I ENCUENTRO NACIONAL DE FAMILIAS CON NIÑOS ENFERMOS MITOCONDRIALES. BURGOS 2013

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1 I ENCUENTRO NACIONAL DE FAMILIAS CON NIÑOS ENFERMOS MITOCONDRIALES. BURGOS 2013

2 Nuevas estrategias para la identificación genético-molecular en medicina mitocondrial Miguel A. Martín! Servicio de Bioquímica Clínica! Laboratorio Enfermedades Mitocondriales.!

3 UNIDAD PEDIATRICA DE ER, METABOLICAS Y MITOCONDRIALES. SECCION PATOLOGÍA NEUROMUCULAR SECCION DE NEUROMUSCULAR ADULTOS LABORATORIO DIAGNÓSTICO BIOQUIMICO Y GENETICO EM GRUPO DE INVESTIGACIÓN ENF. MITOCONDRIALES Y NEUROMETABOLICAS

4 INDICE 1 CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL 2 DELECIONES DEL ADN MITOCONDRIAL 3 MUTACIONES FRECUENTES DEL AND MITOCONDRIAL 4 SÍNDROMES DE ESTABILIDAD DE AND MITOCONDRIAL 5 PATOLOGÍA MITOCONDRIAL Y NEXT- GENERATION SEQUENCING (NGS) 6 PROYECTOS NGS DE NUESTRA UNIDAD

5 CADENA RESPIRATORIA: CONTROL GENÉTICO DUAL ENFERMEDAD MITOCONDRIAL GEN MITOCONDRIAL GEN NUCLEAR Componentes estructurales de los complejos de la CRM NÚCLEO Factores de ensamblaje de la CRM Estabilidad del mtdna V IV C III Q II mtdna MITOCONDRIA I Otros factores involucrados en la biogénesis de la CRM

6 EL PROTEOMA MITOCONDRIAL >1000 PROTEÍNAS ( 13 PROTEÍNAS ESTÁN CODIFICADAS POR EL ADN MITOCONDRIAL h;p://

7 El tejido muscular: clave para evaluación cadena respiratoria mitocondrial Ø Puede estar ausente (tejido, técnicas, amplio intervalo de normalidad) Ø Puede verse en otras enfermedades no mitocondriales (inflamación, inmovilidad...) Ø Es común a diferentes causas mitocondriales

8 VALORACIÓN ESPECTROFOTOMETRCA CRM 2013 MÉTODOS MEJORADO Y CONSENSUADO EN EL PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN MEDICINA MITOCONDRIAL CIBERER

9 mtdna 1981: Secuenciación del mtdna humano: o Inicio de la Medicina Mitocondrial 1988: o LHON es asociada con mutaciones puntuales mtdna o MiopaSa mitocondrial asociada a deleciones del mtdna 2012: o Mas de 300 mutaciones puntuales y deleciones asociadas con una amplísima variedad de síntomas (

10 DELECIONES SIMPLES/ÚNICAS METODO CLASICO : HIBRIDACION SOUTHERN- BLOT CON SONDAS GENETICAS MARCADAS DE mtdna NUEVAS APROXIMACIONES: MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION (MLPA) (MRC HOLLAND SALSA KIT P- 125) NEXT- GENERATION SEQUENCING (NGS) mtdna

11 DELECIONES UNICAS mtdna DELECIÓN ÚNICA CONTROL

12 MUTACIONES PUNTUALES FRECUENTES mtdna

13 PCR-RFLP mtdna- MTTL1 m.3243a>g DNA Sangre DNA Músculo C SECUENCIACION GEN MT TL1 (trnaleu(uur) +1 +2

14 Minisecuenciación (SNaPShot) Panel 20 mutaciones mtdna + 1 mutación POLG p.a457t normal Microfluidico PCR-RFLP (cuantificación de heteroplasmia) Secuenciación directa gen mtdna (confirmación de mutación)

15 MUTACIONES EN GENES NUCLEARES E.M. 1995: Primera mutación asociada a un gen nuclear. Complejo II - SDHA Síndrome Leigh. Siglo XXI: Secuenciación del genoma humano Caracterización del proteoma mitocondrial Next generahon sequencing Genome/ Exome/ Mitoexome/Paneles 2012: > 110 genes nucleares con mutaciones que afectan la cadena respiratoria mitocondrial: ² EXPRESION ² ENSAMBLAJE ² FUNCIÓN

16 GENES AFECTADOS EN ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

17 SíNDROMES ESTABILIDAD DEL mtdna 1. ad-peo y ar-peo (Oftalmoplejía externa progresiva) 2. MDS (Síndrome de depleción mitocondrial) DELECIONES MULTIPLES DEPLECIÓN

18 DELECIONES MULTIPLES mtdna

19 DEPLECION DEL ADN MITOCONDRIAL 2013 MÉTODO MEJORADO Y CONSENSUADO qpcr a TIEMPO REAL Músculo Esquelético número copias mtdna /ndna % mtdna/ndna C 1 2 SI

