HAMA-ELISA medac. Castellano

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1 HAMAELISA medac Castellano

2 FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUCIÓN medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ DIRECCIÓN DE PEDIDOS Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ AVPS/031108

3 HAMAELISA medac Inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa de los anticuerpos humanos antiratón (HAMA, Human AntiMouse Antibodies) Cat. No.: 10018A PARA USO EXCLUSIVO DE DIAGNOSTICO IN VITRO INTRODUCCIÓN Los anticuerpos monoclonales de ratón se utilizan in vivo para la inmunosupresión después de un trasplante con el objetivo de evitar cuadros de rechazo, para suprimir fases agudas de autoinmunopatías y para la inmunogammagrafía o la inmunoterapia in vivo en pacientes con tumores. La administración de anticuerpos monoclonales de ratón puede inducir la aparición de HAMA en estos pacientes. Un uso reiterado de anticuerpos monoclonales de ratón suele provocar un aumento significativo de la concentración de HAMA en el suero del paciente. Los HAMA desarrollados son en su mayor parte antiisotípicos, y rara vez antiidiotípicos. Los HAMA pueden influir en la eficacia de la inmunoterapia o dela inmunogammagrafía: los HAMA se unen a los anticuerpos monoclonales administrados y la formación de inmunocomplejos (HAMAmAb) reduce la eficacia terapéutica y el valor diagnóstico de los anticuerpos monoclonales. En los pacientes HAMApositivos existe un mayor riesgo de reacciones anafilácticas tras la administración repetida de anticuerpos monoclonales de ratón. Los inmunoensayos para el diagnóstico in vitro suelen basarse en el uso de anticuerpos monoclonales de ratón. Los HAMA pueden generar resultados falsamente positivos y negativos en estos ensayos. La incorporación de anticuerpos de ratón en los diluyentes de los inmunoensayos no siempre logra eliminar por completo los efectos indeseables producidos por los HAMA. El HAMAELISA medac es un inmunoensayo enzimático simple y rápido en un solo paso para la determinación cuantitativa de los HAMA en el suero. La determinación está calibrada frente a anticuerpos antiratón IgG. El rango de medida del HAMA ELISA medac es de 40 a 2000 ng/ml AVPS/

4 PRINCIPIO DE LA DETERMINACIÓN La placa está recubierta de IgG de ratón (antígeno). Se añaden las muestras y las IgG de ratón marcadas con peroxidasa (conjugado)(p = peroxidasa). Los anticuerpos humanos antiratón (HAMA) se ligan a la fase sólida y a los IgG de ratón marcados con peroxidasa. Incubación con el sustrato TMB (*). La reacción se detiene mediante la adicción de ácido sulfúrico. La absorción se lee con un fotómetro. Ventajas del ensayo Ensayo en un solo paso con una incubación corta. Las tiras de micropozos permiten un uso óptimo de la prueba. Los reactivos de colores permiten controlar visualmentecada etapa de pipeteo. Compatible con la automatización en equipos ELISA abiertos AVPS/

5 CONTENIDO DEL EQUIPO Ref.: 10018A 1. MTP Microplaca: 12 x 8 pozos (con soporte y desecante, en una bolsa de aluminio al vacío), divisibles, en forma de U, recubiertos de IgG de ratón y SAB, lista para su usar. 2. CONTROL 1 + Control positivo 1: 1 vial con 0,75 ml de anticuerpos IgG de cabra antiratón, listo para usar, de color azul, que contiene SAB, FSC, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 3. CONTROL 2 + Control positivo 2: 1 vial con 0,75 ml de anticuerpos IgG de cabra antiratón, listo para usar, de color azul, que contiene SAB, FSC, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 4. CAL Estándares: 1 vial cada uno de 0,75 ml de anticuerpos de cabra antiratón IgG, listo para usar, de color azul, que contiene SAB, FSC, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 4a. CAL 1 Estándar 1: 2000 ng/ml 4b. CAL 2 Estándar 2: 1000 ng/ml 4c. CAL 3 Estándar 3: 500 ng/ml 4d. CAL 4 Estándar 4: 200 ng/ml 4e. CAL 5 Estándar 5: 40 ng/ml 5. WB Solución de lavado: 1 vial de 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, que contiene ProClin TM AVPS/

