignado y cometo muchos errores. 3. Realizo la tarea completa me toma más tiempo y aún cometo algunos errores. 4. Puedo realizar la tarea esperada y en el tiempo máximo asignado. Los resultados son buenos y no suelo comentar errores. 5. Domino la tarea en un tiempo mínimo. Los resultados son excelentes. Me siento seguro(a) realizando la tarea. Medidas de seguridad Siempre debes utilizar guantes y gafas de seguridad cuando trabajas con reactivos químicos. También debes utilizar rutinariamente tu bata de laboratorio y zapatos cerrados al frente. El bromuro de etidio es un mutagénico por lo que deben utilizarse guantes al manipularlo. 5 PCR

6 Descarta los InstaStain TM /EtBr y geles en el lugar destinado para ello en el laboratorio. Procedimientos experimentales Reacción de PCR con ciclador termal (Termal Cycler) (Figura 1) 1. Si tu ciclador no tiene una tapa que se calienta debes obtener una esfera para añadir al tubo con la mezcla de PCR. 2. Para preparar el tubo de la reacción de PCR rotula el tubo que contiene la esfera de PCR escribiendo PCR. Esta esfera contiene la enzima polimerasa Taq, los deoxinucleótidos, Mg 2+ y amortiguador (buffer). 3. Añade al tubo de PCR lo siguiente: a. Templado de ADN para amplificar: 10 µl b. Mezcla de iniciadores: 10 µl c. Agua ultra pura: 7 µl 4. Mezcla todo suavemente en la mini-centrífuga hasta disolver el esfera. 5. Pasa a dos tubos de PCR pequeños 13 µl de la mezcla. 6. Rotula tres tubos de 0.5 ml según se indica: 0 (control), 15 y 30. Añade además las iniciales de tu grupo. 7. Al tubo 0 o control añade 2 µl de templado de ADN para amplificar, 2 µl de mezcla de iniciadores, 5 µl de 10X gel loading solution, 10 µl de agua ultra pura. Colócalo en hielo para usar luego. 8. Si usas un ciclador termal con tapa calentada ve directamente al paso siguiente. Si el ciclador no tiene la tapa para calentar añade un esfera de cera al tubo con la mezcla de PCR. 9. Ajusta tu ciclador termal según se indica: 94 C X 45 seg 45 C X 45 seg 72 C X 45 seg 10. Procesa para un total de 30 ciclos de acuerdo al programa que aparece abajo. En el ciclo final la incubación de 72 C se puede extender a 5 min. Estarás removiendo alícuotas de 7 µl según se indica: Parar después del ciclo Tiempo transcurrido Añadir al tubo min min 30 Notas: - Pausa el ciclador después de la incubación de 72 C después de cada tiempo transcurrido para remover una muestra - Después de obtener la muestra del ciclo 15 tu ciclador podría tener una opción para un programa que mantiene las muestras a 4 C toda la noche luego de completar el ciclo Después del ciclo 15 remueve el tubo rotulado 15 y añade 5 µl de 10 X gel loading solution y 8 µl de agua ultra pura a la muestra y guarda en hielo. 6 PCR

7 12. Continúa la reacción hasta el ciclo 30. Remueve el tubo 30 de la mezcla y añade 5 µl de 10X gel loading solution y 8 µl de agua ultra pura a la muestra que obtuviste y guarda en hielo. Figura 1: Protocolo de Preparación de Reacciones de PCR 2 µl templado 10 µl templado µl primers 10 µl primers μl agua ultrapura 7 µl agua + 5 µl 10X gel loading sol. Mezclar bien hasta disolver esfera Esfera de PCR Echar 13 µl en 2 tubos de PCR pequeños Control PCR 94 C X 45 seg. 45 C X 45 seg. 72 C X 45 seg. 15 ciclos 30 ciclos 7 µl 7 µl + 5 µl 10X gel loading sol. + 8 µl agua estéril Cubo de hielo Punto opcional para parar: Las muestras pueden congelarse hasta que se realice la electroforesis. Separación de las Reacciones de PCR por Electroforesis A. Preparación del molde de la gel 7 X 7 cm 1. Cierra los extremos de un molde de gel con la represa de goma o cinta adhesiva. 7 PCR