20 Secuenciación masiva/ Next Generation Sequencing (NGS)/ Ultrasecuenciación Alta producción (Centros De Genómica) : Exoma/ WGS/ RNAseq Roche 454-FLX Life Science SOLID Solexa Illumina GA SECUENCIADORES DE SEGUNDA GENERACION Media/Baja (Bench-Top Sequencers): Targeted Sequencing: Gene Panels 454 GS Junior Roche Ion torrent Life Technologies MiSeq Illumina

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22 NGS y ENFERMEDADES MITOCONDRIALES: Heterogeneidad Clínica: obstáculo para establecer un diagnóshco genéhco definihvo Mayoría de los pacientes no Henen su ehología genéhca idenhficada Establecer un diagnóshco definihvo de EM en pacientes con sospecha de padecer mitocondriopasa es extremadamente complejo

23 NGS EQUIPOS EXPERTOS MULTIDISCIPLINARES CONOCIMIENTOS FISIOPATOLOGICOS + CONOCIMIENTOS BIOINFORMATICOS

24 Secuenciación total del mtdna: Antecedentes Secuenciación PCR + Sanger Convencional 1. Baja sensibilidad de detección: % carga mutacional (heteroplasmia) 3. >2005: PermiHó la idenhficación de mutaciones conocidads y nuevas potencialmente patogénicas en única Platafomra: gold- standard PCR/Sanger surveyor- based heteroduplex analysis chip- based array analysis

25 Genes Nucleares (ndna): Antecedentes I ndna Henen un papel importante en EM: 75% de los pacientes pediátricos 30% de los pacientes adultos q Antes de 2005: Muy pocos genes ndna estaban disponibles para secuenciación en los laboratorios de diagnóshco clínico

26 Genes Nucleares (ndna): Antecedentes II A lo largo de los 2000s, aumenta el número de genes ndna: 59 genes en genes en 2009 Más de 100 genes en 2010 La mayoría idenhficados en una sola o en pocas familias. Clínicos y Laboratorios Especializados seleccionan uno u pocos genes en pasos sucesivos uhlizando diagramas de decisión complejos

27 NGS y patología mitocondrial 1 Secuenciación de Exoma 2 Secuenciación NGS del mtdna 3 Paneles Dirigidos de Genes: - MitoExoma - Perfiles de Genes

28 Secuenciación de EXOMA EXOMA: 1% del total del GENOMA (30 Mb de Mb) que se incluye secuencia de Exoma? Exones (region codificante de PROTEINAS del genoma - ndna) + algunas regiones de genes no codificantes intrónicas + algunas zonas reguladoras NO se identificarán mutaciones definitivas en genes nucleares en todos los individuos en los que se sospeche EM.

29 Secuenciación de EXOMA Mutaciones no detectadas por razones tecnológicas: 1. Variantes en regiones dónde el genoma no es CAPTURADO 2. Genes que no son priorizados para su captura, secuencia o análisis bioinformáhco. 3. Ausencia de conocimiento biológico: variante benigna o patogénica 4. Mutaciones localizadas en regiones genómicas no analizadas 5. Reagrupamientos génicos estructurales (inserciones, deleciones)

30 Secuenciación de EXOMA Mutaciones NO detectadas por consideraciones genégcas: Trastornos autosómicos dominantes : Falta de conocimiento de la penetrancia Si las muestras de los padres no son analizadas simultáneamente para saber si una mutación es heredada o es de novo Herencia compleja : Heterocigosidad poli- génica: 2 o más genes dishntos contribuyen a la enfermedad Mutaciones tanto en genoma nuclear y mitocondrial contribuyen a la enfermedad Mutaciones en mtdna: difcil idengficación a través de EXOMA:

31 Next- Generagon Sequencing (NGS) y enfermedades del mtdna 1. Mejorar de la sensibilidad para detectar niveles bajos de heteroplasmia hasta 1 10 % 2. Captura y enriquecimiento de mtdna por PCR larga previa a NGS: Posibilidad de detectar simultaneamente bajos niveles de heteroplasmia + deleciones de mtdna

32 mtdna y NGS : Objegvo: detección simultánea de mutaciones puntuales mtdna y deleciones del mtdna

33 Estrategia NGS en Enfermedades Mitocondriales Paneles de genes: Análisis de un grupo de genes 1.Sindrome de depleción de mtdna y deleciones mulhples de mtdna Genes conocidos responsables de estos síndromes: mtdna replicahon salvage synthesis of purine/pyrimidine dexoynucleohdes maintenance of mtdna integrity

34 Estrategia NGS en Enfermedades Mitocondriales Paneles de genes: Análisis de un grupo de genes 2. Si Patrones específicos de déficits enzimáhcos de CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL. Deficiencia aislada de complex I : subunidades y genes de ensamblaje del compleko I Complex I+III and complex II+III: Genes CoQ10 Alteraciones en la traducción de proteínas mitocondriales impedida amino acyl trna synthetases, protein translagon factors, mitochondrial ribosomal proteins,mitochondrial trna modificagon factors.

