TÉCNICAS DE ESTUDIO DE MATERIALES BIOLÓGICOS

Transcripción

1 INMUNOCITOQUÍMICA Med. Luciana N. García Módulo de Introducción a la Investigación Científica en el área Biomédica Centro de Microscopía Electrónica-FCM-UNC

2 TÉCNICAS DE ESTUDIO DE MATERIALES BIOLÓGICOS Procesamiento de tejidos para MO y ME ELISA Western Blot Imunocitoquímica e Inmunofluorescencia Análisis de proliferación y apoptosis. Cultivo de Tejidos Citometría de Flujo PCR

3 Técnicas basadas en la reacción Antígeno- anticuerpo INMUNOHISTOQUÍMICA e INMUNOFLUORESCENCIA: Permite la localización de la molécula en secciones de tejido (in situ) o en células sueltas. CITOMETRÍA DE FLUJO: Localiza antígenos en la superficie de células en suspensión, permite su cuantificación en un citómetro de flujo. WESTERN BLOT: Se realiza en homogenato de tejido o en fluido biológico, usando como soporte una membrana de nitrocelulosa. Permite una semi-cuantificación ELISA: Se realiza con homogenato de tejido o en fluido biológico, usando como soporte una placa de poliestireno Permite cuantificar expresión de un antígeno

4 FUNDAMENTO Los Métodos Inmunohistoquímicos sirven para detectar antígenos celulares o tisulares mediante reacciones antígeno-anticuerpo. Para poder visualizar el sitio donde ocurre la reacción es preciso emplear un trazador o marcador.

5 Reacción Antígeno-Anticuerpo Cadena pesada (H) γαμδε Región constante (Fc) Cadena liviana (L) Región variable (Fv) κ λ

6 ANTÍGENO: cualquier sustancia que, una vez introducida, provoca una respuesta inmune. Debe formar Ac ser capaz de unirse en forma específica al Ac EPITOPE o DETERMINANTE ANTIGÉNICO: región específica del antígeno que es reconocida por el Ac, cada puede poseer varios determinantes antigénicos, iguales o distintos. HAPTENO: molécula que no es capaz de generar por sí sola una reacción inmune.

7 Reacción Antígeno-Anticuerpo Anticuerpos monoclonales Producto de un único clon de célula secretoria de Ig, todos los Ac producidos comparten las mismas características inmunobiológicas. VENTAJAS y DESVENTAJAS en el uso: Reproducibilidad de la respuesta a la hora de la obtención: son homogéneos, no varían con la inmunización. No requieren purificados en la reacción, si en la inducción Se obtienen por cultivo de hibridomas ( Köler y Milstein 75) lo que provee Ac en forma ilimitada. Mas caros

8 Anticuerpos policlonales Anticuerpos obtenidos a partir de varios clones de células secretorias de Ig. Las Ig obtenidas tienen distintas características inmunobiológicas: especificidad, afinidad, carga PM, isotipo y propiedades

9 Reacción -Ac enzimas Marcador iones metálicos fluoróforos Inmunoglobulina Región constante Región variable

10 Inmunocitoquímica e Inmunofluorescencia Características: Permite detectar y localizar el antígeno en cuestión ya que se realiza in situ es decir conservando la citoarquitectura del tejido o célula Muestra biológica: Secciones de tejido (parafina o plástico para Microscopía Electrónica). Células sueltas adheridas a un cubreobjeto, para localizar antígenos extracelulares o intracelulares (Tritón X-100)

11 Método directo e indirecto MÉTODO INDIRECTO Ac hecho en especie C Anti B Más sensible, el Ac secundario puede utilizarse para varios primarios (de la misma especie) MÉTODO DIRECTO Ac hecho en especie B Anti A Sencillo, poco sensible Especie A

12 Reacción -Ac enzimas Marcador iones metálicos fluoróforos Inmunoglobulina Región constante Región variable

13 ENZIMA Peroxidasa (más utilizada) SUSTRATO H 2 O 2 CROMÓGENO Diaminobencidina (DAB) Fosfatasa alcalina Naftol-AS-fosfato Fast red o Fast blue Glucosa oxidasa glucosa Sal de tetrazolio

14 Métodos de Amplificación con Peroxidasa Método PAP Complejo PAP P P C C Producto+Cromógeno Sustrato+Cromógeno Anticuerpo Secundario Anticuerpo Primario

15 Método ABC Complejo ABC P B Métodos de Amplificación B P B A B B B P C C Producto+Cromógeno Sustrato+Cromógeno Anti Ig-G biotinilado Anticuerpo primario

16 Aplicaciones Detección de proteínas in situ Identificación celular Inmunotipificación tumoral y pronóstico Morfometría (ME/MO) Análisis de proliferación y muerte celular Interacción proteína-proteína (ej: ligando y receptor)

17 Tipificación de Células Hipofisiarias Células somatotropas Células lactotropas Células corticotropas

18 Patología mamaria neoplásica y no neoplásica Cancer de mama. Receptores estrogénicos. Carcinoma ductal. HER2/neu Cancer de mama. P53. Adenosis esclerosante. Calponina.