6 6. VIRDIL Diluyente de la muestra: 1 vial de 110 ml, PBS/Tween/SAB, Ph 7,2 7,4, listo para usar, de color azul, que contiene ProClin TM CON Conjugado: 2 viales cada uno con 5,0 ml de IgG de ratón, HRPconjugado, listo para usar, de color naranja, que contienen SAB, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 8. TMB TMBsubstrato: 2 viales de 10 ml cada uno, listo para usar. 9. STOP Solución de parada: 1 vial de 11 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (H2SO4), listo para usar. 1. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Material/Reactivos Estado Almacenamiento Estabilidad Equipo sin abrir C Hasta la fecha de caducidad Microplaca abierto C en la 4 semanas bolsa con desecante Controles abierto C 4 semanas Estándares abierto C 4 semanas Solución de lavado diluida C 4 semanas Diluyente de la abierto C 4 semanas muestra Conjugado abierto C 4 semanas TMBsubstrato abierto C 4 semanas Solución de parada abierto C Hasta la fecha de caducidad No se deben utilizar los reactivos tras la fecha de caducidad. 2. REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIOS QUE NO SE PROPORCIONAN 2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede alterar el procedimiento de la técnica AVPS/

7 2.2. Micropipetas adjustables Contenedores de cristal o de de plástico limpios para la dilución de la solución de lavado y de las muestras Sistemas apropiados para el lavado de la microplaca (e.j. pipeta multicanal o lavador de ELISA) Incubador de 37 C Lector de microplaca con filtros para 450 nm y nm. 3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente. Calcular el número de pocillos que se necesiten Microplaca La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el desecante cada vez que se separen pocillos. El almacenamiento y la estabilidad de los pocillos se indican en punto Solución de lavado Mezclar un volumen de solución de lavado (10x) con 9 volúmenes de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10x) con 450 ml de agua). Para 8 pocillos, se requieren 5 ml de solución de lavado diluída. Si se observan cristales en la solución de lavado (10x), deberan de disolverse por calentamiento (max. a 37 C), y/o agitación a temperatura ambiente. No mezcle reactivos de diferentes lotes o fabricantes. Sólo obtendrá resultados válidos y reproducibles si sigue de forma rigurosa el procedimiento de la prueba y utiliza los reactivos específicos del kit. 4. MUESTRAS 4.1. El ensayo es apropriado para suero AVPS/

8 4.2. No es necesario un tratamiento previo del suero (por ejemplo, inactivación). No obstante, no debe contaminarse con microorganismos ni contener glóbulos rojos Las muestras séricas deben diluirse a 1:10 con el diluyente de muestra (por ejemplo 20 μl de suero μl de diluyente). Las muestras fuera del rango de medida pueden diluirse más. (Véase 6.A.) 5.A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA 5.1. Corte la bolsa de aluminio por encima del cierre zip y extraiga el número de pozos necesario (véase 3.1.). Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no necesitan prelavado Añadir 100 μl de diluyente de la muestra en el pozo A1 para la determinación del blanco. Añadir 50 μl de cada estándar, control y muestra diluida, por duplicado, en los pozos respectivos. Después pipetee 50 μl de conjugado en todos los pozos, salvo A1. El pipeteo de los estándares, controles, muestras y conjugado debe realizarse en menos de 10 minutos. Más allá de este plazo, la placa debe incubarse inmediatamente (véase 5.3.). Atención: Si el procedimiento se realiza con un equipo automatizado, debe añadir en cada pozo 60 μl de estándar, control, muestra y conjugado en cada pozo debido a una mayor evaporación en la cámara de incubación del equipo. El uso de la prueba con equipos automátizados ha sido validado durante la evaluación de la prueba. Sin embargo, recomendamos comprobar la compatibilidad de la prueba con los equipos utilizados en el laboratorio Incubar la microplaca durante 30 min (± 1 min) a 37 C (±1 C) en una cámara húmeda o recubierta con film para incubación Tras la incubación, lavar la microplaca tres veces con 200 μl de solución de lavado por pozo. Comprobar que se hayan rellenado todos los pozos. Tras el lavado, golpear suavemente la microplaca sobre papel absorbente. No dejar secar los pocillos! Proceder inmediatamente! 10018AVPS/