35 Estrategia NGS en Enfermedades Mitocondriales MitoExoma : AnálIsis de genes nucleares relacionados con la función y estructura mitocondrial 2012:Target MitoExome ~1,000 nuclear genes 42 niños no relacionados con evidencia clínica y bioquimica de EM Diagnós9co de EM autosómica recesiva 10 de 42 (24 %) pacientes

36 454 GS Junior Roche PGM Ion torrent Life Technologies Ion Proton Sequencer Life Technologies

37 Validación mtdna NGS PGM IonTorrent (Life Technologies)

38 Validación mtdna NGS PGM IonTorrent (Life Techologies)

39 Validación mtdna NGS PGM IonTorrent (Life Techologies) chip m.3243a>g >40% AO1 m.3243a>g 2% - 5% AO1 m.3243a>g 17% AO1 m.3243a>g 35% AM1 m.3243a>g 91% AM1 m.3271t>c 90% (78% sanger) AM1 m.8344a>g 86% AM1 indel unknown "stretch C" 100%?? AS1 m.8391g>a 38% AM1 m.8993t>c 94% AS1 m.9204delat =m.9205delta 95 % - 98% AM1 m.13513g>a 52% (70% sanger) AS1 m.7191t>c 90% AS1 m.15853c>a 100% AS1 m.3460g>a 90% AM1 NO MUT mtdna PATG. NA AS1 NO MUT mtdna PATG. NA

40 Validación Panel Genes mantenimiento del mtdna PGM IonTorrent (Life Techologies) chip ion 314 MFN2 TWINKLE SUCLA2 POLG TK2 POLG2 DGUOK MPV17 SUCLG1 TYMP OPA1 SLC25A4 RRM2B

41 Validación Panel Genes mantenimiento del mtdna PGM IonTorrent (Life Techologies) chip ion 314

42 Paneles en desarrrollo avanzado: PGM IonTorrent (Life Techologies) chips ion 314 y 316. Ø Panel GENES NUCLEARES ESTRUCTURALES Y DE ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO I DE CRM (48 GENES) o METODOLOGIA AMPLISEQ LT Ø Panel GENES involucrados en DINÁMICA MITOCONDRIAL Y LA TRADUCCION DE PROTEINAS MITOCONDRIALES (75 GENES) o METODOLOGIA HALOPLEX (AGILENT TECHNOLOGIES)

43 Paneles en desarrrollo avanzado: PGM IonTorrent (Life Techologies) chips ion 314 y 316. Ø Panel GENES NUCLEARES ESTRUCTURALES Y DE ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO I DE CRM (48 GENES) o METODOLOGIA AMPLISEQ LT Ø Panel GENES involucrados en DINÁMICA MITOCONDRIAL Y LA TRADUCCION DE PROTEINAS MITOCONDRIALES (75 GENES) o METODOLOGIA HALOPLEX (AGILENT TECHNOLOGIES)

44 SECUENCIACION EXOMA DEFICITS CADENA RESPIRATORIA: MUTACIÓN [c.64t>c; p.trp22arg] GEN NDUFB3- COMPLEJO I CRM.

45 SECUENCIACION EXOMA DEFICITS DE CADENA RESPIRATORIA: MUTACIÓN [c.1392t>c; p.arg464cys] en el gen MTO1 MTO1 mitocondrial transla9on op9miza9on 1 homolog Codifica una proteína mitocondrial que parece estar implicada en la modificación postranscripcional de trnas mitocondriales + / - - / + + / +

46 SECUENCIACION EXOMA DEFICITS DE CADENA RESPIRATORIA:

47 PROYECTOS NUEVAS METODOLOGIAS GENETICAS/GENOMICAS PROYECTO GLOBAL EXOMA IDENTIFICACION DE NUEVOS GENES OXPHOS (FINALIZADO) INTRAMURAL CIBERER: PROGRAMA DE MEDICINA MITOCONDRIAL (6 GRUPOS ESPAÑOLES) ACCION COOPERATIVA INTRAMURAL INTRAMURAL CIBERER: PROGRAMA DE MEDICINA MITOCONDRIAL: COL: J.MONTOYA (U.ZGZ); E. GCIA- ARUMI (HVH BCN) PROYECTO COORDINADO ISCIII- FIS. MEDICINA MITOCONDRIAL: CONFIGURACION DE UNA ESTRATEGIA PARA LA IDENTIFICACION GENETICO- MOLECULAR DE PACIENTES OXPHOS. COLB E. GCIA- ARUMI (HVH BCN) ENFERMEDADES MITOCONDRIALES: CARACTERIZACION FUNCIONAL DE MUTACIONES PATOGENICAS EN ADN MITOCONDRIAL.