MARTINS, R.M. 1 ; GONZÁLEZ, F.H.D. 2

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1 Uso del aceite de citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) (Panicoidideae) como acaricida frente a la garrapata Boophilus microplus Canestrini (Acari:Ixodidae). 1 MARTINS, R.M. 1 ; GONZÁLEZ, F.H.D. 2 1 Departamento de Ciências Biomédicas do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade de Caxias do Sul, R. Francisco Getúlio Vargas, 1130, Caxias do Sul/RS, Brasil. CEP: Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua Bento Gonçalves, 9090, Porto Alegre/ RS, Brasil. RESUMEN: En este trabajo son descritos dos experimentos in vivo de una nueva alternativa de control de la garrapata Boophilus microplus Canestrini. Fue utilizado el aceite esencial de la gramínea Cymbopogon winterianus Jowitt (Citronela de Java), aplicado puro en la línea dorsal del animal (vía pour on) o utilizado por vía de aspersión del aceite diluido en alcohol en la proporción de 1/10. Los resultados obtenidos indicaron que las dos alternativas de control fueron eficientes en el control del ácaro, no fueron tóxicas para los bovinos y pueden tornarse un tratamiento complementario para el control de cepas de garrapatas resistentes a los productos químicos. Aún sin ser objetivo del trabajo, el tratamiento con Citronela de Java indicó ser repelente de la Mosca del Cuerno de los bovinos (Haematobia irritans L.). Palabras clave: Aceite de citronela de Java, Cymbopogon winterianus, acaricida, garrapata, Boophilus microplus RESUMO: Uso do óleo de citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) (Panicoidideae) como acaricida frente ao carrapato (Boophilus microplus Canestrini) (Ixodidae). Neste trabalho são descritos dois experimentos in vivo de uma nova alternativa de controle do carrapato Boophilus microplus Canestrini. Foi utilizado o óleo essencial da gramínea Cymbopogon winterianus Jowitt (Citronela de Java), aplicado puro na linha dorsal do animal (via pour on) e por via de aspersão do óleo diluído em álcool na proporção de 1/10. Os resultados indicaram que estas duas alternativas de controle foram eficientes no controle do ácaro, não foram tóxicas para os bovinos e podem se tornar em tratamento complementar para o controle de cepas de carrapatos resistentes a produtos químicos. Mesmo não sendo objeto do trabalho, o tratamento com citronela de Java indicou ser repelente da Mosca do Chifre dos bovinos (Haematobia irritans L.). Palavras-chave: Óleo de citronela de Java, Cymbopogon winterianus, acaricida, carrapato, Boophilus microplus INTRODUCCIÓN Los acaricidas comerciales empleados para controlar las infestaciones de Boophilus microplus Canestrini (Acari:Ixodidae), además de no resolver definitivamente el problema, son también tóxicos para los bovinos y para el propio ser humano. Las pérdidas pueden ser momentáneamente disminuidas por el empleo de estos acaricidas químicos, pero la resistencia del B. microplus ha sido una constante a lo largo de los años (Nolan & Schnitzerling, 1986; Kunz & Kemp, 1994; Benevides et al., 1999; Martins & Furlong, 2001). La resistencia ocurre por que genotipos resistentes son seleccionados por el uso inadecuado de los acaricidas. Estas características transmitidas a la descendencia, generan cepas resistentes a los acaricidas (Whitten et al., 1982). Por otro lado, Clark & Sanches (1983) relataron la intoxicación de animales sometidos a consecutivos baños de acaricidas químicos, que sumados al estrés Recebido para publicação em 10/01/2006 Aceito para publicação em 03/03/2007

