Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las Enfermedades Infecciosas empleadas en la práctica clínica (I)

Transcripción

1 Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las Enfermedades Infecciosas empleadas en la práctica clínica (I) Dr. Juan Carlos Rodríguez Díaz S. Microbiología Hospital General Universitario de Elche

2 Diagnóstico microbiológico Pretende detectar e identificar el o los microorganismos responsables del proceso infeccioso y eso es esencial para: Correcto tratamiento del paciente Control de la difusión del patógeno

3 Diagnóstico microbiológico Métodos directos: Detectan al microorganismo de la muestra clínica obtenida del lugar de la infección: Examen microscópico Cultivo Detección de antígenos Detección de ácidos nucléicos Métodos indirectos: Permiten detectar la presencia de anticuerpos frente al microorganismo en el suero del paciente No se aplican simultanéamente sino en función del microorganismo

4 Toma de muestras La toma de muestras se detallará en un seminario monográfico Puedes acceder al manual de toma de muestras en el enlace:

5 Diagnóstico de bacterias: Examen microscópico La muestra clínica se deposita en un portaobjetos Puede visualizarse: Sin teñir (en fresco) Tras un proceso de tinción Gram: Divide a las bacterias en: Gram positivos: Color violeta (Staphylococcus) Gram negativos: Color rojo (Escherichia coli) Ziehl Neelsen: Divide a las bacterias en Acido-alcohol resistentes: Color rosa (Mycobacterium tuberculosis)

6 Examen microscópico en fresco Trichomonas vaginalis Candida albicans

7 Examen microscópico: tinciones Gram positivo Gram negativo Ziehl Neelsen positivo

8 Diagnóstico de bacterias: cultivo Siembra de la muestra en unos medios de cultivo con los nutrientes necesarios para que se produzca la proliferación bacteriana. Sus principales utilidades son: Más sensibilidad que la tinción Permite identificar a los microorganismos Permite estudiar su sensibilidad antibiótica Permite estudiar la epidemiología de la infección y el control de posibles brotes

9 Características del cultivo Se utilizan diferentes tipos de medios: Medios básicos: Agar Mueller Hinton Medios enriquecidos: AgarSangre: Streptococcus pneumoniae AgarChocolate(Hemina y NAD) : Haemophilus BCYEα (L-cisteina): Legionella Medios selectivos: Medio Thayer Martin: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae Mac Conkey: Bacterias Gram negativas TCBS: Vibrio cholerae Medios diferenciales o cromógenos: CHROMAgar Medios de enriquecimiento: Caldo selenito

10 Tipos de medios de cultivo Agar sangre TCBS Agar chocolate Hemocultivos

11 Procesamiento de los cultivos Temperatura de incubación: Habitualmente se incuba a 35-37ºC Campylobacter en heces: 42ºC Tiempo de incubación El tiempo habitual es h Hay bacterias de crecimiento lento: Brucella Atmósferas de incubación Bacterias aerobias o anaerobias facultativas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Bacterias anaerobias: Clostridium, Bacteroides Bacterias microaerófilas: Campylobacter, Helicobacter Necesitan 5-10% CO 2: Neisseria gonorroheae

12 Incubación de los medios Incubador de hemocultivos

13 Atmósfera de incubación

14 Identificación bacteriana Definición: Se basa en el estudio de la actividad bioquímica, sensibilidad a determinadas sustancias y crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno Métodos: Pruebas bioquímicas clásicas Pruebas en microplaca

15 Identificación bacteriana

16 Detección de antígenos Definición: Permite demostrar la presencia de un microorganismo en una muestra clínica a través de la detección de sus antígenos específicos Patógenos en los que se utiliza: Legionella Streptococcus pneumoniae Aspergillus Cryptococcus

17 Detección de antígenos Definición: Se basa en la detección mediante métodos inmunológicos (reacción antígeno-anticuerpo) de algunas sustancias segregadas por el patógeno Patógenos en los que se utiliza: Legionella Streptococcus pneumoniae Aspergillus Cryptococcus

