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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. : C12P 21/00, C07K /00, A61K 49/00, G01N 33/74, G01N 33/77, C12N /00, C12N /00, //(C12P 21/00, C12R 1:91) 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: kfecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Anticuerpos monoclonales anti-cáncer de mama humano, correspondientes hibridomas, la producción y utilización de los mismos. k Prioridad: US US k 73 Titular/es: Cetus Oncology Corporation 10 Fifty-Third Street Emeryville, California 948, US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Ring, David Barratt y Frankel, Arthur Edward k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Esta invención pertenece a los campos de la inmunología y la diagnosis y terapia del cáncer. De un modo más particular, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales de múrido contra el cáncer de mama humano, hibridomas que producen dichos anticuerpos, productos químicos inmunológicos fabricados a partir de dichos anticuerpos, y su utilización. Desde mediados de los años 1970, ha habido numerosos informes de anticuerpos monoclonales de múrido que interaccionan con los antígenos asociados al cáncer de mama humano. En estos estudios publicados, se inmunizaron ratones y se reforzaron con proteínas globulares de grasa de leche humana, líneas de células del cáncer de mama humano o extractos de membranas del cáncer de mama humano. Los esplenocitos inmunes se fusionaron con células de mieloma de ratón y se seleccionaron hibridomas sobre la base de alguna especificidad de los medios de cultivo para los antígenos de cáncer de mama o de cánceres distintos al de mama. Taylor-Papadimitriou, J., et al, Int. J. Cancer (1981) 28:17-21; Yuan, D., et al, JNCI (1982) 68: ; Ciocca, D.R., et al, Cancer Res. (1982) 42: Las reactividades frente a los tejidos normales de estos anticuerpos de la técnica anterior son diferentes de las reactividades frente a los tejidos normales de los anticuerpos de la presente invención. Un aspecto principal de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal de múrido adecuado para formar imágenes de tumores de mama y seleccionado entre los que se pueden obtener a partir de ATCC- HB78, ATCC-HB79, ATCC-HB796, ATCC-HB786, ATCC-HB788, ATCC-HB789, ATCC-HB790, ATCC-HB798, ATCC-HB791, ATCC-HB799, ATCC-HB801, ATCC-HB- 792, ATCC-HB802, ATCC-HB793, ATCC-HB8, ATCC-HB- 803, ATCC-HB804, ATCC- HB80, ATCC-HB806, ATCC-HB808, y anticuerpos monoclonales que compiten para su fijación a un antígeno fijado por cualquiera de dichos anticuerpos específicos. Los hibridomas múrido x múrido que producen los anticuerpos descritos anteriormente y la progenie de tales hibridomas constituyen otros aspectos de la invención. de Otro aspecto de la invención se refiere a agentes de formación de inmuno-imágenes que son conjugados (a) los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente, y (b) un resto formador de imagen detectable. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente en la producción de una formulación para uso en la formación de imagen de tumores de mama en un paciente que se halla en necesidad de dicha formación de imagen. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión anticuerpo monoclonal significa una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. Dicha expresión no tiene por objeto limitarse en lo que respecta a la fuente de los anticuerpos o la manera en que se producen los mismos. Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de la invención incluyen la progenie de los mismos, esto es, todos sus derivados, sucesión, y descendencia del hibridoma originario que producen los anticuerpos monoclonales contra el cáncer de mama humano producidos por el padre, cualquiera que sea la generación o identidad cariotípica. Con respecto a los presentes anticuerpos monoclonales de múrido contra el cáncer de mama humano, equivalentes funcionales son anticuerpos monoclonales que: (a) se fijan al mismo antígeno o epítope que un anticuerpo monoclonal ilustrativo; (b) tienen una tasa de fijación a los tumores de mama de al menos 0, o una tasa de líneas de células del cáncer de mama mayor que o igual a 0,; (c) tienen una selectividad igual a o menor que 0,09; (d) tienen un isotipo G o M, y (e) cuando se conjugan con un resto formador de imagen, producen una señal suficiente para formar imágenes de tumores del cáncer de mama. El primero de los criterios anteriores, la fijación al mismo antígeno o epítope que un anticuerpo monoclonal ilustrativo, se puede demostrar por experimentos que muestran el bloqueo cruzado de un anticuerpo monoclonal ilustrativo por el anticuerpo monoclonal funcionalmente equivalente. El bloqueo cruzado se produce como resultado de la fijación de un anticuerpo al mismo epítope sobre un antígeno que el fijado por uno de los antígenos ilustrativos, o como resultado de la fijación de un anticuerpo a un epítope diferente que está situado tan cerca en el mismo antígeno que la fijación de un anticuerpo a un epítope bloquea la fijación de un anticuerpo al segundo epítope. El bloqueo cruzado es por tanto uno de 2