2 2 físico del tratamiento, predisponen los bovinos a otras enfermedades. Un control alternativo de esta garrapata fue buscada por algunos investigadores que defienden el control biológico por hongos (Bittencourt et al.,1989) y bacterias (Brum et al., 1991) y también la utilización de inmunizaciones (Kemp et al., 1986), creación de razas resistentes de bovinos (Penna, 1990), uso de formas híbridas estériles de garrapatas (Losburn & Knipling, 1982) y cultivo de pastos repelentes a las garrapatas (Sutherst & Wilson, 1986). En la bibliografía existen también algunas citaciones sobre el uso de extractos vegetales para control de las garrapatas. Encontramos citaciones sobre este tema, en trabajos de Porter et al. (1995), Johnson et al. (1997), Chungsamarnyart & Jansawan (1996), Williams & Mansingh (1996), Sivaramakrishnan et al. (1996), Vatsya & Singh (1997), y Williams et al. (1997). Los extractos de la gramínea citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) (Andropogoneae: Panicoideae) han sido descritos en la literatura como controladores de hongos (Dikshit & Husain, 1984), nemátodos (Sangwain et al., 1985) e insectos coleópteros y lepidópteros (Srivastava et al., 1988; Singh & Chaudhary 1988; Roychoudhury et al., 1989; Marimuthu et al.,1997). Más recientemente, Alves et al. (2000) cita que la Mosca del Cuerno (Haematobia irritans Linnaeus), fue controlada por el uso de extractos de la Citronela de Java. Sin embargo, no fueron encontradas citas sobre el uso de extractos de esta planta en el control del B. microplus. La Citronela de Java es oriunda de Sri Lanka (antiguo Ceilán) y fue obtenida a partir de la selección de una variedad inferior en producción de aceite, el Cymbopogon nardus Rendle (Virmani et al., 1979). La utilización de aceites esenciales para diversos fines terapéuticos no es una práctica reciente (Ahmad et al., 1993). Para el tratamiento de parásitos de los animales, Banerjee (1997) presenta varias alternativas del uso de fitoterápicos. Para validar acaricidas químicos, además de las pruebas in vitro descritas por Drummond et al. (1973), se utilizan pruebas de establo, según protocolo originalmente descrito por Roulston et al. (1968). Sin embargo, estos testes son muy caros y necesitan de animales sin previo contacto con la garrapata, lo que es muy raro de encontrar. El objetivo de este trabajo fue probar, bajo condiciones de campo, un producto natural y no contaminante del medio ambiente para controlar la infestación de la garrapata B. microplus. Fue también objetivo del trabajo, saber si este tratamiento sería tóxico para los bovinos. Finalmente, esta investigación buscó una alternativa de escape para el fenómeno de resistencia de las garrapatas a los productos químicos convenciona. MATERIAL Y MÉTODO Aceite de citronela de Java El aceite de citronela de Java utilizado en los experimentos fue producido en los laboratorios de la División de Aceites Esenciales del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Caxias do Sul, RS, Brasil. Las plantas para la extracción fueron producidas en una finca del municipio de Santo Antonio da Patrulha/RS, Brasil. El método de extracción del aceite utilizado fue el de arrastre de vapor de agua con calderas automatizadas que permiten que la presión y la temperatura del vapor que entra en contacto con las hojas, puedan ser bien controladas. El agua utilizada fue previamente tratada evitando, no solamente la corrosión, sino también permitiendo que el aceite extraído mantuviera su pureza y características. Las principales características del aceite de Citronela de Java utilizado en cuanto a sus compuestos principales fueron: Citronelal (41,15%); Geraniol (17,90%) y Citronelol (17, 28%). La densidad relativa es de 0,881, el índice de refracción de 1,470 y el desvío polarimétrico de cero. Garrapatas y larvas de Boophilus microplus (Canestrini) Las larvas y teleoginas de B. microplus utilizados en esta investigación procedían de bovinos estabulados e infestados con la cepa CPVDF, resistentes a productos organo-fosforados (Centro de Pesquisas Veterinaria Desidério Finamor FEPAGRO /RS Brasil). Después de la cosecha diaria por tres días, las teleoginas fueron transportadas al laboratorio y lavadas con una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% para prevenir contaminaciones bacterianas y fúngicas, siendo escogidos individuos adultos, aparentemente saludables y del mismo tamaño. Las teleoginas fueron encubadas a 27ºC con 70% de humedad para el desove y eclosión de las larvas, para posterior uso el los Experimentos. Experimentos Fueron utilizadas para los experimentos 60 bovinos hembras de raza mestiza europea, con 3 años de edad y peso alrededor de 350 kg, con una desviación estandar de 23 kg, los cuales fueron mantenidos en el campo durante todo los experimentos. Fueron hechos dos experimentos con la finalidad de observar la potencialidad acaricida del aceite estudiado. En el día cero, 60 bovinos fueron infestados con aproximadamente larvas de B. microplus en cada animal. Las larvas eran oriundas de huevos previamente incubadas. En el día 20 los animales fueran tratados con Citronela de Java, como