18 Secuenciación del gen 16S rrna e ITS Definición: Estos dos genes están presentes en todas las bacterias (16S rrna) y hongos (ITS) pero su secuencia es diferente en función de la especie Procedimiento: Secuenciación de estos genes y comparación con bases de datos internacionales (Gen Bank u otros) Útil para identificar microorganismos con identificación clásica compleja

19 Secuenciación del gen 16S rrna e ITS

20 Espectrometría de masas (malditof) Definición: Estudia el perfil proteico del microorganismo (proteoma) mediante la comparación del perfil con una base de datos de los microrganismos más frecuentemente aislados Un rayo laser ioniza las proteinas cristalizadas y son aceleradas por un campo electromagnético. Las proteinas se separan en función del tamaño y la carga Utilidad: Identificación rápida de los microorganismos más habituales

21 Espectrometría de masas (malditof)

22 Diagnóstico de la infección urinaria Definición: Presencia de microoorganismos en orina Cistitis: infección de vías bajas Pielonefritis: Infección de vías altas Etiología más frecuente Bacterias de la flora intestinal: Escherichia coli Proteus Klebsiella Enterococcus

23 Diagnóstico de la infección Muestras: urinaria Muestra: Frasco estéril con orina recién recogida o mantenida a 4ºC Adultos: Segunda parte de la micción tras limpieza de los genitales externos Pacientes sondados: Pinchar la sonda con jeringa en el lugar establecido para ello Niños pequeños: Bolsa colectora que debe retirarse cada 30 minutos

24 Diagnóstico de la infección urinaria Métodos diagnósticos: Sedimento urinario: Es de gran valor para valorar la calidad de la muestra y la presencia de leucocitos Leucocitos sin bacterias (Cultivo negativo) En tratamiento antibiótico Uretritis por Chlamydia o Micoplasma que no se diagnostican por los métodos habituales Tuberculosis renal

25 Diagnóstico de la infección Métodos diagnósticos: urinaria Sistemas de cribado rápido: Tiras reactivas Detección de nitratasa bacteriana Detección de esterasa leucocitaria Recuento de lecucocitos y bacterias por citometría de flujo de forma automatizada

26 Diagnóstico de la infección Métodos diagnósticos: urinaria Cultivo: Se inocula de forma cuantitativa la orina en una serie de medios de cultivo: Agar sangre: Medio enriquecido para el aislamiento de los patógenos más frecuentes Agar CLED y Agar Mac Conkey: Medio diferencial que ayuda a la identificación preliminar

27 Diagnóstico de la infección urinaria Interpretación del recuento en el cultivo: Debe hacerse en función de: Forma de recogida de la muestra Clínica del paciente Presencia de piuria Microorganismo aislado En muestras tras punción suprapúbica o directamente del riñón: Cualquier recuento es significativo Sondaje vesical: 10 3 bacterias/mililitro Bacteriuria con piuria: 10 3 bacterias/mililitro Bacteriuria asintomática: 10 5 bacterias/mililitro

28 Diagnóstico de la infección urinaria Medios de cultivo

29 Diagnóstico de la infección Sedimento urinario urinaria Tiras reactivas Citometría de flujo

30 Diagnóstico de la neumonía bacteriana Definición: Infección del parénquima pulmonar Tienen etiología muy variada en función de la edad, del estado inmunológicos y de otros factores En personas previamente sanas es frecuente: Streptococcus pneumoniae Micoplasma pneumoniae En personas con factores predisponentes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterobacterias

31 Diagnóstico de la neumonía bacteriana

32 Diagnóstico de la neumonía bacteriana

33 Diagnóstico de la neumonía bacteriana Cultivo: Muestra de esputo de buena calidad (Tinción de Gram con presencia de leucocitos) o muestras invasivas (BAS, BAL, cepillado bronquial) Cultivo en: Agar sangre. Aislamiento de Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis Agar Mac Conkey: Enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter Agar chocolate:haemophilus influenzae Medio BCYEα: Legionella pneumophila. BAL y Cepillado bronquial se hace cultivo cuantitativo en Agar chocolate

34 Diagnóstico de la neumonía Detección de antígenos: Muestra a procesar: Muestras respiratorias: Virus respiratorio sincitial Gripe A, gripe B Pneumocystis carinii Aspergillus Orina: Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila

35 Diagnóstico de la neumonía Detección de anticuerpos: Muestra a procesar: Suero del paciente Estudios a realizar: Detección de IgM Estudio de seroconversión: Incremento de la cantidad de anticuerpos al estudiar dos sueros del enfermo separados 3-4 semanas De positivo bajo a positivo alto De negativo a positivo alto Microorganismos: Micoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetti, Chlamydophila pneumoniae

36 Diagnóstico de la neumonía Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Muestra a procesar: Muestras respiratorias Estudios a realizar: Detección del genoma del microorganismo en la muestra Microorganismos: Hay sistemas de PCR múltiple que detectan muchos patógenos Mycobacterium tuberculosis Gripe Citomegalovirus

37 Diagnóstico de la neumonía bacteriana Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae

38 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central Procesos más frecuentes: Meningitis/encefalitis Abscesos cerebrales La etiología de las meningitis/encefalitis puede ser muy variada: Bacterias: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae Virus: Enterovirus, virus herpes 1 y 2, arbovirus Hongos: Cryptococcus neoformans Parásitos: Amebas de vida libre

39 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

40 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

41 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central Diagnóstico de las infecciones bacterianas: Tinción de Gram del LCR: Método rápido y orientativo de la etiología Cultivo del LCR: Confirmación de la tinción y estudio de la sensibilidad antibiótica Agar sangre, chocolate y Thayer Martin Detección de antígenos en el LCR: Streptococcus pneumoniae Reacción en cadena de la polimerasa: S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis HEMOCULTIVO

42 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central Diagnóstico de las infecciones viricas: Los cultivos celulares son técnicas complicadas y lentas Reacción en cadena de la polimerasa: Enterovirus Herpes 1 y 2 Varicella Virus JC Arbovirus

43 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central Diagnóstico de las infecciones fúngicas: La etiología más frecuente es Criptococcus neoformans Procedimiento diagnóstico: Cultivo en agar saboureaud Detección de antígeno en LCR y sangre: Criptolatex Diagnóstico de las infecciones parasitarias: Toxoplasma: Detección del genoma por PCR Amebas de vida libre: Tinción Cultivo PCR

44 Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central Diagnóstico serológico: La búsqueda de anticuerpos en LCR es una técnica útil en algunos casos Neurobrucelosis: Rosa de bengala y aglutinación Neurosífilis: VDRL Sarampión: Presencia de Ac de producción intratecal Es imprescindible analizar los resultados con un estudio de los mismos marcadores en suero para: Confirmar la infección por el patógeno Confirmar la integridad de la barrera hematoencefálica mediante el estudio del cociente entre la albúmina o la IgG entre suero y líquido

45 Diagnóstico de la meningitis bacteriana Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Listeria monocytogenes

46 Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital Patógenos más importantes:

47 Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital Patógenos más importantes:

48 Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital Diagnóstico de Treponema pallidum (sífilis) Sífilis primaria: Observación del Treponema pallidum (chancro):ifd,tinción con plata,campo oscuro Diagnóstico serológico: Pruebas no treponémicas: RPR y VDRL Pruebas treponómicas: TPHA (aglutinación), FTA (inmunofluorescencia), ELISA IgG e IgM Criterios: Todos los resultados positivos de pruebas no treponémicas deben ser confirmados por pruebas treponémicas En caso de sospecha de sífilis primaria o terciaria, hay que hacer siempre una prueba treponémica

49 Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital Diagnóstico de Neisseria gonorrhoeae (gonorrea) Cultivo en agar Thayer Martin Tinción de Gram: en el hombre la presencia de diplococos gramnegativos es diagnostica (95%) Exige transporte rápido al laboratorio e incubación en atmósfera con CO 2 Detección de genoma del microorganismo por PCR Diagnóstico de Chlamydia trachomatis (uretritis no gonocócica) Sólo puede cultivarse en cultivos celulares y no se hace habitualmente Detección de genoma del microorganismo por PCR

50 Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital Diagnóstico del protozoo Trichomonas vaginalis Cultivo en medio Roiron Visualización en fresco de la muestra recién extraída: Observación de la motilidad del parásito Exige transporte rápido al laboratorio Diagnóstico del virus herpes genital Detección de genoma del microorganismo por PCR Habitualmente la etiología se asocia a herpes 2 Diagnóstico del papilomavirus Detección de genoma del microorganismo por PCR Genotipificación ya que hay genotipos con diferente patogenicidad: verrugas genitales o promotores de procesos cancerosos