3 los criterios por los cuales se puede determinar que un anticuerpo monoclonal funcionalmente equivalente se fija al mismo antígeno o epítope que un anticuerpo monoclonal ilustrativo Los denominados ensayos sándwich son otro método para determinar si un anticuerpo se fija al mismo antígenooepítope. En estos ensayos, un primer anticuerpo monoclonal se fija a un soporte, por ejemplo la superficie de un pocillo de placa de valoración. Después del tratamiento para prevenir la fijación inespecífica, se añade al anticuerpo fijado una preparación de antígeno altamente solubilizada. Subsiguientemente, se añade un segundo anticuerpo que tenga una marca detectable, por ejemplo un colorante fluorescente. Si el segundo anticuerpo se fija al antígeno, se indica una especificidad de epítope diferente o copias múltiples del mismo epítope sobre el mismo antígeno. Si el segundo anticuerpo no se fija, se indica o bien la especificidad para el mismo epítope, o bien especificidad para un antígeno diferente. Los resultados tanto de los ensayos de bloqueo cruzado como de los ensayos sándwich se definen adicionalmente por una segunda serie de ensayos tales como la precipitación inmune o la transferencia Western para demostrar que el antígeno fijado por ambos anticuerpos tiene el mismo peso molecular. Producción de anticuerpos monoclonales Las parejas de fusionamiento productoras de anticuerpos que se utilizan para fabricar los hibridomas de esta invención se generan por inmunización de ratones con células vivas de cáncer de mama humano o extractos de membrana producidos a partir de ellas. Los ratones se inoculan por vía intraperitoneal con una cantidad inmunogénica de las células o del extracto, y se refuerzan después con cantidades similares del inmunógeno. Se recogen los bazos de los ratones inmunizados unos cuantos días después del reforzamiento final, y se prepara una suspensión de células a partir de aquéllos para uso en el fusionamiento. Se preparan hibridomas a partir de los esplenocitos y de una pareja de tumor de múrido utilizando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C., Nature (197) 6:49-497talcomohasidomodificadaporBuck,D.W.,etal,In vitro (1982) 18: En la hibridación se pueden utilizar líneas de mieloma de múrido disponibles, tales como las del Instituto Salk, Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU. de América. Básicamente, la técnica implica el fusionamiento de las células del tumor y los esplenocitos utilizando un fusógeno tal como polietilen-glicol. Después del fusionamiento, las células se separan del medio de fusionamiento y se dejan crecer en un medio de cultivo selectivo, tal como medio HAT, para eliminar las células paternas no hibridadas. Los hibridomas se expanden, si se desea, y los sobrenadantes se ensayan para actividad contra el cáncer de mama humano por procedimientos convencionales de inmuno-ensayo (p.ej., radio-inmuno-ensayo, inmuno-ensayo con enzimas, o inmuno-ensayo de fluorescencia) utilizando el agente de inmunización (células o extracto de membrana de cáncer de mama) como antígeno. Los clones positivos se caracterizan ulteriormente para determinar si los mismos cumplen los criterios de los anticuerpos de acuerdo con la invención. Los hibridomas que producen tales anticuerpos se pueden cultivar in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los medios de cultivo o de fluidos corporales, según sea el caso, por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía, y ultrafiltración, si se desea. Selección y caracterización de los anticuerpos monoclonales Las características importantes de los anticuerpos monoclonales son (1) su clase de inmuno-globulinas, (2) su selectividad para las células del cáncer de mama humano, (3) la tasa de células de los tumores del cáncer de mama humano a las que se fijan aquéllos, (4) la tasa de las secciones congeladas de tumor de cáncer de mama humano a las que se fijan los mismos, y () su utilidad en la fabricación de agentes eficaces de formación de inmuno-imágenes contra el cáncer de mama humano. La selectividad y la tasa de un anticuerpo dado se determina ensayándolo contra paneles de (1) tejidos tumorales de cáncer de mama humano, (2) líneas de células de cáncer de mama humano, y (3) tejido o células humanas normales de mama o de otro origen. En la selección de los anticuerpos que se reivindican, se clasificaron inicialmente del orden de cultivos de hibridoma en crecimiento contra las membranas o líneas de células de tumor de mama inmunizadoras, un panel de siete membranas de tejido normal, una línea celular de fibroblastos y una sección congelada de tumor de mama. Los clones que reaccionaban con los materiales neoplásicos, pero no con los materiales normales, se identificaron en esta clasificación inicial y se seleccionaron para la obtención de isotipos y la evaluación adicional de selectividad y tasa. La evaluación adicional implicó: dieciséis secciones de tejido normal, cinco tipos de glóbulos de sangre normal, once secciones de neoplasmas distintos al de mama, veintiuna secciones de 3

4 cáncer de mama y catorce líneas de células de cáncer de mama Para los fines de esta solicitud de patente, especificidad y selectividad se utilizan intercambiablemente, y se definen como la suma del número de subestructuras teñidas en dieciséis secciones congeladas de tejido normal y el número de tipos de glóbulos sanguíneos fijados, dividida por la suma del número total de subestructuras fijadas por cualquiera de los anticuerpos monoclonales en todo el tejido en el que se ensayaron los anticuerpos monoclonales y se ensayaron los cinco tipos de glóbulos sanguíneos. La expresión tasa de tumores se define como el número de secciones congeladas de tumor de mama teñido dividido por el número de secciones congeladas de tumor de mama ensayado. La expresión tasa de líneas de células de cáncer de mama se define como el número de líneas de células de cáncer de mama teñido dividido por el número de líneas de células de cáncer de mama ensayado. Se consideró que los anticuerpos eran apropiados para propósitos de formación de inmuno-imágenes del cáncer de mama si aquéllos tenían una selectividad igual a o menor que 0,09 y una tasa de fijación al tumor de mama igual a o mayor que 0, o una tasa de fijación a las líneas de células del cáncer de mama igual a o mayor que 0,. Los anticuerpos que exhiben selectividad y tasa aceptables se pueden conjugar con diversos restos de formación de imagen tales como radioisótopos o materiales detectables por formación de imágenes de resonancia magnética nuclear. En algunos casos, se puede utilizar un agente de copulación, tal como un agente de formación de quelatos, para enlazar el agente de formación de imagen al anticuerpo. Se encontró que algunos anticuerpos