9 5.5. Añadir 100 μl de sustrato TMB en cada pozo (también al A1) e incubar durante 15 min (± 1 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o recubierta con film para incubación, en la oscuridad. Las muestras positivas se vuelven azules Detener la reacción añadiendo 50 μl de solución de parada en cada pozo (también el A1). Las muestras positivas se vuelven amarillas. Mezclar bien el contenido de los pozos mediante una agitación suave, limpiar la parte inferior de los pozos antes de la lectura fotométrica y procure que no haya burbujas de aire en los pozos. La lectura debe realizarse en un plazo de 10 minutos después de añadir la solución de parada. 5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Blanco Estándares Controles Muestras (A1) Diluyente de la 100 μl muestras Estándares Controles Muestras 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Conjugado 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Incubar durante 30 min a 37 C, lavar x 3 con 200 μl de solución de lavado TMBsubstrato 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Incubar durante 15 min a 37 C en la oscuridad Solución de 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl parada Lectura fotométrica a 450 nm (ref nm) Procedimiento manual/automático (véase 5.2.) 10018AVPS/

10 6.A CÁLCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION) Leer los valores de DO a 450 nm (longitud de onda de referencia nm). Restar el valor de DO del blanco (pozo A1) a todos los demás valores de DO. El rango de concentración nominal de los controles aparece impreso en las etiquetas de los viales. Criterios de validez El valor de DO del blanco tiene que ser < 0,050. El valor medio de DO del estándar 5 tiene que ser < 0,200. El valor medio de DO del estándar 1 tiene que ser > 1,500. Las concentraciones de los controles tienen que estar dentro de los rangos de las concentraciones nominales (consultar las etiquetas de los viales). Repetir el ensayo si los resultados no cumplen con las especificaciones. Curva de calibración y cuantificación de los resultados Los valores de DO de los estándares se expresan gráficamente en función de las concentraciones. Para la curva de calibración, se recomienda utilizar una curva de tipo Cubic Spline. Las concentraciones de HAMA correspondientes a las DO medias de las muestras, pueden leerse a partir de la curva de calibración. El rango de medida va de 40 a 2000 ng/ml. Las muestras con concentraciones inferiores deben interpretarse como < 40 ng/ml. Las muestras superiores al rango de medida deben interpretarse como > 2000 ng/ml. Estos valores no deben extrapolarse. Estas muestras deben repetirse con una dilución más alta. Si se ha medido una muestra con una dilución superior a 1:10, la concentración leída a partir de la curva de calibración debe multiplicarse por el factor adicional de dilución (p.ej.: dilución en la prueba 1:40, concentración leída = 1500 ng/ml concentración real = 1500 ng/ml x 4 = 6000 ng/ml) AVPS/

11 Ejemplo de curva de calibración: 2,5 OD (450/630 nm) 2,0 1,5 1,0 0,5 0, HAMA conc. [ng/ml] 6.B. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS/LÍMITACIONES DEL MÉTODO El HAMAELISA medac puede utilizarse para medir únicamente la concentración de anticuerpos antiisotípicos. Las concentraciones de HAMA > 40 ng/ml se consideran positivas. Esto puede influir en la eficacia terapéutica de los anticuerpos monoclonales de ratón y la interpretación de los métodos de diagnóstico basados en estos anticuerpos. Para la interpretación individual, se recomienda medir muestras de seguimiento. En algunos casos, no pueden excluirse reacciones falsamente positivas, provocadas por anticuerpos heterofílicos. Los sueros que contienen factores reumatoides pueden presentar niveles elevados de HAMA. Se han medido concentraciones > 40 ng/ml en el 63 % de los 43 sueros estudiados. El 5 % de estos sueros eran > 320 ng/ml. No se han hallado valores de HAMA > 1000 ng/ml en el grupo estudiado. Las concentraciones muy altas de lípidos o de hemoglobina y bilirrubina no influyen en los resultados. La linealidad de dilución se ha establecido sobre la base de muestras seleccionadas (véase el capítulo 7.D.). Cabe señalar que algunas muestras de pacientes muestran una mala linealidad de dilución AVPS/

12 7. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL ENSAYO Las características específicas de la determinación obtenidas durante la evaluación diagnóstica son las siguientes. 7.A. PREVALENCIA Se han medido 101 muestras de donantes de sangre durante la evaluación diagnóstica. 98 muestras fueron negativas (concentración HAMA < 40 ng/ml). 7.B. PRECISIÓN Muestra Variación intraensayo Muestra Variación interensayo DO media SD CV (%) n Media ng/ml SD CV (%) n Est.1 2,460 0,204 8,3 21 C ,6 11 Est.5 0,070 0,008 11,4 21 C ,8 11 C1 1,013 0,053 5,2 21 No ,1 11 C2 2,205 0,121 5,5 21 No ,4 11 No 1 0,128 0,011 8,6 22 No ,8 11 No 3 2,341 0,129 5,5 22 Est. = Estándar ; C= control ; No = muestra 7.C. RECUPERACIÓN Se ha calculado una recuperación media del 99% (SD = 12 %) añadiendo ocho concentraciones de HAMA definidas, cada una a tres sueros diferentes AVPS/