3 3 se describe posteriormente. En los animales se hicieron tomas de sangre en el día 14 y 28 con el objeto de hacer pruebas bioquímicas de función metabólica. A partir del día 22 de la infestación y en días alternados, las garrapatas encontradas en el cuerpo de los animales fueron contadas hasta el día 28. Este periodo fue elegido por ser, en el ciclo biológico, el de más grande número de ácaros en el animal. El conteo de las garrapatas fue hecho en ácaros con aproximadamente 0,5 cm o más de largo en la mitad del cuerpo del animal y después multiplicado por dos para estimarse el número total de parásitos en cada bovino. Los animales fueron marcados, divididos en dos lotes de 30 y sueltos en dos potreros distintos. Durante los experimentos y hasta 30 después, los animales fueron acompañados para la observación de alguna alteración. Experimento I: Aleatoriamente, 15 animales del potrero 1 fueron tratados tópicamente con 40 ml de aceite puro de citronela de Java en la línea dorsal de los animales (vía pour on) en el día 20 después de la infestación. Otros 15 animales fueron tratados con el mismo volumen de placebo (aceite de girasol) y quedaron de control. Experimento II: Aleatoriamente, 15 animales del potrero 2 fueron tratados tópicamente con aceite de citronela de Java por vía de aspersión en el día 20 después de la infestación. El tratamiento fue hecho con 2000 ml por animal (200 ml de citronela de Java y 1800 ml de etanol 95%) de forma que todo el cuerpo del animal fuera mojado. Otros 15 animales quedaron de control y recibieron el mismo volumen de tratamiento con placebo (aceite de girasol diluido en etanol 95% en la proporción de 1:10). Pruebas Bioquímicas: Con los sueros sanguíneos de los animales de los Experimentos I y II, fueron hechas pruebas bioquímicas para detectar alguna posible alteración hepática del animal, provocada por el tratamiento con el aceite de Citronela de Java. Fueron hechas pruebas para analizar albúmina, aspartato transaminasa (AST), bilirrubina, colesterol, gama glutamil transferasa (GGT), proteína total y globulinas. Estos testes detectan intoxicación hepática del animal por uso de medicamentos (Kaneko et al.,1997. Las pruebas fueron realizadas en espectrofotómetro semiautomático (Metrolab 1600, Argentina) utilizando técnicas específicas de kits diagnósticos (Labtest, Brasil). Análisis Estadística De los Experimentos: Los datos fueran descritos por promedio y dosis patrón, con un presunto de igualdad en el conteo de las garrapatas (p>0,05). Los grupos de intervención fueron comparados por análisis de varianza para un criterio de clasificación (ANOVA ONE-WAY) con el teste post-hoc de Tukey (Zar, 1996). El nivel de significancia usado fue = 0,05. Los datos fueran procesados con el auxilio del programa SPSS, versión De las Pruebas Bioquímicas: Para los cálculos estadísticos de las pruebas bioquímicas, fue considerado un grado mínimo de confiabilidad de 95% en el teste T de Student, con relación a su control. Fueron analizadas muestras de sangre de los 60 animales de los Experimentos I y II. RESULTADO Los resultados de la acción acaricida del aceite de citronela de Java frente a la garrapata B. Microplus, utilizado por vía tópica en la línea dorsal del animal o por vía de aspersión diluido en alcohol, se mostraran satisfactorios, cuando comparados a sus respectivos controles (Tabla 1). Todos los resultados fueran de p<0,001, de tal forma que los TABLA 1. Número promedio de garrapatas por animal en los Experimentos I y II y su Desviación Estándar.