51 Diagnóstico de las enteritis Etiología más frecuente

52 Diagnóstico de las enteritis Etiología más frecuente

53 Diagnóstico de las enteritis bacterianas Salmonella Cultivo en medio SS y enriquecimiento en caldo selenito Identificación fenotípica y serotipificación: Múltiples serotipos Campylobacter Cultivo en medios especificos (Skirrow): Incuba a 42ºC en atmósfera microaerófila Shigella. Cultivo en medios específicos (Mc Conkey y SS) Yersinia: Cultivo en medios específicos (CIN) Escherichia coli enteropatógenos: Detección del genoma de los serotipos patógenos por PCR Vibrio cholerae (TCBS y enriquecimiento)

54 Diagnóstico de las enteritis bacterianas Clostridium difficile Cultivo en medio anaerobio: Sólo se realiza en centros de referencia debido a su complejidad Detección de Antígenos del patógeno Detección de las toxinas producidas por el mismo Detección del genoma del microorganismo por PCR Otros microorganismos productores de toxinas: El diagnóstico se realiza detectando la toxina preformada por métodos serológicos Staphylococcus aureus Bacillus cereus Clostridium perfringens Clostridium botulinum

55 Diagnóstico de las enteritis viricas Virus gastrointestinales Rotavirus Adenovirus Norovirus Astrovirus Diagnóstico Microscopía electrónica: Técnica poco usada por su complejidad Detección de antígenos Detección del genoma viral por PCR

56 Diagnóstico de las enteritis parasitarias Protozoos Giardia Entamoeba histolytica Cryptosporidium Helmintos: Ascaris, Taenia, Enterobius vermicularis Diagnóstico Microscopía tras proceso de concentración de las heces Necesidad de procesar un mínimo de tres muestras Tinciones especiales: Cryptosporidium Detección del genoma por PCR: Entamoeba Técnica de Graham: Enterobius vermicularis (oxiuros)

57 Protozoos: flagelados

58 Protozoos flagelados: Amebas

59 Protozoos ciliados

60 Protozoos: Apicomplexa Cryptosporidium spp Isospora belli

61 Protozoos: Microspora Enterocytozoon spp

62 Platelmintos: cestodos

63 Platelmintos: tremátodos

64 Nemátodos Trichuris trichiura

65 Nemátodos

66 Nematodos Strongyloides stercoralis

67 Diagnóstico de bacteriemia Presencia de bacterias en sangre de forma persistente Antes del tratamiento antimicrobiano se inoculan, con sangre del paciente sin anticuagulante 2 o 3 parejas de botellas de hemocultivos (aerobias y anaerobias) Es muy importante descontaminar la piel ante de las extracciones de sangre para prevenir la contaminación de los frascos con flora bacteriana de la piel Los hemocultivos se incuban a 37ºC en sistemas automáticos que detectan crecimiento microbiano. En caso de positividad : Tinción Gram (cuyo resultado se informa de inmediato ) y subcultivo a medios sólidos.

68 Diagnóstico de bacteriemia

69 Infecciones por microorganismos anaerobios Se asocian a las siguientes infecciones: Gangrenas Peritonitis y otras infecciones intraabdominales Neumonías por aspiración Abscesos Bacteriemias Abscesos cerebrales

70 Infecciones por microorganismos anaerobios Los microorganismos se mueren en contacto con el oxígeno, por lo tanto: El cultivo debe hacerse lo más rápidamente posible, si no es posible, hay que inocular las muestras en medios de transporte Se requieren medios de cultivo específicos e incubación en atmósfera sin oxígeno Las torundas no son aceptables, es imprescindible que las muestras se tomen con jeringa o mediante biopsia Los géneros más importantes son: Clostridium Bacteroides Prevotella Fusobacterium

71 Cultivo de microorganismos anaerobios Están presentes en la flora normal de la piel o mucosas de las personas sanas por tanto no tienen interés clínico si se aíslan de estas localizaciones: Esputos Exudados vaginales Heces Piel