de los hibridomas depositados reconocen el mismo antígeno de 0 kilodaltons. Los anticuerpos de cuatro de los hibridomas se fijaban a un antígeno intracelular de 2 kilodaltons. Tres de ellos se fijan a una o más mucinas de peso molecular alto (HMW, del inglés high molecular weight) y uno de ellos se fijaba a los receptores de transferrina en la forma de un antígeno de 97 kilodaltons. Todos los pesos de antígeno mencionados en esta memoria se determinaron por electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio (SDS, del inglés sodium dodecyl sulfate )-poliacrilamida en condiciones reductoras utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Detalles adicionales de la caracterización de estos anticuerpos se proporcionan en los ejemplos que siguen. Productos químicos inmunológicos Los derivados de productos químicos inmunológicos de los anticuerpos monoclonales de esta invención que tienen una importancia capital se marcan primeramente con un resto formador de imagen tal como radioisótopos, sustancias radio-opacas o materiales detectables por resonancia magnética nuclear. Tales derivados de productos químicos inmunológicos, en los cuales el resto formador de imagen proporciona un medio para identificar los complejos inmunes que incluyen el anticuerpo marcado se pueden utilizar en la formación de imágenes de tumores de cáncer de mama in vivo. Los anticuerpos que exhiben o bien una tasa de fijación a los tumores de cáncer de mama de al menos 0, o bien una tasa de fijación a líneas de células de cáncer de mama de al menos 0,, y que exhiben también una selectividad igual a o menor que 0,09 y no se fijan a los glóbulos sanguíneos, se consideraron selectivos para propósitos de formación de inmuno-imágenes del cáncer de mama, y se pueden conjugar a un resto de formación de imágenes detectable. Tales restos de formación de imágenes se pueden fijar directamente al anticuerpo monoclonal o pueden fijarse al anticuerpo monoclonal por medio de un agente enlazador o formador de quelato. Derivados del anticuerpo monoclonal, marcados con los restos formadores de imágenes, se pueden producir por una diversidad de métodos bien conocidos en la técnica. A dichos derivados marcados se hace referencia también en esta memoria como agentes de formación de inmuno-imágenes. Se pueden utilizar radioisótopos de yodo para yodar los anticuerpos monoclonales utilizando el agente de oxidación en fase sólida 1,3,4,6-tetracloro-3α,6α-difenilglicourilo (vendido bajo el nombre comercial Iodo-gen MR ), o N-cloro-p-tolueno-sulfonamida (cloramina T). El término enlazadores utilizado en esta memoria tiene por objeto abarcar entidades químicas que se pueden fijar al resto formador de imágenes y que se fijan también al anticuerpo monoclonal. Enlazadores apropiados pueden incluir aquéllos que se fijan al anticuerpo monoclonal y forman quelatos con los radionucleidos. Otros enlazadores, tales como los que se pueden fijar selectivamente a las regiones portadoras de hidratos de carbono del anticuerpo monoclonal, o aquéllos que son capaces de fijar grupos 4

5 laterales amino libres de la región proteínica del anticuerpo monoclonal, tales como agentes de amidinación o imidinación, y que se pueden enlazar por covalencia con el resto formador de imágenes, están incluidos también dentro del alcance del término enlazador tal como se utiliza en esta memoria Los enlazadores apropiados tendrán tres características. En primer lugar, aquéllos tienen que ser capaces de fijar el resto formador de imágenes que tiene la característica deseada que debe ser leídaparala formación de la imagen. En segundo lugar, el enlazador no tiene que afectar de modo importante a la selectividad de fijación del anticuerpo monoclonal o disminuir sustancialmente su afinidad para el antígeno que ha de fijarse. Por último, el enlazador tiene que formar una unión estable con el resto formador de imágenes y el anticuerpo monoclonal, a fin de que el resto formador de imágenes y el anticuerpo no se separen uno del otro. El enlazador y el resto formador de imágenes utilizados en particular para producir los agentes de formación de inmuno-imágenes de la presente invención variarán de un anticuerpo a otro dependiendo del efecto que puedan tener un resto formador de imágenes particular o un resto formador de imágenes y enlazador sobre las características de fijación del anticuerpo monoclonal para el antígeno que constituye el blanco. Así, si bien un anticuerpo monoclonal se puede yodar con un radioisótopo de yodo en los restos de tirosina pertenecientes al anticuerpo monoclonal sin afectar significativamente a la afinidad o selectividad del anticuerpo monoclonal, el mismo tratamiento de un segundo anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención puede reducir de modo importante la afinidad o especificidad de fijación de otro anticuerpo monoclonal. Un marcador o enlazador diferente, por ejemplo uno que se fije al anticuerpo en un resto de aminoácido diferente, puede utilizarse sin afectar a la selectividad o afinidad en el segundo anticuerpo. Así, los radioisótopos de yodo se pueden enlazar con el segundo anticuerpo, por ejemplo, utilizando el método de Wood, F. T., et al, Analy. Biochem. 69:339 (1987) y el enlazador metil-p-hidroxibencimidato o el método de Bolton-Hunter, Bolton, A.E. y Hunter, W.M., Biochem. J. 133:29-39 (1973) y el enlazador propionato de N-succinimidil-3-(4-hidroxifenilo). Un agente quelante tal como anhídrido del ácido dietilenotriamina-pentaacético que se fija a los restos lisina del anticuerpo, oácido etilenotriamina-tetraacético, puede utilizarse para marcar el anticuerpo con Indio-111 (111-In), y podría emplearse también como medio alternativo para enlazar el anticuerpo con el resto formador de imágenes. Véase, por ejemplo, Goodwin, et al., Chelate Conjugates of Monoclonal Antibodies for Imaging Lymphoid Structures in the Mouse, J. Nucl. Med. 26(): (198) y Meares et al., Conjugation of Antibodies with Bifunctional Chelating Agents Bearing Isothiocyanate or Bromoacetamide Groups and Subsequent Addition of Metal Ions, Analy. Biochem. 