4 4 grupos fueran distintos entre si por el teste de posthoc de Tukey. Se observó que en el día 24 hubo un número más grande de garrapatas en los animales tratados y controles, lo que es normal en el ciclo biológico del ácaro, razón porque el conteo individual de las garrapatas fue hecho entre los días 22 y 28 después de la infestación. En este periodo, ocurrió una diferencia significativa entre el conteo total de las garrapatas en los animales tratados en relación a sus respectivos controles, indicando que los tratamientos con Citronela de Java, fueron eficientes para el control de la garrapata B. microplus. Cuanto a las pruebas bioquímicas, los resultados demostraron que los metabolitos de los animales del Experimento I se encuentran dentro de la normalidad según Kaneko et al. (1997) y que las únicas alteraciones observadas fueron una pequeña disminución en las concentraciones de colesterol (p = 0,049), proteína total (p = 0,033) y globulinas (p = 0,041) de los animales tratados en comparación a sus controles (Tabla 2). Estas alteraciones, sin TABLA 2. Resultados promedios de metabolitos séricos de 30 bovinos del Experimento I, antes y después de los tratamientos con citronela de Java (Experimento I).

5 5 embargo, cuando comparadas con valores normales, no caracterizan alteraciones, indicando que el tratamiento tópico en la línea dorsal no fue hepatotóxico para los animales. En las análisis de las muestras de sangre de los bovinos del Experimento II, los resultados demostraran que tampoco hubo diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de metabolitos de los animales tratados y los animales controles, indicando que el tratamiento tópico por aspersión en las dosis utilizadas, no fue hepatotóxico para los bovinos (Tabla 3). TABLA 3. Resultados promedios de metabolitos séricos de 30 bovinos del Experimento II, antes y después de los tratamientos con citronela de Java (Experimento II).

6 6 También fue observado que en los animales tratados con el aceite de citronela de Java, no hubo la presencia de la Mosca del Cuerno durante la realización de los Experimentos y que por acompañamiento clínico, ningún animal tuvo enfermedad transmitida por las garrapatas hasta 30 días después del inicio de los tratamientos. DISCUSIÓN La propuesta de la presente investigación tuvo dos objetivos. El primero fue investigar la posibilidad del uso del aceite de citronela de Java, como un producto natural para el control del B. Microplus y el segundo fue buscar un tratamiento alternativo no tóxico para los animales y eficiente para controlar las cepas resistentes de este ácaro a productos químicos convencionales. Los resultados demostraran que estos objetivos fueron plenamente alcanzados en las dos formas de tratamiento, o sea, por vía pour on del producto puro o por vía de aspersión del aceite diluido en alcohol en la proporción de 1/10. Otra ventaja de este tratamiento alternativo es que permite una infestación moderada de B. microplus (hasta 20 garrapatas por animal), y que por lo tanto puede conferir al animal una inmunidad natural contra las enfermedades transmitida por esta garrapata. Los animales tratados no enfermaron de Babesiosis o Anaplasmosis después de los Experimentos. Los principales compuestos del aceite de citronela de Java (Citronelol, Citrinelal y Geraniol) parecen tener una acción sinérgica contra la garrapata, según experimentos in vitro anteriormente descritos (Martins, 2006). Esta característica no favorece la aparición de nuevas cepas resistentes por tratarse de un conjunto de substancias con estructuras moleculares muy complejas. Esta característica, según Whitten et al. (1982), dificulta la selección de genotipos resistentes. Otro factor que posiblemente participe de este hecho es que la citronela de Java, por ser volátil y de rápida absorción, tiene bajo poder residual lo que no es favorable al surgimiento de cepas resistentes ya que, según Gonzales (2002), los productos con mayor poder residual son favorables a la selección natural de los individuos más fuertes y una situación de super población de garrapatas, determina la aparición de cepas resistentes a los acaricidas. El uso tópico del aceite de