19 Carcinoma papilar de tiroides Células inmunopositivas para calcitonina. Prolactotropas: HRP-DAB (marrón) Gonadotropas: HRP-Cloronaftol (azul)

20 Ki 67 en epidermis de ratón PROLIFERACIÓN

21 Reacción -Ac Marcador iones metálicos Inmunoglobulina Región constante Región variable

22 Técnica Oro Coloidal Ac-secundario Anti-IgG-oro Oro coloidal Oro-plata Complejo proteínaa - oro coloidal Tejido Ac-primario Antígeno 1

23 : CC16, Ac 1º: Rabbit anti-mouse, Ac2º Goat-antirabbit (gold 15nm)

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25 Técnica de Doble Marcación para ME Ac-secundario anti-igg de conejo-oro Ac-primario desarrollado en conejo Antígeno 2 Tejido Oro coloidal Complejo proteínaa oro coloidal Ac- primario Antígeno 1

26 Prl Gh Doble Marcación (Oro 16nm y 5nm) Células de cultivo

27 DETALLES ANEXOS 1- Controles - control anticuerpo primario de conejo: Suero normal conejo 1% - control anticuerpo secundario de cabra: suero normal de cabra - control del revelado: PBS - Especificidad del anticuerpo: suero primario adsorbido con el antígeno 2- Bloqueos - bloqueo de peroxidasa endógena (después de deparafinar) - bloqueo de receptores para Fc de Igs: 1% suero normal (antes del primario) 3- Recuperación antigénica (antigen retrival) 0.01M CITRATE BUFFER (ph 6.0) Tratamiento con calor en microonda

28 Falsos Negativos y Positivos en ICQ Falsos negativos: Anticuerpo inapropiado, desnaturalizado o usado en concentración errónea. Pérdida del antígeno por autólisis o digestión. Presencia del antígeno en una densidad por debajo del nivel de detección de la técnica usada. Falsos positivos: Reactividad cruzada del anticuerpo con otros antígenos. Unión inespecífica del anticuerpo al tejido. Presencia de peroxidasa endógena en algunos elementos celulares.

29 Reacción -Ac Marcador fluoróforos Inmunoglobulina Región constante Región variable

30 Conceptos Fluorescencia: forma de luminiscencia; emisión de luz que se produce a partir de una fuente de energía no térmica. Fluorescencia primaria o autofluorescencia: (ej: lámina elástica de arterias). Fluorescencia secundaria: mediante el uso de moléculas fluorescentes denominadas fluorocromos. Fosforescencia: se produce cuando al iluminar una sustancia en el espectro de luz visible la liberación de energía se produce en forma gradual, aún después del cese de la excitación inicial.

31 Fluorocromos Sustancias químicas que absorben fotones de alta energía procedentes de la radiación ultravioleta o del espectro visible; lo que provoca una redistribución de electrones que se manifiesta por la emisión de una radiación luminosa distinta a la de excitación pero dentro del espectro visible.

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33 ESQUEMA GENERAL DE LA REACCIÓN INDIRECTA 495nm 520nm 3- incorporación de una molécula marcadora 2- anticuerpo secundario de cabra Anti- Fc de IgG de conejo 2- anticuerpo secundario de cabra marcado con un fluorescente 1- anticuerpo primario obtenido en conejo contra el ag. Antígeno en sección de tejido

34 Directa Indirecta ANCA-C C-ANCA

35 Fluoresceína: FITC, color verde Rodamina: TRITC, color rojo Claudina, pulmón retina humana rojo: GFPA verde: sinaptofisin azul: DAPI

36 CONFOCAL DAPI Anti-Histona Anti-Elastasa B-C A-C

37 Protocolo para inmunocitoquímica en secciones de parafina 1- Montar secciones de parafina en vidrios cubiertos con polisina o xilano 2- Desparafinar: Xilol, Alcohol 100 (2 cambios), Alcohol 75, alcohol 50, agua 3- Bloqueo de peroxidasa endógena con H 2 O 2 4- Recuperación antigénica 5- Solución de bloqueo con albúmina al 1%. 6- Incubación con anticuerpo primario de conejo toda la noche a 4ºC. 7- Incubación con anticuerpo secundario marcado con biotina 8- Incubación con complejo ABC 9- Revelado de la peroxidasa con diaminobencidina (DAB) 10- Contratinción con hematoxilina o eosina.