Biología Combinatoria para el desarrollo de fármacos

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1 Biología Combinatoria para el desarrollo de fármacos NELSON SANTIAGO VISPO Prometeo SENESCYT, MIPRO zona 1. Docente YachayTech 1

2 Búsqueda de nuevas moléculas biológicamente activas. Diversidad Bibliotecas Químicas Biológicas Virtuales Panning for gold: sourcing pharmaceutical innovation Genómica Proteómica 2

3 Biología Combinatoria : Exposición de proteínas y péptidos sobre la cápsida de los fagos filamentosos (Phage display Technology) FAGOS FILAMENTOSOS Representación esquemática de la estructura de los bacteriófagos filamentosos con las proteínas que conforman su cápsida. 3

4 Impacto científico, médico y comercial Phage display Technology Número de artículos encontrados en la base PubMed con las palabras clave phage display pubmed - phage display count Compañías dedicadas a la explotación de bibliotecas sobre fagos filamentosos er anticuerpo totalmente humano derivado de una biblioteca sobre fagos aprobado como medicamento (2002) anti-tnf para artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias 4

5 Bibliotecas combinatorias de péptidos y proteínas sobre fagos filamentosos Grandes colecciones de genes (Bibliotecas) Tallas entre 10 5 y Grandes colecciones de péptidos y proteínas presentadas sobre fagos filamentosos Aislamiento de nuevos genes a partir de la separación de los fagos con capacidad de unión a un blanco 5

6 Presentación de proteínas foráneas sobre fagos filamentosos Incorporación de la proteína codificada a la superficie de la partícula viral Los bacteriófagos se convierten en paquetes de ADN y proteína, útiles para la ingeniería genética y la caracterización de las proteínas resultantes. Introducción de un gen foráneo al material genético del virus 6

7 Presentación de proteínas foráneas a través de la manipulación del genoma viral Complejidad de la manipulación del genoma viral Infección de bacterias Limitación en el tamaño de las proteínas que pueden presentarse sin afectar la integridad estructural del virus (6-9 aa sobre P8) 7

8 Diversidad de los sistemas de presentación sobre fagos Posibilidad de presentar péptidos y proteínas de gran tamaño y complejidad Presentación sobre varias proteínas virales (P8, P3, P7, P9) vs. Presentación monovalente/ multivalente Presentación de péptidos, fragmentos de anticuerpo, receptores, ligandos, enzimas... 8

9 Selección de fagos filamentosos a partir de las bibliotecas Biopaning 9

10 Moléculas blancos La TEPF permite seleccionar un péptido o proteína a partir de una biblioteca empleando:.una proteína.un anticuerpo monoclonal (AcM).un suero policlonal.un receptor.líneas celulares.moléculas de origen lipídico o azúcares.tejidos y tumores.organismos vivos 10

11 11

12 12

13 13

14 Usos de la tecnologia (Phage display Technology) Localización de epítopos lineales Fagotopos que imitan epítopos no peptídicos Selección de fagotopos específicos de una patología. Fagotopos como inmunógeno. Exposición de proteínas foráneas en piii. Aumento de la afinidad de la interacción entre la proteína y la molécula blanco Incremento de la estabilidad (ej. A la temperatura, Ácidos, Proteasas) Blancos. Adicionados para la fácil purificación de proteínas y como ayuda en el desarrollo de ensayos diagnósticos. 14

15 Bibliotecas de péptidos pequeños Colecciones de péptidos lineales Colecciones de péptidos cíclicos X X X X X X X X X C C -XXXXXXXXXXXX- Colecciones de péptidos insertados en un esqueleto proteico Identificación de epitopos o mimotopos reconocidos por un anticuerpo o por sueros de individuos inmunizados Estudio de las interacciones proteicas Desarrollo de agonistas, antagonistas, inhibidores y otras moléculas biológicamente activas de naturaleza peptídica 15

16 Identificación de epitopos epítopo conformacional epítopo lineal 16

17 Heberbiovac HB Composición Heberbiovac HB, contiene una preparación de la proteína antigénica de superficie del virus de la hepatitis B (VHB). Esta proteína es obtenida mediante procedimientos de recombinación del ADN. Indicacciones Para la inmunización activa contra la infección por el VHB y la prevención de sus consecuencias potenciales, como las hepatitis agudas y crónicas, la cirrosis hepática y el hepatocarcinoma primario. Inmunización contra el virus de la hepatitis D. 17