8 a. Represa de goma: 1) Coloca la represa de goma en cada extremo del molde de acrílico. 2) Asegúrate que la goma cae firmemente con el molde b. Cinta adhesiva de rotular: 1) Con una cinta de ¾, extiende la cinta sobre los lados y fondo del molde de acrílico. 2) Dobla los extremos extendidos de las cintas sobre los lados y el fondo del molde. 3) Presiona los lados doblados para que selle firmemente. 2. Coloca la peinilla en el primer juego de muescas al final del molde. Asegúrate que cae firmemente y de manera pareja sobre el molde. B. Preparación del molde de la gel 7 X 15 cm 1. Cierra los extremos de un molde de gel con la represa de goma o cinta adhesiva. c. Represa de goma: 1) Coloca la represa de goma en cada extremo del molde de acrílico. 2) Asegúrate que la goma cae firmemente con el molde d. Cinta adhesiva de rotular: 1) Con una cinta de ¾, extiende la cinta sobre los lados y fondo del molde de acrílico. 2) Dobla los extremos extendidos de las cintas sobre los lados y el fondo del molde. 3) Presiona los lados doblados para que selle firmemente. 2. Coloca la peinilla en el primer juego de muescas al final del molde. Coloca una segunda peinilla en el medio de las muescas. Asegúrate que cae firmemente y de manera pareja sobre el molde. C. Preparación de la gel 1. Utiliza un matraz de 250 ml para preparar la gel. Añade los siguientes componentes especificados con una pipeta de 1 ml (Ve tabla 3). Comienza con el amortiguador y el agua. Añade la agarosa. Tabla 3: Preparación de gel de Agarosa al 0.8% Tamaño de molde (cm) Agarosa (g) Amortiguador (buffer) concentrado (ml) Agua destilada (ml) Volumen total (ml) 7 X X X X X Mueve suavemente la mezcla para dispersar los grumos de agarosa. 3. Marca el nivel de la solución en la parte externa del matraz con un marcador. 4. Calienta la mezcla para disolver el polvo de agarosa. La solución debe verse clara como el agua y sin partículas. a) Microondas 1) Cubre con papel plástico para evitar la evaporación. 2) Calienta en high por 1 min. 8 PCR

9 3) Mueve la mezcla y vuelve a calentar por 25 seg cada vez hasta que desparezcan todos los grumos. b) Plato caliente: 1) Cubre el matraz con papel de aluminio para evitar la evaporación. 2) Calienta la mezcla hasta que hierva moviendo ocasionalmente. Hierve hasta que se disuelva la agarosa totalmente. 5. Enfría la agarosa a 55 C moviendo suavemente. Si bajó el volumen, echa agua hasta el nivel marcado originalmente. 6. Echa la agarosa en el molde colocado sobre una superficie firme y a nivel. Si observas burbujas saca las mismas con una punta de micropipeta limpia moviéndola hasta el extremo más cercano y antes de que comience a cuajar. 7. Espera a que se solidifique totalmente (20 min. aproximadamente). D. Preparando la gel para la electroforesis 1. Mientras la gel se solidifica prepara el amortiguador de electroforesis. Sigue la tabla 4: Tabla 4: Preparación del amortiguador de electroforesis Modelo Cámara Edvotek Amortiguador concentrado (50X) en ml Agua destilada (ml) Volumen total M M M12, M Luego de que la gel esté totalmente M36 (clara) solidificada, remueve cuidadosamente la cinta adhesiva. 3. Remueve suavemente la peinilla levantándola directamente hacia arriba. 4. Coloca la gel con su molde en la cámara de electroforesis (los pozos deben estar en el lado negativo ya que las cargas negativas del DNA hace que éste migre hacia el lado positivo). 5. Llena el aparato de electroforesis con el volumen adecuado de amortiguador diluído que preparaste en el paso C Asegúrate que la gel esté completamente cubierta con el amortiguador. D. Separación de reacciones de PCR por electroforesis 9 PCR 1. Calienta los fragmentos de ADN (E) y las muestras de PCR por dos minutos a 65 C. Pon las muestras en hielo por 5 min. Este paso hace que los fragmentos que se unan por sus extremos no específicamente, puedan separarse para producir bandas claras. 2. Carga 20 µl de las muestras en la siguiente secuencia: Carril Tubo Contenido 1 Marcador Fragmentos estándares de ADN 2 0 Reacción control, 0 ciclos 3 15 Reacción de 15 ciclos 4 30 Reacción de 30 ciclos