142:68-78 (1984). Se conocen diversos restos adecuados para la formación de imágenes. Por ejemplo, se han marcado radiactivamente anticuerpos monoclonales con cierto número de radionucleidos adecuados para la formación de imágenes, que incluyen yodo 131 (I-131) e I-123. Levin et al., Localization of I-131 Labeled Tumor Bearing Balb/c Mouse, J. Nuclear Medicine, 21: (1980); Farrands et al., Radioimmunodetection of Human Colorectal Cancers by an Anti-Tumor Monoclonal Antibody, Lancet (1982); Zimmer et al., Radioimmunoimaging of Human Small Cell Lung Carcinoma with I-131 Tumor Specific Monoclonal Antibody, Hybridoma, 4(1):1-11 (198). La marcación directa del anticuerpo monoclonal con radioisótopos de yodo se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Contreras et al, Methods in Enzymology (1973) 97:277. Se ha utilizado el tecnecio-99 como resto formador de imágenes; Khaw et al., Monoclonal Antibody to Cardiac Myosin: Imaging of Experimental Myocardial Infarction, Hybridoma 3:11-23 (1984). Se ha aplicado 111-In como marcador para anticuerpos, Krejack et al., Covalent Attachment of Chelating Groups to Macromolecules, Biochem. Biophys. Res. Comm., 77:81-8 (1977); Hnatowich et al., Radioactive Labelling of Antibody. A Simple and Efficient Method, Science, 2:613-6 (1983) y Schienberg, D.A. et al., Tumor Imaging with Radioactive Metal Chelates Conjugated to Monoclonal Antibodies, Science, 2:11-13 (1982). Con objeto de evaluar inicialmente la idoneidad del anticuerpo como uno adecuado para la formación de imágenes, el anticuerpo se puede marcar con un resto que sea directamente detectable, tal como fluorocromos, así como con restos, tales como enzimas, que tengan que hacerse reaccionar o derivatizar para ser detectados. Ejemplos de tales marcadores son fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, grupos dansilo, umbelliferona, luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, lisozima, y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Los anticuerpos se pueden etiquetar con tales marcadores por métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden utilizar agentes de copulación tales como aldehídos, carbodiimidas, dimaleimida, imidatos, succinimidas, bencidina bis-diazotada y análogos, para etiquetar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos anteriormente. Los anticuerpos y el anticuerpo marcado se pueden utilizar según una diversidad de procedimientos

6 de formación de inmuno-imágenes o de inmuno-ensayo para detectar la presencia de cáncer de mama en un paciente o comprobar el estado de dicho cáncer en un paciente al que ya se le haya diagnosticado padecerlo. Cuando se utiliza para formación de inmuno-imágenes in vivo a fin de detectar la presencia de un tumor, su localización y diseminación en el cuerpo de un paciente y el progreso de la terapia para mejorar la gravedad del tumor, el anticuerpo monoclonal marcado con un resto formador de imágenes se administrará por vía parenteral, preferiblemente por vías intravenosa o subcutánea en una cantidad suficiente para acumularse en el sitio del tumor y poder ser detectada por los medios elegidos de detección. Típicamente, el anticuerpo monoclonal marcado con un resto formador de imágenes se administrará con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado del tipo bien conocido por los expertos en la técnica. Tales vehículos no afectan al paciente. La cantidad de anticuerpo monoclonal que se administrará dependerá de la cantidad de resto formador de imágenes detectable unida al anticuerpo monoclonal y la eficiencia de fijación residual del anticuerpo monoclonal después de la marcación con el resto formador de imágenes. La eficiencia de fijaciónresidual del anticuerpo monoclonalmarcado con el resto formadorde imágenes se determina in vitro utilizando un ensayo de fijación a células tumorales. Generalmente, la reactividad radio-inmunológica, que mide la eficiencia de fijación residual de un anticuerpo monoclonal marcado con radioisótopos, se determina por comparación de la fijación específica del anticuerpo monoclonal marcado con el radioisótopo a un cultivo de tejidos fijado de una línea de células tumorales inmuno-reactiva conocida tal como SKBR-3, MCF-7, y MX-1 con la fijación inespecífica a una línea de células fijada que no fija específicamente el anticuerpo monoclonal. La reactividad radio-inmunológica óptima del anticuerpo monoclonal marcado se determina en este sistema por variación de la concentración del agente de formación de imágenes disponible para fijarse al anticuerpo monoclonal mientras que se mantiene constante la concentración del anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales marcados se ensayan luego en el inmuno-ensayo de las células fijadas descrito arriba por adición del anticuerpo monoclonal marcado a las células fijadas en condiciones de exceso de antígeno. Se determina el anticuerpo monoclonal marcado que da la fijación detectable máxima, y se puede utilizar inicialmente para la formación de radio-inmuno-imágenes. Cuando se emplea un inmuno-ensayo in vitro para comprobar el estado de un paciente de cáncer, tiene que utilizarse un procedimiento de inmuno-ensayo cuantitativo. En tal comprobación, se realizan ensayos periódicamente y se comparan los resultados para determinar si lacarga del tumor del paciente ha aumentado o ha disminuido. Técnicas de ensayo comunes que se pueden utilizar incluyen ensayos directos o indirectos. Los ensayos directos implican la incubación de una muestra de tejido o células del paciente con un anticuerpo marcado. Si la muestra incluye células de cáncer de mama, el anticuerpo marcado se fijará a dichas células. Después de lavar el tejido o las células para separar el anticuerpo marcado que no se ha fijado, se lee la muestra de tejido en cuanto a la presencia de