13 7.D. LINEALIDAD DE DILUCIÓN Se ha comprobadola linealidad de dilución utilizando 10 sueros altamente reactivos, que se han probado con 5 diluciones diferentes (diluciones sucesivas de 1:2). Dil. 1 Dil. 2 Dil. 3 Dil. 4 Dil. 5 Media SD CV ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml No % No % No % No % No % No % No % No % No % No % 7.E. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC) El límite de cuantificación es de 40 ng/ml. Esta concentración es significativamente superior al valor cero. INDICACIONES GENERALES No intercambiar los tapones de los viales para evitar contaminaciones cruzadas. Los viales de los reactivos deben cerrarse inmediatamente después de su uso para evitar la evaporación y la contaminación microbiana. Después de su empleo, los reactivos deben conservarse como se indica para garantizar su vida útil. Tras su utilización, conservar todos los componentes del equipo en su embalaje original para evitar que se mezclen reactivos utilizados en otras técnicas de determinación o de otros lotes (véase también 3.). PRECAUCIONES DE EMPLEO Debe aplicarse la normativa local en vigor en materia de seguridad y salud AVPS/

14 Se recomienda firmemente manipular los reactivos de origen animal (véase el contenido del equipo) como sustancias potencialmente infecciosas y utilizarlos con todas las precauciones necesarias. CONSEJOS DE ELIMINACIÓN En general, los residuos de los productos químicos y de las preparaciones se consideran residuos peligrosos. La eliminación de este tipo de residuos está regulada por las leyes y las normativas nacionales y regionales. Contacte con sus autoridades locales o con empresas de gestión de residuos, que le aconsejarán cómo tratar los residuos peligrosos. Fecha de revisión: AVPS/

15 LITERATURA Baum, R.P., et al.: Clinical Course of Ovarian Cancer Patients Under Repeated Stimulation of HAMA Using MAb OC 125 and B HYBRIDOMA 12 (5), (1993) Baum, R.P. et al.: Activating AntiIdiotypic Human AntiMouse Antibodies for Immunotherapy of Ovarian Carcinoma. CANCER 73 (3), (1994) Bock, J.L., J. Forgiuele, B. Wenz: False positive immunometric assays caused by antiimmunoglobulin antibodies: a case report. CLIN. CHIM. ACTA. 147, (1985) Boscato, L.M., G. Egan, M.C. Stuart: Covert cross reactants in a twosite immunoassay studied with monoclonal antibodies. ANAL. BIOCHEM. 146, (1985) Boscato, L.M. and M.C. Stuart: Incidence and specificity of interference in twosite immunoassays. CLIN. CHEM. 32, (1986) Boscato, L.M. and M.C. Stuart: Heterophilic Antibodies: A Problem for all immunoassays. CLIN. CHEM. 34/1, 2733 (1988) CourtenayLuck, N.S., et al.: Development of Primary and Secondary Immune Responses to Mouse Monoclonal Antibodies Used in the Diagnosis and Therapy of Malignant Neoplasms. CANCER RESEARCH 46, (1986) CourtenayLuck, N.S., A.A. Epenetos, C.G. Winearls, M.A. Ritter: Preexisting Human AntiMurine Immunoglobulin Reactivity Due to Polyclonal Rheumatoid Factors. CANCER RESEARCH 47, (1987) Cusick, C.F., K. Mistry, G.M. Addision: Interference in a TwoSite Immunoradiometric Assay for Thyrotropin in a Child. CLIN. CHEM. 31, (1985) Davies, A.G., et al.: Preexisting Antimouse Immunoglobulin in a Patient Receiving 131Imurine Monoclonal Antibody for Radioimmunolocalization. BR. J. CANCER 53, (1986) Hansen, H.J., E. Newman, G. LaFontaine: Human AntiMurine Antibody (HAMA) Can Cause FalsePositive and FalseNegative Carcinoembryonic Antigen (CEA) Assay Results. Presented at the Third International Conference of Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, February 46 (1988) Hertel, A., et al.: Antiidiotypic HAMA Triggered by OC 125 Radioimmunoscintigraphy: Beneficial to the Patient? in R. Klapdor (ed.): Tumor Associated Antigens, Oncogenes, Receptors, Cytokines in Tumor 10018AVPS/

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