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73 Infecciones sistémicas por hongos filamentosos Los hongos más frecuentemente implicados son: Aspergillus Mucor Fusarium Diagnóstico: Cultivo de las muestras: Poca sensibilidad y especificidad. Necesidad de confirmación en varias muestras y con datos clínicos Detección de antígenos de Aspergillus: galactomanano

74 Infecciones por Candida C. albicans es la más patógena. Otras especies implicadas son: C. parasilopsis C. tropicalis C. krusei Produce: Infección de piel y mucosas Candidiasis sistémica en inmunodeprimidos

75 Infecciones por Candida En caso de sospecha de infección sistémica: hemocultivos En otras infecciones: Tinción de Gram como método rápido Cultivo de las lesiones en medio de Saboureaud. Crecen en 1-2 días. Pueden crecer en agar sangre o agar chocolate Identificación de la especie por métodos fenotípicos o genotípicos

76 Candida spp.

77 Candida spp.

78 Candida spp.

79 Candida spp.

80 Candida spp.

81 Infecciones por dermatofitos Llamadas comunmente tiñas: Tinea corporis Tinea crucis Tinea barbae Onicomicosis Pie de atleta Trichophyton, Microsporum, Epidermophytum Se adquieren a partir de personas enfermas, de animales domésticos o a partir del suelo

82 Infecciones por dermatofitos Diagnóstico rápido: Prueba del KOH (visualización directa de las lesiones) Cultivo en medio de Saboureaud y micosel (Saboureaud y actidiona) durante 30 días a 30/37ºC Identificación del hongo aislado en cultivo mediante tinción de azul de lactofenol y algunas pruebas bioquímicas (urea)

83 Dermatofitos

84 Dermatofitos

85 Dermatofitos

86 Dermatofitos

87 Dermatofitos

88 Otras infecciones por hongos Pitiriasis versicolor (Malassezia furfur) Diagnóstico clínico Esporotricosis (Sporothrix) Por infección de heridas con esporas presentes en el suelo o en vegetales Hongo dimórfico: Cultivo en saboureaud y BHI durante 30 días a 30/37ºC respectivamente Identificación mediante microscopía y demostración de dimorfismo(levadura, hongo filamentoso)

89 Sporothrix

90 Sporothrix

91 Infecciones por Leishmania Leishmaniasis visceral: Kala azar Muestra a procesar. Médula osea Lesiones cutaneas o mucocutáneas (Botón de oriente, uta, espundia, etc) Muestra a procesar: Aspirado o biopsia de la lesión Asociado muchas especies del género, en función de la zona geográfica y de la clínica: L. infantum, L. donovani, L. peruviana, L. amazonensis, etc. Diagnóstico por: Visualización del parásito en las lesiones por tinción de Giemsa Cultivo en medio NNN PCR. Serología (útil en L. visceral)

92 Leishmania

93 Leishmania

94 Leishmania

95 Leishmania

96 Leishmania

97 Phebotomus y Lutzomya

98 Infecciones por Plasmodium Produce la malaria o el paludismo Enfermedad muy frecuente en el trópico Necesidad de diagnóstico rápido No crece en los medios para bacterias: hemocultivos Métodos específicos: Visualización del parásito en tinción de Giemsa de los hematies de la sangre periférica Detección de antígeno Detección del genoma del protozoo por PCR

99 Infecciones por Plasmodium

100 Infecciones por Toxoplasma Se asocia Inmunocompetentes: Generalmente asintomático o fiebre con adenopatías Gestante: Infección congénita HIV: Cuadro neurológico por reactivación de quistes cerebrales Diagnóstico: Inmunocompetentes: Estudios serológicos (IgM, seroconversión y avidez de la IgG) Gestantes: Serología de la madre y PCR en líquido amniótico Inmunodeprimidos: Detección del genoma por PCR

101 Infecciones por Toxoplasma

102 Infecciones por Schistosoma 2º enfermedad tropical más prevalente (después del paludismo) Se transmite por la entrada de larvas a través de la piel cuando se introduce en agua Diagnóstico: Visualización de los huevos en la orina o en las heces del paciente