complejos inmunes marcados. En los ensayos indirectos, la muestra de tejido o de células se incuba con anticuerpo monoclonal sin marcar. La muestra se trata luego con un anticuerpo marcado contra el anticuerpo monoclonal (p.ej., un anticuerpo anti-múrido marcado), se lava, y se lee en cuanto a la presencia de complejos ternarios marcados. Para usos diagnósticos in vitro, los anticuerpos se distribuirán típicamente en forma de estuche. Estos estuches comprenderán típicamente: el anticuerpo en forma marcada o sin marcar en envases adecuados, reactivos para las incubaciones y los lavados, un anticuerpo anti-múrido marcado si el estuche es para un ensayo indirecto, y substratos o agentes de derivatización que dependen de la naturaleza del reactivo marcador. Para uso de formación de imágenes in vivo, el anticuerpo se distribuirá también en forma de estuche y comprenderá típicamente los mismos tipos de componentes que se han mencionado anteriormente. El anticuerpo se puede suministrar derivatizado con un agente ya fijado a o formando un quelato con el radioisótopo a utilizar, o el anticuerpo monoclonal se puede suministrar derivatizado conelagentedefijación o quelante solamente, y el radioisótopo a utilizar se puede suministrar por separado. El radioisótopo a utilizar se puede añadir inmediatamente antes de su empleo, de tal modo que se pueda conseguir un nivel óptimo de radiactividad para la formación de imagen en el momento de la administración del agente de formación de radio-inmuno-imágenesal paciente. También se pueden incluir muestras testigo de antígeno de cáncer de mama humano e instrucciones, si es adecuado para el ensayo. Los ejemplos que siguen proporcionan una descripción detallada de la preparación, caracterización, y uso de anticuerpos monoclonales representativos de esta invención. Estos ejemplos no tienen por objeto limitar la invención en modo alguno. 6

7 Inmunización Se utilizaron tejido de cáncer de mama humano postquirúrgico reciente y una diversidad de tejidos normales para preparar extractos de membrana por homogenización y centrifugación en gradiente de sacarosa discontinuo. Las líneas de células de cáncer de mama humano se obtuvieron de la Breast Cancer Task Force, de la American Type Culture Collection (ATCC), y del Dr. Jorgen Fogh en Memorial Sloan Kettering. Las células se mantuvieron y se sometieron a pasos tal como era recomendado por la Breast Cancer Task Force, la ATCC y el Dr. Fogh. Para las inmunizaciones, se inocularon extracto de membrana que contenía 0 µg deproteína (ensayo Lowry) o diez millones de células vivas de cáncer de mama por vía intraperitoneal a ratones Balb/c de cinco semanas de edad. Los ratones se reforzaron idénticamente dos veces con intervalos mensuales. Tres días después del último reforzamiento, se extirparon los bazos para el fusionamiento celular. Métodos de hibridoma Se prepararon híbridos de células somáticas por el método de Buck, D. W., et al, citado arriba, utilizando la línea de células de mieloma de múrido Sp-2/0/Ag14. Todas las líneas de células de hibridoma se clonaron por dilución límite. La mitad de los fusionamientos emplearon esplenocitos de ratones inmunizados con extractos de membrana de cáncer de mama, y la otra mitad utilizaron esplenocitos de ratones inmunizados con líneas de células de cáncer de mama vivas. A partir de dichos fusionamientos se generaron ochenta y tres mil cuatrocientos veinticuatro pocillos, de los cuales exhibían crecimiento de hibridoma. Métodos de clasificación Se ensayó el sobrenadante del hibridoma respecto a anticuerpos reactivos en un ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA, del inglés enzyme- linked immunosorbent assay ) en fase sólida con el extracto inmunizante de membrana de cáncer de mama o por un ensayo indirecto de inmuno-fluorescencia con la línea de células inmunizantes de cáncer de mama. Para el ensayo ELISA con membrana en fase sólida, se pusieron µl deproteínademembranadecáncer de mama de 0,1 mg/ml en pocillos de microvaloración de poli(cloruro de vinilo) (PVC) durante 12 horas a 4 C. Se aspiró el extracto y se lavaron los pocillos con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de seroalbúmina de bovino (BSA). Los pocillos se incubaron luego con 4 µl de una dilución 1: de sobrenadante de hibridoma. El diluyente era un medio que contenía una concentración mm de un tampón, % de suero de bovino, y 0,1% de azida de sodio. Después de minutos a la temperatura ambiente, los pocillos se lavaron de nuevo y se incubaron 4 minutos a 37 C con una dilución 1:0 de IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa. El diluyente era PBS. Se lavaron luego los pocillos con PBS y se hicieron reaccionar con 0 µl deácido 1,2-azino-di(3-etilbenztiazolina-sulfónico) en tampón de citrato de sodio 0,1 M de ph 4,2 durante minutos a la temperatura ambiente. Se midió la densidad óptica a nm en un lector MicroElisa. Para cada experimento, se hizo reaccionar un testigo positivo, anti-beta-2-microglobulina de concentración µg/ml, con membrana de riñón humano normal. Esto daba una densidad óptica de 1,0 ± 0,1 (desviación estándar). El ruido de fondo eran 0 ± 0,1 unidades de densidad óptica (O.D.) utilizando medios sin anticuerpo monoclonal de ratón. Se conservaron los pocillos que dieron una reacción con el extracto de membrana de cáncer de mama mayor que 0,7 O.D. Para el ensayo con la línea de células de inmuno-fluorescencia indirecta, células de cáncer de mama de la línea de células inmunizante se pusieron durante una noche con medios apropiados en cada cámara de una serie de ocho portaobjetos provistos de cámara. Análogamente, células de fibroblastos procedentes de la línea de células CC9 se incubaron durante una noche en pocillos de portaobjetos provistos de cámara. Las células se lavaron con PBS que contenía 1% de BSA. Los pocillos, tanto de cáncer de mama como de fibroblastos, se incubaron durante minutos a 4 C con diluciones 1: de sobrenadante de