18 Heberbiovac HB ACM CB-HEP.1 Columna de Inmunoafinidad 18

19 A 492 nm Heberbiovac HB mab.cb-hep1. 1 Syntetic peptides: D TGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPT 143 D TGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCC 139 D TGPCKTCTTPAQGNSMFPSC 137 D CKTCTTPAQGNSMFPSCCC 139 D CKTCTTPAQGNSMFPSC 137 D CTTPAQGNSMFPSC 137 0,75 0,5 0,25 0 D4-13 D12-2 D12-3 D12-4 D12-6 D12-9 Using a phage display peptide library of 9 aa. CB-Hep.1 AcM N.R. HBsAg FPGSSTTSTGP C K T C T T P AQGTSM Clon5H C K T C H R P I Q Clon16H G C R T C S Y P Q Clon5Ha S Q K T R S P P Q Clon4H Y K T R P P K L G Clon15H G F K T K G R P T Secuencia peptídica del determinante a del antígeno de la hepatitis B. Las secuencias de los clones obtenidos se encuentran alineadas con la secuencia correspondiente en el antígeno. Los residuos en bold corresponden con los presentes en el antígeno original. 19

20 Heberbiovac HB Tomado de Folgori A. (1994) EMBO-J

21 Heberbiovac HB 21

22 Number of cases Heberbiovac HB Children < Children< Combinatoria Molecular. N Santiago Vispo. Elfos Scientiae

23 Mab IOR-R3 (anti EGF Receptor) 23

24 Mab IOR-R3 (anti EGF Receptor) Receptor de EGF VKEITGFLLIQAWPE E17-2 AAPRGFLLR AAPRGFLLR AAPRGFLLR AGYIRVLLG AGQLQVRHP QGQLQVRHP QDRGERLAG QDGGIEATE 24

25 Mab IOR-R3 (anti EGF Receptor) Tratamiento de tumores de cabeza y cuello en estadíos avanzados en combinación con radioterapia y/o quimioterapia. Tratamiento de astrocitoma de alto grado de malignidad como monoterapia en niños refractarios a tratamiento oncoespecífico y de glioblastoma multiforme en combinación con radioterapia en pacientes adultos. También indicado en pacientes portadores de tumores malignos de esófago de origen epitelial no operables en combinación con radioquimioterapia. CIMAher (nimotuzumab), anticuerpo monoclonal humanizado anti receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) 25

26 Heberprot P (Epidermal Growth Factor) 26

27 27

28 Heberprot P (Epidermal Growth Factor) epítopo lineal epítopo conformacional 28

29 Heberprot P (Epidermal Growth Factor) 29

30 mab CB-EGF1 contra filtro 4. SECPLSHDGY 5. ECPLSHDGYC 6. CPLSHDGYCL 7. PLSHDGYCLH 8. LSHDGYCLHD

31 mab CB-EGF1 K28 mab CB-EGF2

32 Vacuna terapéutica Vaxira (racotumomab) 1E10 mab (Ab2) Vacuna terapéutica Vaxira (racotumomab), formulada con un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que mimetiza gangliosidos N- glicolados, para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). 32

33 P3 is a murine IgM monoclonal antibody (mab) which specifically recognizes N-glycolyl neuraminic acid (NeuGc)-containing gangliosides and sulfated glycolipids P3 (IgM-) 1E10 mab (Ab2) P3 mab induced an IgG anti-idiotypic (Ab2) anti-anti-idiotypic (Ab3) antibodies elicited in syngeneic mice by most Ab2 mabs specific to P3 shared Ab1 idiotopes, but they had different antigenic specificities (Id+ Ag ; 33

34 Vacuna terapéutica Vaxira (racotumomab) 1E10 mab (Ab2) 34

35 Vacuna terapéutica Vaxira (racotumomab) 1E10 mab (Ab2) Vacuna terapéutica Vaxira (racotumomab), formulada con un anticuerpo monoclonal antiidiotipo que mimetiza gangliosidos N-glicolados, para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). A monoclonal antibody against NeuGc-containing gangliosides contains a regulatory idiotope involved in the interaction with B and T cells. Perez A, Mier ES, Vispo NS, Vazquez AM, Perez Rodríguez R. Mol Immunol Sep;39(1-2): Gangliosides, Ab1 and Ab2 antibodies I. Towards a molecular dissection of an idiotype-anti-idiotype system. López-Requena A 1, De Acosta CM, Moreno E, González M, Puchades Y, Talavera A, Vispo NS, Vázquez AM, Pérez R. Mol Immunol Jan;44(4): Epub 2006 Apr 3. 35

36 Interleukin 2 36

37 Interleukin 2 Two monoclonal antobodies anti Interleukin-2 epítopo conformacional mab CB-IL IL-2 (70-83) L N L A Q S K N F H L R P R Clon 1.38 L P L - - S E - L L F R - - Clon 1.13 L P L - - S E - L L F A - - Clon S L - - S P Q L - F - P R Clon S L - - S A R L - F - P R Clon L - T S R - L - F S P - Clon L - E N R - L - F R A R Clon 1.4 R - L - E S R - L - F R A - mab CB-IL IL-2 ( ) S E T T F M Clon 2.20 T T F M SQSTG Clon 2.15 T T F M VIGGA Clon 2.1 T T F M LHSKV Clon 2.7 T Q F M SETSP epítopo lineal Characterization of epitopes on human interleukin-2 using phage displayed-peptide libraries: insights into antibody-peptide 37 interactions. Vispo NS, Araña MJ, Chinea G, Ojalvo AG, Cesareni G. Hybridoma Jun;18(3):251-5.