10 3. Después de cargar las muestras ponle la tapa con cuidado en los terminales de los electrodos. Asegúrate que los indicadores negativos y positivos en la tapa y en la cámara estén orientados apropiadamente (rojo con rojo y negro con negro). 4. Inserta los enchufes negativos (negro) y positivos (rojos) en los lugares correspondientes de la fuente de energía (power supply). 5. Ajusta el voltaje según te indique el instructor siguiendo la tabla a continuación. Al encender el aparato debes ver burbujas en los electrodos. El tiempo aproximado por voltaje se presenta en la tabla Permite que el tinte migre unos 4 cm para que las bandas se separen adecuadamente. Si vas a correr a 50 o 70 voltios comienza ajustando a 125 voltios por 5 min y luego ajusta al voltaje que seleccionaste o te indicaron. *Nota: La gel que se corre a 125V debe correrse dentro de la nevera para evitar que se derrita durante la corrida. La gel pequeña debe correr por 30 min. y la gel grande por 45 min. aproximadamente. 7. Después de completar la electroforesis apaga el power supply, desconecta los cables y remueve la tapa. Es importante que revises tu gel cada minutos para asegurarte que las muestras no migre hasta el otro extremo de la gel totalmente. Debes parar la corrida cuando el tinte llegue a unos 2 cm del otro extremo. 8. Transfiere la gel al aparato de tinción para teñir y visualizar las muestras. E. Tinción y visualización del ADN con INSTASTAIN TM /ETBR Tabla 5: Tiempo y voltaje para la electroforesis Tiempo recomendado Voltios Mínimo Optiimo min 2.0 hrs min 1.5 hrs min* 45 min 1. Coloca la gel en una lámina de plástico (plastic wrap) sobre una superficie plana. Humedece la gel con unas gotas de amortiguador de electroforesis. Con guantes puestos, coloca el lado no impreso de la tarjeta de tinción DNA InstaStain TM /EtBr sobre la gel. 2. Corre tus dedos firmemente sobre la superficie de la tarjeta de tinción varias veces. 3. Coloca la bandeja de cuajar la gel y un vaso pequeño encima para que la tarjeta se mantenga en contacto con la gel. 4. Después de 2 min remueve la tarjeta de tinción. El bromuro de etidio es tóxico y carcinógeno por lo que la tarjeta debe disponerse en el lugar indicado por el instructor. 5. Transfiere la gel con una espátula a un transiluminador UV para ver las bandas de DNA. Asegúrate utilizar gafas protectoras UV para ver la gel. F. Fotodocumentación 1. Atornilla el mango en el hoyo central de la base de la cámara. 2. Alinea el hood sobre el lente de la cámara. 3. Cuidadosamente empuja firmemente los botones en la parte interna del hood a ambos lados del lente. 4. Carga tu cámara con el rollo de película. 5. Con el transiluminador apagado abre la cubierta de seguridad y coloca el hood de la cámara de manera que se alinie con la gel. 6. Enciende el transiluminador y toma la foto. Utiliza los siguientes parámetros: 10 PCR

11 a. Se recomienda ajustar la cámara a f 5.6 por 2 seg. b. Si la foto es muy clara cambia la apertura a f 8 y 2 seg. c. Si la foto es muy oscura reduce la velocidad a 1 seg y f Dibuja la gel con las bandas en tu libreta de laboratorio e identifica los carriles. Tira una foto digital para tu portafolio y guárdala en tu USB. Post- evaluación Post-avalúo del grado de dominio de las destrezas Destrezas Grado de Dominio de la Destreza Uso de la micropipeta Preparar geles de agarosa Cargar geles y correr equipos de electroforesis horizontales Determinar el número de moléculas de ADN que se obtienen de un PCR a base del número de ciclos Preparar gráfica semilogarítmica en Xcel Determinar gráficamente el tamaño de productos de PCR 1. No tengo idea de cómo realizar la tarea. 2. Aunque completo la tarea me toma más tiempo del asignado y cometo muchos errores. 3. Realizo la tarea completa me toma más tiempo y aún cometo algunos errores. 4. Puedo realizar la tarea esperada y en el tiempo máximo asignado. Los resultados son buenos y no suelo comentar errores. 5. Domino la tarea en un tiempo mínimo. Los resultados son excelentes. Me siento seguro(a) realizando la tarea. 11 PCR

12 1. Evalúa tu habilidad para correr una reacción de PCR y separar los productos por electroforesis con geles de agarosa después de realizar el experimento. Coloca una marca bajo la alternativa que mejor describe tu habilidad o dominio de la destreza. Nota: Los procedimientos, materiales y figuras utilizadas en este experimento son para el uso de los kits de EDVOTECK Bethesda, MD. Creado por: Dra. Yolanda Ramos YRG:1-13-rev Revisado por : Dra. Millie L. González MLG:8-14-rev 12 PCR