hibridoma. Las células se lavaron de nuevo y se incubaron minutos a 4 Ccon una dilución 1:0 de Ig anti-ratón F(ab ) 2 de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC, del inglés fluorescein isothiocyanate ). Las células se lavaron tres veces, se fijaron en formaldehído al 1,% en PBS durante cinco minutos, se retiraron las cámaras y se enjuagaron en PBS. Se montaron luego los portaobjetos en una composición que contenía poli(alcohol vinílico), glicerol, tampones y un conservante, y se examinaron con un microscopio de fluorescencia. Se conservaron los pocillos de hibridoma que exhibían una fijación fluorescente intensa a las células de cáncer de mama pero no exhibían fijación fluorescente alguna a los fibroblastos. Cinco mil ciento cincuenta y seis pocillos de hibridoma revelaron reactividad de cáncer de mama en la clasificación inicial. Los sobrenadantes de los.6 pocillos positivos se ensayaron luego con ELISA en fase sólida utili- 7

8 zando siete extractos de membrana de tejido normal (hígado, pulmón, colon, estómago, riñón, amígdala, y bazo). Se desechó cualquier sobrenadante de pocillo que diera una O.D. en ELISA mayor que 0,3. Se encontró que mil ciento uno de los sobrenadantes no reaccionaban con los extractos de tejido normal. Se ensayaron los 1.1 sobrenadantes de hibridoma sobre secciones congeladas de tejidos de carcinoma de mama humano. Se unieron secciones de seis micrómetros a portaobjetos, se fijaron durante minutos en acetona a 4 C, se secaron minutos a la temperatura ambiente, se lavaron con PBS, se bloquearon con suero de caballo y se incubaron durante minutos a la temperatura ambiente con 0 µl de sobrenadante de hibridoma puro. Se lavaron los portaobjetos con PBS, y finalmente se incubaron duranteminutosa37 C con una dilución 1:0 de Ig anti-ratón de conejo conjugada con per-oxidasa, se lavaron de nuevo con PBS, y por último se incubaron durante 7, minutos a 37 C con 0, mg/ml de diaminobencidina en tampón Tris 0,0 M de ph 7,2 que contenía 0,01% de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron en un medio que contenía 3,9% de copolímero de metacrilato de metilo/n-butilo, 7,1% de ftalato de butilo y bencilo, y 0,3% de 2,6-ditercbutil-p-cresol. Ciento veinticuatro pocillos produjeron fijación selectiva al cáncer de mama y se sometieron a la clonación. Purificación y determinación de la clase La clase y la subclase de las inmuno-globulinas de los anticuerpos monoclonales selectivos para el cáncer de mama se determinaron por un ensayo de inmuno-mancha esencialmente igual al que se describe en McDougal et al. J. Immunol. Met. 63: (1983). Los anticuerpos se marcaron también inter namente por cultivo de 2-3 x 6 células de hibridoma durante cuatro horas en un medio exento de metionina que contenía 0,2 µci de 3 S-metionina. Los anticuerpos marcados con 3 S se inmuno-precipitaron con células de estafilococos A fijadas, o con células de estafilococos A fijadas pre-revestidas con inmunoglobulina anti-ratón de conejo, y los inmuno-precipitados se analizaron por SDS-PAGE para determinar la movilidad de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos, la ausenciade cadenas adicionales, y la capacidaddecadaanticuerpoparafijarlaproteína A estafilocócica. Los anticuerpos se expandieron in vivo. Se sensibilizaron ratones Balb/c o F1 (C7B/6 x Balb/c) con 0, ml de pristano por vía intraperitoneal (ip) y, pasados -14 días, se inocularon con un millón de células de hibridoma de fase logarítmica en PBS. El fluido de ascitis se guardó a-70 C y se descongeló y filtró a través de una unidad de filtración de 0,8 micrómetros antes de su purificación adicional. Algunos anticuerpos de IgG que fijaban la proteína A estafilocócica se purificaron por cromatografía de afinidad sobre resina cromatográfica-proteína A que contenía agarosa, dextrano y/o acrilamida con elución en gradiente escalonado de ph. Los anticuerpos de IgG que no fijaban la proteína A se precipitaron por adición de sulfato de amonio al % de la saturación a 0 C, o por fijación a DEAE o Affigel TM (Biorad, Richmond, California). Alternativamente, los anticuerpos IgG se purifican por cromatografía utilizando una columna Sephacryl S-0, seguido por DEAE-celulosa como se ha descrito. Los precipitados se redisolvieron en PBS, se dializaron frente a tampón Tris mm de ph 7,2 y se cromatografiaron en una columna de 1,6 x 0 cm de dietilaminoetil-celulosa (DEAE) eluyendo con 1, litros de un gradiente de NaCl 0-0 mm a 4 C a un caudal de 1 ml/min. En cada caso, las fracciones de la columna se comprobaron por SDS-PAGE y las fracciones de anticuerpos más puras se agruparon, se concentraron a 1-3 mg/ml, se dializaron frente a PBS/0,02% de NaN 3, y se guardaron a 4 C. Los anticuerpos de IgM se purificaron por medio de filtración con gel en un columna de 2,6 x cm de Sephacryl S-0 u otro material de filtración con gel o resina que contuviera agarosa, dextrano y/o acrilamida, eluyendo con PBS/0,01% de azida de sodio a la temperatura ambiente y a un caudal de 1 ml/min. Determinación de la selectividad Con objeto de evaluar su selectividad para el cáncer de mama, los anticuerpos purificados se ensayaron por tinción de cortes con inmuno-peroxidasa sobre cortes de dieciséis tejidos normales, y por clasificación de células inmunofluorescentes sobre cinco tipos de glóbulos de la sangre. La tinción con inmuno-peroxidasa se llevó a cabo como anteriormente, excepto que se utilizaron diluciones conocidas de anticuerpos purificados en PBS comprendidas en el intervalo que va desde 1 a µg/ml, en lugar de los sobrenadantes de hibridoma. Los anticuerpos puros se valoraron en primer lugar para hallar la concentración mínima que daba una tinción intensa con inmuno-peroxidasa sobre los cortes de cáncer de mama, y se utilizaron luego a la concentración apropiada para los ensayos con tejidos normales. Las células de la sangre periférica (plaquetas, linfocitos, glóbulos rojos, granulocitos, y monocitos) se prepararon por 8