38 Interleukin-2 Displaying human interleukin-2 on the surface of bacteriophage. Vispo NS, Callejo M, Ojalvo AG, Santos A, Chinea G, 38 Gavilondo JV, Araña MJ. Immunotechnology Oct;3(3):

39 Interleukin 2 Molecular dissection of the interactions of an antitumor interleukin-2-derived mutein on a phage display-based platform. Rojas G, Carmenate T, Leon K. 39 J Mol Recognit Apr;28(4): doi: /jmr Epub 2015 Feb 16.

40 40

41 41

42 HPV-16 E7 oncoprotein ( 28 LNDS 31 S 32 EEEDEI 38 ) IGB-300: péptido inhibidor de la fosforilación mediada por CK2 Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide that impairs the phosphorylation by the protein kinase 2 (casein kinase 2) Cancer Res. 2004;64(19):

43 HPV-16 E7 oncoprotein ( 28 LNDS 31 S 32 EEEDEI 38 ) CIGB-300: péptido inhibidor de la fosforilación mediada por CK HPV-16 E7 oncoprotein ( 28 LNDS 31 S 32 EEEDEI 38 GRKKRRQRRRPPQ --CWMSPRHLGTC Péptido penetrador Tat casein kinase 2 CK2 GRKKRRQRRRPPQ --( 28 LNDA 31 A 32 EEEDEI 38 ) Péptido penetrador Tat proteína oncogénica E7 del virus del 43 papiloma humano (VPH)

44 HPV-16 E7 oncoprotein ( 28 LNDS 31 S 32 EEEDEI 38 ) as target. A random 9-mer cyclic peptide phage library (8) was used for the screening. Barbosa MS, Edmonds C, Fisher C, Schiller JT, Lowy DR, Vousden KH. The región of the HPV E7 oncoprotein homologous to adenovirus E1a and SV40 large T antigen contains separate domains for Rb binding and casein kinase II phosphorylation. EMBO J 1990;9:

45 CIGB-300 decreases the viability and proliferation of CLL cell lines(a) CLL cell lines were incubated with increasing concentrations of CIGB-300 and IC50 was determined for each cell line at 72h with an AlamarBlue assay. (B-C) MO1043 cells were cultured for 48h with the indicated CIGB-300 concentrations. Viability (B) and percentage of cells in S-phase (C) were assessed by FACS after annexin V/7-AAD staining and analysis of BrdU incorporation, respectively. Results indicate mean ± SD and are representative of 3 experiments analyzed. 45

46 a First-in-Human trial using CIGB-300 intralesional injections in patients with highgrade squamous intraepithelial lesions demonstrated to be safe and tolerable (Solares et al, 2009). In that study, 90% of the patients experienced a significant colposcopic response, 19% experienced full histological regression and human papillomavirus DNA was negative in 48% of the previously positive patients. Remarkably, a successful antitumour response was observed in a chemoradio refractory patient diagnosed with germinoma who experienced significant tumour shrinking with a sustained improvement of his quality of life after intratumour injection of CIGB-300 (Perea et al, 2011). Finally, a phase 1 trial in patients with cervical cancer FIGO stages IB2/II using 2 ml-intralesional injections of CIGB-300 in a single site on tumours indicated a plateau in terms of tumour uptake between doses of 35 and 70 mg of the peptide (Soriano-Garcı a et al, 2013). In conclusion, this clinical trial provides a safe and feasible protocol for the intralesional administration of CIGB-300 where 70 mg is the dose with better risk benefit balance alone and in combination with chemoradiotherapy. The favourable toxicity profile along with the efficacy signs could support further phase 2 3 clinical trials in high-risk cervical cancer, particularly in stage IIB IVA patients with positive nodes and/or those with poor tolerance/response to radiotherapy. 46

47 Biología Combinatoria : Exposición de proteínas y péptidos sobre la cápsida de los fagos filamentosos (Phage display Technology) es una excelente plataforma para el desarrollo de fármacos. NELSON SANTIAGO VISPO Prometeo SENESCYT, MIPRO zona 1. Docente YachayTech 47

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