Ensayo de inhibición de la germinación y del alargamiento radicular en semillas de cebolla Allium cepa y Soya Glycine max

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1 Ensayos de inhibición de la germinación 285 Ensayo de inhibición de la germinación y del alargamiento radicular en semillas de cebolla Allium cepa y Soya Glycine max Con experiencia Raúl Uribe Hernández Clasificación del ensayo: E Principio de la prueba En los bioensayos de toxicidad aguda con semillas se evalúan los efectos adversos de un compuesto puro o de una mezcla compleja en el proceso de germinación y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como respuesta se determina la inhibición en la germinación y de la elongación de la radícula y del hipocótilo. Es importante destacar que durante la germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir, alterando la supervivencia y desarrollo normal de las plántulas. Una de las etapas más importantes del desarrollo de una planta es la germinación de las semillas y la emergencia del primer cotiledón. En la germinación ocurren cuatro procesos: la imbibición o toma física de agua, la formación 285

2 286 Ensayos para suelos de los sistemas enzimáticos e inicio de la síntesis de proteínas y de RNA, la emergencia de la radícula y la iniciación del crecimiento. La activación de la semilla es inhibida ante la presencia de compuestos tóxicos, afectando la germinación de la misma. La división celular de los meristemos radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o alterando el proceso de alargamiento radicular, por lo que la fitotoxicidad de un compuesto puede ser determinada a través de la medición de éste parámetro. Material Papel filtro Whatman de fibra de vidrio, frascos de vidrio de 250 ml, cajas Petri de 210 mm, papel aluminio, parafilm, micropipetas (10-1,000 µl), pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml, regla o Bernier y probetas de 50 y 100 ml. Equipo Cámara ambiental o incubadora, balanza analítica y campana de extracción. Reactivos Diclorometano grado HPLC (frasco con 4 L), 2-cloroacetamida, hipoclorito de sodio 5% y agua destilada. Organismos de prueba Semillas certificadas de cebolla Allium cepa (monocotiledonea) y de soya Glycine max (dicotiledonea), con viabilidad probada mayor del 95% y libres de plaguicidas. Procedimiento de la prueba Pruebas exploratorias o de tamiz Estas pruebas se realizan con el extracto del suelo contaminado o con una solución del compuesto tóxico, desde una concentración al 100%. Para ello, se seleccionan y escarifican las semillas con hipoclorito de sodio al 5% durante 15 minutos y luego se enjuagan con agua de la llave y con agua destilada durante

3 Ensayos de inhibición de la germinación minutos. Se colocan discos de papel filtro Whatman de fibra de vidrio dentro de la caja Petri de 110 mm. Estos discos deben ser proporcionales al diámetro de la caja (aproximadamente 9 cm). Sobre el papel filtro se adicionan 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto original del compuesto tóxico, en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica), distribuyéndolo de forma homogénea. Como control del disolvente se utiliza una caja a la que se le agregan 2 ml de diclorometano o del disolvente utilizado para la extracción. Además, se utiliza un control positivo de 2-cloroacetamida a una concentración 35 mg/l y un control negativo de agua destilada. Se deja evaporar el disolvente durante 10 minutos dentro de la campana de extracción y luego se colocan 10 semillas por cada caja, distribuyéndolas aleatoriamente y de tal forma que se permita un adecuado crecimiento. Se preparan 3 réplicas por tratamiento. Las semillas se incuban dentro de una cámara ambiental con temperatura controlada (22 ± 2 ºC) y en total oscuridad, hasta que el 65% de las semillas del testigo negativo haya germinado. Después de ese período, se registra el número de semillas germinadas, siguiendo como criterio de germinación una longitud de radícula mayor de 5 mm (figura 18.1). Adicionalmente, se registra el crecimiento o alargamiento de la radícula, como un posible efecto tóxico adicional, por medio de la medición de la longitud al término de la prueba (figura 18.2). Pruebas definitivas Las pruebas definitivas se llevan a cabo utilizando un intervalo de concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que se observe efecto adverso, para insertar entre alguno de ellos este nuevo intervalo de concentraciones (por ejemplo 100, 50, 25, 12.5, 6.25 y 3.125%). Al final se elabora la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un intervalo reducido y se calculan los valores de CI 50 (concentración inhibitoria media), por medio del método Probit. Expresión de resultados La prueba de inhibición de la germinación en plantas superiores determina el potencial de toxicidad agudo en el cultivo, expresado como la concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de los individuos utilizados en la prueba (CI 50 ) y su precisión o intervalo de confianza. Se utiliza el método Probit, también conocido como método de unidades probabilísticas, para evaluar la relación

4 288 Ensayos para suelos Figura Germinación y brote radicular de Glycine max Tabla Condiciones recomendadas para las pruebas de inhibición de la germinación con semillas de Allium cepa y Glycine max Tipo de ensayo Estático Temperatura 22 ± 2 C Calidad de luz Oscuridad Tamaño del recipiente Cajas petri de 110 mm Volumen de la solución de prueba 2.0 ml Edad del cultivo usado como inóculo Semillas certificadas Número de individuos 10 semillas por frasco Número de réplicas 3 Incubación Con 60 % de humedad relativa Medio de cultivo Agua destilada Factor de dilución Según la dilución Duración de la prueba Hasta la germinación de 65% del control Efecto medido Inhibición de la germinación (< 5 mm de radícula) Resultado final CI 50 Criterios para la aceptación de la prueba Germinación en el testigo > 90 % Control positivo 2- Cloroacetamida a 35 mg/l USEPA, 1996; OECD; 1984; ISO, 1993.

5 Ensayos de inhibición de la germinación 289 Figura Medición del crecimiento del sistema radicular de Glycine max de dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo. Se asigna el valor Probit de tablas a los porcentajes de mortalidad obtenido para cada concentración (Loomis, 1978), para posteriormente efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método de mínimos cuadrados, y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta se calcula la CI 50, considerando el valor de la y a la mitad del número de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Finalmente, se calcula el intervalo de confianza del 95% por medio de la desviación estándar y el valor de tablas del estadístico t de student. Bibliografía International Organization for Standarization (ISO) Soil Quality- Determination of the effects of Pollutants on Soil Flora. Part 1. Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. 9 pp. Loomis, TA, Fundamentos de Toxicología. 1era edición. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 274 pp. Organization of Economical Co-operation and Development (OECD) Terrestrial Plants, Growth test. Guideline for Testing of Chemicals 208l. 15 pp. United States Environmental Protection Agency (USEPA) USEPA 712-C OPPTS pp.

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