9 centrifugación utilizando un medio que separa los monocitos de los leucocitos polimorfonucleares. Las células se hicieron reaccionar con los anticuerpos a la concentración óptima determinada arriba durante minutos a 4 C, se lavaron, se hicieron reaccionar con una dilución 1:0 de Ig anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína durante minutos a 4 C,selavarondenuevoyseexaminaronenunclasificadordecélulas. El tampón de lavado y los diluyentes eran PBS con 1% de gelatina y 0,02% de azida de sodio. El clasificador de células estaba equipado con una boquilla de 76 micrómetros yunláser iónico de argón de 1 vatio a 488 nm. Se utilizó unalenteconfocalde80mmenelmontaje del carril óptico para el enfoque. Otros filtros utilizados fueron un filtro de interferencia de nm y un filtro de absorbancia de nm (para la luz del láser dispersada) y un filtro 1. de densidad neutra para la dispersión de la luz del ángulo delantero. Para el análisis de las muestras se utilizaron gráficos de contorno del logaritmo de la fluorescencia de la fluoresceína en función de la dispersión de la luz del ángulo delantero. Ninguno de los tipos de células de la sangre mostró una fijación detectable. Los comportamientos de fijación de los anticuerpos reivindicados se consignan en la Tabla I a continuación. Se emplean las abreviaturas siguientes para designar las estructuras fijadas por los anticuerpos: Ac, acinos; G, glándulas; T, túbulos; D, conductos; L, lumen; W, glándulas sudoríparas; E, epitelio; S, glándulas sebáceas; Gr, granulocitos; Mk, megacariocitos; M, macrófago; Ly, linfocitos; Bl, capa basal; Fe, epitelio focal; A, células del revestimiento interior alveolar; B, cápsula de Bowman; Mu, músculo; e I, islotes; H, folículos pilosos; U, glomérulos; y V, vasos/endoteliales. (Ver tabla 1 en página siguiente)

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11 Determinación de la tasa de fijación al tumor de cáncer de mama Con objeto de determinar la amplitud de la tasa de cánceres de mama que podría ser reconocida por cada anticuerpo, los anticuerpos selectivos de cáncer de mama se ensayaron por tinción con inmunoperoxidasa sobre cortes congelados de 27 tumores de mama diferentes. Los tumores de mama utilizados para la tinción de corte eran todos ellos carcinomas intraductales infiltrantes, por lo que no podía establecerse correlación alguna de la fijación de los anticuerpos con el tipo histológico de cáncer de mama. Además, no se encontró ninguna correlación entre la fijación de los anticuerpos y el estado nodular o estado del receptor de estrógenos para los 12 tumores para los que se disponía de información del donante. Los anticuerpos reaccionaban igualmente bien con los tumores metastáticos y con los tumores de mama primarios. Los resultados de estos ensayos para los anticuerpos reivindicados se consignan en la Tabla 2 a continuación. (Ver tabla 2 en página siguiente)

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14 Determinación de la tasa de fijación a las células de cáncer de mama Los anticuerpos se evaluaron después con respecto a la tasa de reconocimiento de las líneas de células de cáncer de mama por ensayos de inmuno-fluorescencia sobre 14 líneas de células de cáncer de mama. En la Tabla 3 siguiente se consignan los resultados de estos ensayos para los anticuerpos reivindicados. (Ver tabla 3 en página siguiente)

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16 Fijación de los anticuerpos monoclonales formadores de imagen a los cánceres distintos al de mama Finalmente, los anticuerpos se ensayaron por tinción con inmuno-peroxidasa sobre once tumores malignos distintos al de mama. Lo resultados para los anticuerpos reivindicados se presentan en la Tabla 4 a continuación. (Ver tabla 4 en página siguiente)

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18 La tasa de tumores de cáncer de mama, la tasa de fijación a las células de cáncer de mama, fijación a las células de la sangre y características de selectividad para los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención se resumen en la Tabla. TABLA MAB formadores de imagen candidatos Células de Tasa de Tasa de MAB la sangre tumores células Selectividad 3 9C6 0 0,86 0,7 0,063 32A1 0 0,33 0,79 0,078 3E 0 0,62 0,14 0,070 41B4 0 0,67 0,00 0,023 87H7 0 0,9 0,00 0,078 6A 0 0,86 0,86 0,086 1H7 0 0,67 0,7 0,047 1A7 0 0,71 0,36 0,070 0F9 0 0,2 0,71 0,031 3E2 0 0,86 0,0 219F3 0 0,86 0,86 0,086 4H9 0 0,92 0, H9 0 0,29 0,91 0, E8 0 0,81 0,7 0,0 41C3 0 0,38 0,91 0,070 42E12 0 0,2 0,00 0,023 44A12 0 0,29 1,00 0,031 47D7 0 0, 0, 0, B3 0 0,81 0,88 0,070 79E3 0 0,14 0,78 0, Afinidad de los anticuerpos y densidad del antígeno Varios de los anticuerpos reivindicados se yodaron y se ensayaron en lo referente a fijación a las células MCF-7, CAMA1, SKBR3 o ZR7. Los anticuerpos se marcaron con 1 I utilizando cloramina T hasta una actividad específica de aproximadamente µci/µg. Para determinar la pureza del producto inmuno-radioquímico, cpm de dos de los anticuerpos marcados en 0, ml de suero de ternero fetal se absorbieron en serie con cinco partes alícuotas de células diana durante minutos a 0 C(generalmente de células por cada parte alícuota), y se determinó la radiactividad remanente en el sobrenadante después de cada absorción. Para las medidas de las constantes de asociación, concentraciones conocidas de anticuerpos monoclonales marcados y sin marcar se incubaron con células diana en suero de ternero fetal durante minutos en hielo. Partes alícuotas de la mezcla célula/anticuerpo se sometieron luego a cómputo en un contador gamma o se filtraron a través de placas de filtro Microfold (V & P Scientific) y se sometieron a cómputo los filtros. Para tener en cuenta el anticuerpo sin fijar retenido en el líquido sobre los filtros, se ensayaron en paralelo muestras testigo que contenían las mismas concentraciones de anticuerpo pero exentas de células. Las constantes de asociación y el número de copias de antígeno por cada diana se calculan a partir de los resultados del ensayo de afinidad y se consignan en la Tabla 6 a continuación. (Ver tabla 6 en página siguiente). 18