citronela de Java, tanto en la línea dorsal del animal (vía pour on) como la dilución en alcohol del producto en la proporción de 1:10, aplicada en forma de aspersión individual, además de simples manejo, puede funcionar también como repelente de otros insectos como la Mosca del Cuerno, una vez que en nuestros experimentos los animales tratados con Citronela de Java no presentaran esta infestación durante los experimentos. Alves et al. (2000) anteriormente también describen esta observación. Este hecho, sin embargo, no fue objetivo inicial de la presente investigación, tratando-se de una observación paralela. Los tratamientos con la citronela de Java no presentaran toxicidad para el hígado de los animales. Las pruebas bioquímicas no mostraron disminución significativa de albúmina, colesterol, proteína total y globulinas así como tampoco mostraron un aumento significativo de AST, GGT o bilirrubina, indicadores de problemas de intoxicación o daño hepático (Kaneko et al.,1997). Por otro lado, tratamientos que no erradican las garrapatas también son importantes, ya que para otros seres de la naturaleza, la garrapata está presente en su dieta, como es el caso de ratones, sapos, arañas, hormigas, insectos y diversas aves silvestres, participando como importante fuente de proteína. La erradicación de las garrapatas por uso indiscriminado de acaricidas químicos, puede quebrar este equilibrio, según Gonzales (2002). Para que el aceite de citronela de Java pueda ser utilizado como acaricida en nivel de campo, falta todavía un largo camino de investigación. Deben ser estudiadas otras variables tales como efectos climáticos, poder residual, posibles efectos en la gestación, presencia del producto en la carne y en la leche, además de ser probado frente a nuevas cepas de garrapatas resistentes a otros productos químicos. La ventaja es que la citronela de Java, además de poder tornarse una alternativa complementaria interesante para ser probada, también es degradable en la naturaleza y por lo tanto no debe contaminar el medio ambiente (Virmani et al. 1979). La propuesta de esta alternativa no pretende ser la solución final, pero si un estudio nuevo que puede tornarse una forma útil de tratamiento, especialmente en el surgimiento de cepas resistentes de garrapatas a los productos químicos. Finalmente, el uso de la citronela de Java como fue propuesto en este estudio, es un acaricida con buenas posibilidades para ser usado en pequeñas propiedades rurales, principalmente en fincas de ganado lechero con un pequeño número de animales y que no disponen de instalaciones especiales para tratamientos de inmersión o aspersión. Esta opinión está basada en el hecho de que los ganaderos de leche en América del Sur, generalmente tienen este perfil (Fonte et al., 1998) y por no tener muchos recursos económicos, buscan soluciones sencillas para sus problemas de sanidad animal. CONCLUSIONE 1 a ) El uso del aceite de Citronela de Java empleado en la línea dorsal del animal (vía pou ron) o por vía de aspersión, es una alternativa natural, eficiente e inédita para ser utilizado en el control del ácaro B. microplus, principalmente como tratamiento

7 7 complementario frente a cepas resistentes a productos químicos. 2 a ) El tratamiento con el aceite de Citronela de Java en las dosis utilizadas no fue hepatotóxico para los bovinos. AGRADECIMIENTO Al Dr. João Ricardo de Sousa Martins por suministrar las cepas de garrapatas, al Dr. Augusto Cunha por suministrar los animales, al Veterinário Claudio Chiminazzo y Sr. Juvenal Grigoleti por la ayuda en los trabajos de campo, a la Dr a Luciana Serafini por suministrar el aceite de citronela de Java, al Dr. Mario Wagner por la ayuda con los cálculos estadísticos y al Dr. João Carlos Gonzales por la ayuda con la bibliografía. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA AHMAD, R. et al. Medicinal importance of essential oils. Hamdarb Medicus, v.36, n.3, p ALVES, F.P.J. et al. Atividade de repelência do extrato de Citronela nas infestações por Haematobia irritans em bovinos. Anais do XI Seminário Brasileiro de Parasitologia Veterinária, p.123, BANERJEE, P.S. 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