19 TABLA 6 Afinidad y númerodecopiasdeantígeno de los MABs formadores de imagen MAB s n Ka Línea de células 9C6 32A1 3E 41B4 87H7 6A 1H7 00 6,2x 6 MCF7 1A7 0F9 3E2 219F3 4H9 387H9 421E8 41C ,4x 8 MCF7 42E12 44A ,2x 8 MCF7 47D7 697B3 79E Con objeto de identificar los antígenos reconocidos por los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención, se llevó a cabo la inmuno-precipitación de los antígenos de acuerdo con el método siguiente. Bolas de poliestireno de ocho mm de diámetro (Precision Plastic Ball Co.) se cubrieron con ácido nítrico fumante al % en ácido acético glacial y se incubaron durante tres horas en un baño de agua a 0 C. A continuación del tratamiento con ácido, las bolas se enjuagaron tres veces con agua destilada, se cubrieron con ditionito de sodio al 1% en NaOH 0,1 M y se incubaron durante tres horas en un baño de agua a 0 C. Las bolas se enjuagaron de nuevo tres veces con agua destilada, se cubrieron con 0,1% de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (DEAC), 0,2% de ácido subérico (ácido subérico disuelto en dimetilformamida), y se incubaron durante una noche a la temperatura ambiente. Las bolas se enjuagaron tres veces con agua destilada, y se marcaron para identificación. Los anticuerpos monoclonales purificados se diluyeron a 0,2 mg/ml en tampón de ácido 2-(Nmorfolino)etano-sulfónico, y las bolas de poliestireno previamente tratadas y marcadas se pusieron en tubos individuales y se cubrieron con microlitros de anticuerpo diluido y 0 microlitros de EDAC de nuevo aporte al 1%. Se taparon los tubos y se incubaron a C durante 24 horas. A continuación de esta incubación, las bolas se enjuagaron dos veces con PBS y, o bien se utilizaron seguidamente, o se guardaron durante varios días a 4 C antes de utilizarlas. Se prepararon extractos de células diana recién marcados a partir de líneas de células de cáncer de mama humano marcadas con 1-I por el método de la lactoperoxidasa de Marchalonis, J., An Enzymic Method for the Trace Iodination of Immunoglobulins and other Proteins, Biochem. J. 113:299- (1969), o con 3-S por cultivo en metionina marcada con 3-S. Las células marcadas se disolvieron en tampón de solubilización [Triton X-0 al 1% (volumen/volumen), NaCl 0 mm, EDTA mm, Tris- HCl mm, ph 7,]. Cuatro partes de extracto marcado se mezclaron en un recipiente con una parte de tampón de solubilización que contenía 0 mg/ml de sero-albúmina de bovino, para dar una concentración final de mg/ml de BSA. Las bolas revestidas con el anticuerpo monoclonal se añadieron al recipiente y se incubaron durante cuatro horas sobre hielo con agitación. El antígeno marcado se pipeteó desde el recipiente y las bolas se enjuagaron cuatro veces con tampón de solubilización. Las bolas se retiraron luego, se pusieron en tubos individuales con 0 microlitros de tampón de muestra de gel de SDS Laemmli, y se incubaron por espacio de tres minutos en agua hirviente. Se retiraron las bolas y las muestras se 19

20 corrieron sobre un gel de SDS con estándares apropiados. Los ensayos de inmuno-precipitación sobre los anticuerpos indicaron que el anticuerpo 79E3 se fija a una proteína monómera de aproximadamente 0 kilodaltons encontrada en el tejido de mama canceroso. Cuatro de los anticuerpos (41B4, 87H7, 42E12, 47D7) se fijaban a un antígeno intracelular de daltons. Los anticuerpos 0F9, 3E2, y 697B3 se fijaban a mucinas de peso molecular alto (HMW, del inglés high molecular weight ). El anticuerpo 44A12 se fijaba a los receptores de transferrina en forma de un antígeno de daltons. Ni el anticuerpo 41C3 ni el 44A12 bloqueaban la fijación de transferrina al receptor. Las características de fijación de antígenos de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención se resumen en la Tabla 7. TABLA 7 MAB Antígeno 3 9C6 32A1 3E 41B4 87H7 6A 1H7 1A7 0F9 3E2 219F3 4H9 387H9 421E8 41C3 42E12 44A12 47D7 697B3 79E3 70 K 80 K 2 K 2 K K Muy difuso Mucina HMW Glicolípido (pentasacárido) Mucina HMW Mucina HMW K Receptor de transferrina 2 K Receptor de transferrina 2 K 0 K 0 K 4 0 Isotipo de los anticuerpos Se determinó el isotipo de los anticuerpos como sigue: se dibuja a lápiz ligeramente una rejilla de cuadrículas de mm sobre una hoja de nitrocelulosa y se aplican gotitas de 1 ml de sueros anti-isotipo (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, antisueros de conejo para las cadenas κ, λ, α, γ1, γ2a, γ2b, γ3, y µ de ratón) de tal manera que cada fila de cuadrículas recibe una mancha de cada reactivo de cadena pesada y ligera. La hoja se incuba durante una hora a la temperatura ambiente en una cámara húmeda, se enjuaga rápidamente en PBS-BSA, que contiene 1% (peso/volumen), y se deja durante una noche en PBS-BSA a 4 C. Se divide en tiras por corte con unas tijeras y las tiras se pueden guardar a4 C en PBS-BSA que contiene 0,02% de azida de sodio. Alternativamente, las tiras se pueden secar al aire y pueden guardarse desecadas a 4 C. Se prepara una serie de pequeños tubos que contienen 3 ml de sobrenadante de cultivo de hibridoma o sobrenadante diluido con PBS-BSA. Generalmente son satisfactorias las diluciones 1:; y algunos sobrenadantes se pueden diluir tanto como 1:0. Se incuba una tira de nitrocelulosa en cada tubo durante una hora a la temperatura ambiente. Las tiras se enjuagan tres veces en PBS-BSA y se incuban durante una hora a la temperatura ambiente en peroxidasa de rábano picante de conejo anti-ratón diluida. Las tiras se enjuagan dos veces en PBS-BSA y otras dos veces en tampón Tris. Se ponen las tiras en tampón Tris que contiene diaminobencidina y peróxido de hidrógeno hasta que se desarrolla suficiente color en las manchas anti-isotipo (usualmente 3-4 minutos). Los isotipos de los anticuerpos se indican en la Tabla 8.

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